Beyin Metastazının Modellenmesi: Metastatik Kolonizasyon ve Histolojik Büyüme Kalıplarının Stereotaktik İntrakortikal Enjeksiyonla Standartlaştırılmış Analizi

Özet

Stereotaktik intrakranial enjeksiyon tekniği, tümör hücrelerinin fare korteksine hassas ve lokal bir şekilde yerleştirilmesini sağlar ve böylece beynin metastatik kolonizasyonunu incelemek için güçlü bir model olur.

Özet

Beyin metastazları, ileri katı tümörlerin yaygın ve yıkıcı komplikasyonudur; genellikle kötü prognoz, nörolojik gerileme ve düşükte yaşam kalitesiyle ilişkilidir. Merkezi sinir sistemi (CNS) yetmezliği ve nörolojik ölüm vakaları hızla artıyor, ancak beyin metastazının son evrelerini yönlendiren ikincil yayılma, yeniden kolonizasyon ve histolojik büyüme deseninin (HGP) potansiyel bir taşıyıcı parametre olarak katkısı gibi mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır.

Standartlaştırılmış stereotaktik intrakortikal enjeksiyon modeli, tümör hücrelerinin veya stromal veya bağışıklık bileşenleri dahil karışık popülasyonların doğrudan fare beyin korteksine hassas ve tekrarlanabilir implantasyonunu sağlar. Bu protokol ayrıca, metastik büyüme, HGP'ye özgü büyüme dinamikleri ve nörolojik başarısızlığa katkıda bulunan patofizyolojik mekanizmalar gibi CNS kolonizasyonunun temel yönlerini araştırmak için sağlam bir platform sunan preklinik bir doku arşivinin oluşturulmasını destekler. Ayrıca, bu model, tekrarlanabilir klinik olarak ilgili bir bağlamda farmakolojik testleri destekler.

Erken metastatik adımların incelenmesi için optimize edilmiş ancak değişken ve çoğu zaman düşük beyin kolonizasyon oranlarına yol açan sistemik enjeksiyon yöntemlerinin (örneğin, kuyruk veneri veya intrakardiyak) aksine, stereotaktik model tutarlı, beyne özgü metastatik büyümeyi sağlar ve CNS metastazının geç evrelerinin araştırılmasını sağlar. Organoid veya beyin dilim kültürleri gibi ex vivo sistemlerle karşılaştırıldığında, in vivo stereotaktik model vaskülerleşmeyi, sistemik sinyalleri ve beynin bağışıklık sisteminin tam karmaşıklığını koruyarak tümör ilerlemesi ve terapötik yanıt üzerine uzun vadeli çalışmaları destekler.

Tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili bir platform sunarak modelimiz, alanın prognostik belirteçleri tanımlama, terapötik stratejileri keşfetme ve geç evre beyin metastazı mekanizmalarını anlama yeteneğini geliştirir.

Giriş

Beyin metastazları, katı tümörlü hastalarda yaygın ve yıkıcı bir komplikasyondur; genellikle kötü prognoz, belirgin nörolojik düşüş ve düşükte yaşam kalitesiyle ^{ilişkilidir 1,2,3}. Özellikle, merkezi sinir sistemi (CNS) yetmezliği ve nörolojik ölüm, akciğer, meme ve^melanoma 4,5,6,7 gibi kanserlerde giderek daha sık görülen sonuçlar haline gelmiştir. Beyin metastazları bağlamında MSS eksikliği, yerel kütle etkisi, peritümörsel ödem, intrakranial kanama ve meningeal yayılım gibi çeşitli mekanizmalardan kaynaklanabilir ve bu mekanizmalar bağımsız veya sinerjik olarak etkili olarak nörolojik ölüme^{yol açabilir 8}.

Klinik önemine rağmen, CNS yetmezliğinin ve metastatik ilerlemenin son aşamalarının altında yatan patofizyolojik mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Alternatif yayım, ikincil yayım ve yeniden sömürgeleştirme gibi süreçler nadiren özel araştırmaların odağı^{olur 8}. Hem klinik hem de preklinik çalışmalar genellikle analizlerini beyin metastaz sayısı, büyüklüğü veya genel sağlıksızlık (OS) gibi son nokta noktalarla sınırlandırır; böylece kritik mekanik içgörülerin ve nörolojik düşüş ile ölümün gerçek nedenleri göz ardı edilir.

Bu bağlamda, biz ve diğerleri, beyin metastazlarında klinik sonuçlarla korelasyon sağlayan belirgin histolojik büyüme kalıpları (HGP^{) tespit ettik 9,10,11}. Üç ana HGP tanımlanmıştır: i) infiltratif olmayan, genellikle reaktif bir astrositik kenarla çevrili iyi belirlenmiş bir tümör sınırıyla işaretlenen; ii) epitel infiltratif (epitel hücre kümeleri), astrositik muhafaza olmadan bitişik beyin parenximasına sızır; ve iii) diffüz infiltratif, tek tümör hücrelerinin veya küçük kümelerin yaygın bir sızmasıyla karakterize edilip, yaygın bir astrogliosis^10,12.

Klinik olarak, infiltratif HGP'ler, infiltratif olmayan kalıplara kıyasla belirgin şekilde daha kötü prognozla^{ilişkilendirilir (9,10,11}). Ayrıca, HGP'ler tümör büyüme dinamiklerinin ve nörolojik ölüme yol açan mekanizmaların temel yönlerini yansıtıyor gibi görünmektedir. İnfiltratif olmayan metastazlar genellikle tek bir lezyon olarak genişler ve beyindeki hayati yapıları kısıtlarken, infiltratif lezyonlar MSS'de ikincil yayılma gösterir (mevcut lezyondan başlayarak, birincil tümörden değil) ve yaygın hasara ve tamamen organ yok oluşuna katkıda bulunur (yayımlanmamış veriler). İnfiltratif lezyonlar ayrıca meningesleri yeniden kolonileştirebilir, bu da meningeal metastaza katkıda bulunabilir ve hastalığın^10,13 gelişimini daha da karmaşıklaştırabilir. Klinik önemlerine rağmen, beyin metastazlarının HGP'leri ve aynı organın ikincil yayılımı ve yeniden kolonizasyonu dahil olmak üzere MSS kolonizasyonunun son aşamaları, uygun deneysel modellerin eksikliği nedeniyle hâlâ yeterince incelenmemiştir.

Bu boşluğu gidermek için, deneysel farelerin beyin korteksine tümör hücreleri veya tümör hücreleri ile bir veya daha fazla tümör dışı hücre tipinden oluşan hücre karışımlarının kesin ve tekrarlanabilir implantasyonunu mümkün kılan stereotaktik intrakraniyal enjeksiyon modeli sunuyoruz. Bu model, sistemik metastaz modellerinin temel sınırlamalarını aşar ve MSS kolonizasyonunun temel yönlerini araştırmak için sağlam bir platform sunar; örneğin: kolonizasyon sırasında tümör-immün hücre^{etkileşimleri 14}, önceden işlenmiş hücresel karışımların etkisi¹⁵, metastatik büyüme¹⁶, HGP'ye özgü büyüme dinamikleri ve nörolojik başarısızlığa katkıda bulunan patofizyolojik mekanizmalar (yayımlanmamış veriler). Ayrıca, bu model tekrarlanabilir ve klinik olarak ilgili bir bağlamda farmakolojik testleri^{destekler 14,15}.

Bu protokol, beyin metastazlarındaki HGP'leri incelemek için stereotaktik enjeksiyon modelini uygulamak için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Ayrıca, geç aşama CNS kolonizasyon biyolojisinin sistematik olarak incelenmesi için yapılandırılmış preklinik örnek arşivi ve dijital doku kütüphanesinin geliştirilmesini destekler. Amacımız, prognostik ve potansiyel olarak öngörülebilir biyobelirteçlerin tanımlanmasını sağlamak, geliştirilmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunmak ve beyin parenximası ile bağışıklık sisteminin akut ve kronik yanıtlarını tahmin etme yeteneğimizi artırmaktır. Bu yaklaşımla, CNS kolonizasyonu ve metastatik ilerleyişinin sistematik bir incelenmesi için standart bir platform sağlamayı hedefliyoruz.

Protokol

Bu protokolde tanımlanan tüm hayvan prosedürleri, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Aşağı Frankonya Hükümeti tarafından onaylanmış (izin numarası: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Bu protokol, sinjenik yetişkin farelerde (10-12 haftalık) beynin metastatik kolonizasyonu için bir model olarak tümör hücrelerinin stereotaktik intrakortikal enjeksiyonu için tasarlanmıştır. Protokoldeki herhangi bir değişiklik belirlenen hayvan refahı görevlisiyle görüşülmelidir.

1. Ameliyat öncesi işlemler

1. Hayvanların aklimatizasyonu
   NOT: Deneysel prosedürlerin başlamasından önce farelerin en az 7 gün boyunca aklimatize edilmesi gerekir.
   1. Deney hayvanlarını standart laboratuvar koşullarında (22 ± 2 °C, %50-60 göreli nem, 12 saat ışık/karanlık döngü) gruplar halinde beslendirin ve yiyecek ile suya ima olarak erişim.
   2. Refahı teşvik etmek ve stresi azaltmak için, yuva malzemesi, barınaklar ve kemiren bloklar şeklinde çevresel zenginleştirme sağlanır.
   3. Alışma döneminde hayvanları günde bir kez (seans başına 3-5 dakika) tutarak onları insan temasına alıştırın. Ayrıca, yaklaşan ameliyatın temel unsurlarını, tartı ve anestezi kurulumuna maruz kalma gibi temel unsurları simüle eden protektor işlemler gerçekleştirin; herhangi bir invaziv müdahale yapmadan. Bu oturumlar, hayvanları prosedürel ortama alıştırmayı ve stresle ilgili değişkenliği en aza indirmeyi amaçlar.
2. Fiziksel muayene (ameliyat öncesi sağlık kontrolü)
   NOT: Tümör hücresi enjeksiyonundan önce, tüm hayvanlar çalışmayla ilgili olmayan önceden var olan anormallikleri dışlamak için kapsamlı bir fiziksel ve nörolojik muayeneden geçmelidir. Eksiklik veya anormallik gösteren hayvanlar çalışmadan hariç tutulmalıdır. Fiziksel muayene enjeksiyondan bir gün önce yapılabilir.
   1. Kürt durumu, duruş, nefes alış, yürüyüş, vücut ağırlığı ve genel davranış dahil olmak üzere genel sağlık durumunu değerlendiren tam bir fiziksel muayene yapın.
   2. Nörolojik fonksiyonu Asılı Tel Testi kullanarak kavrama gücü ve koordinasyonunu değerlendirin. Asılı Tel Testi'ni yapmak için, iki destek arasında yaklaşık 2 mm çapında yatay bir tel asmakta ve uçlarında yastıklama yüzeyinin yaklaşık 30 cm üzerinde kaçış platformları yerleştirilmelidir. Fareyi telin ortasına yerleştirin ve ön patileriyle teli tutmasına izin verin. Fareyi bırakın ve hemen zamanlamaya başlayın. Deneme, fare platformlardan birine ulaştığında ya da düştüğünde sona erdir. Platforma 60 saniye içinde ulaşan bir fareyi başarılı sayın; Bu süre sınırı içinde düşerse veya platforma ulaşmazsa arıza olarak kaydedilir.
3. İş istasyonlarının hazırlanması
   1. Ameliyat günü (0. gün), aşağıda açıklandığı gibi dört özel çalışma istasyonu kurarak verimli bir iş akışı sağlanır ve işlem boyunca steril tekniği korur.
      NOT: Steril cerrahi malzemeler (alt örtüler, gazlı bez kompresleri, dikişler vb.) ve otoklavlı cerrahi aletler (neşter, penssel, makas, spatula vb.) kullanın.
      1. Çalışma Noktası #1 - Ameliyat öncesi hayvan hazırlığı: Bu çalışma istasyonunu kullanarak fareleri tartın, anestezik çözeltiyi hazırlayın ve anestezi uygulayın. Temiz bir yüzey hazırlayın; içinde bir tartı terazisi, iki kafes yatak (birini anestezi edilmiş fareler için ayırın), anestezi çözeltisi ile doldurulmuş 1 mL bir şırınga ve göz merhemi bulunuyor.
      2. İş Istasyonu #2 - Ameliyat öncesi ve sonrası kurulum: Bu çalışma istasyonunu saç derisi kesisini yapmak, kafatasını mühürlemek ve yarayı dikmek için kullanın. Temiz bir yüzey hazırlayın; içinde bir skalpel, %0,9 NaCl içeren 10 mL şırınga, kemik mumu, spatula, dikiş malzemesi, pens ve makas, pamuklu çubuklar, dezenfektan (%70 etanol), 1 mL ağrı aljezikli bir şırınga, ısıtıcı ped veya benzeri bir ısıtma platformu bulunuyor.
      3. Çalışma Noktası #3 - Tümör hücresi hazırlığı: Bu çalışma istasyonunu aşılamadan önce tümör hücresi çözeltisini hazırlamak için kullanın. Temiz bir yüzey hazırlayın; içinde 10 μL Hamilton şırıngası ve hücre süspansiyonu içeren Eppendorf tüpü içeren temiz bir yüzey, hücreleri yeniden süslemek için 100 μL uçlu bir pipet ve tümör hücre aşısından sonra Hamilton şırıngasını temizlemek için üç kap içeren temiz bir yüzey hazırlanın; bunlar damıtılmış su, %70 etanol ve %0,9 NaCl içerir.
      4. İş Istasyonu #4 - Stereotaktik enjeksiyon: Bu çalışma istasyonunu kullanarak stereotaktik tümör hücresi enjeksiyonunu beyin korteksine uygulayın. Küçük hayvanlar için stereotaktik çerçeve, hassas diş matkapı, büyük forseps ve pamuklu çubuklar içeren temiz bir yüzey hazırlayın.
4. Tümör hücresi süspansiyonunun hazırlanması
   NOT: Tümör hücresi süspansiyonunun hazırlanması için yapılan tüm işlemler, sterilliği sağlamak ve personeli potansiyel biyolojik tehlike maruziyetinden korumak için uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanılarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruma dahil olmak üzere sertifikalı biyolojik güvenlik dolabında (Sınıf II başlık) yapılmalıdır.
   1. Hücreleri 1 mL tripsin kullanarak 1x EDTA kullanarak tripsinize edin.
      NOT: Tümör hücrelerinin üstel büyüme aşamasında kullanılması önerilir.
   2. Uygun bir sayım yöntemi (örneğin, hemositometre veya otomatik hücre sayacı) kullanarak hücre sayısını doğru şekilde belirleyin.
   3. Her hayvan için 3 μL ECM ortamında 1 x 10³ hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Uygun olduğunda %10 FCS içeren ECM ve standart kültür ortamı içeren 2:1 oranında bir karışım kullanın. Hayvan sayısına göre süspansiyon hacmini ve hücre sayısını artırın (örneğin, 10 fare için, 30 μL ECM ortamında 10 ×^{10 3} hücre hazırlanın).
      NOT: Her hücre hattı için enjekte edilen hücre sayısı dikkatlice titredilmelidir.
   4. Hücre süspansiyonunu enjeksiyona kadar buzda tutun, maksimum 2 saat boyunca.

2. Ameliyat dışı işlemler

1. Fare anestezisi
   1. Her fareyi hassas bir tartı kullanarak tartın ve vücut ağırlığına göre gerekli anestezi miktarını hesaplayın.
   2. Hesaplanan anestezi hacmini intraperitonel olarak uygulayın.
      NOT: Tüm işlemi kapsayan bir anestezi rejimi kullanın (yaklaşık 2 saat). Örneğin: %10 ketamin (ketamin hidroklorür, 100 mg/mL; 100 mg/kg vücut ağırlığı) ve Domitor (medatomidin hidroklorür, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg vücut ağırlığı) veya eşdeğer bir protokol ile birleştirilir.
   3. Yeterli anestezi derinliği doğrulandıktan sonra, fareyi termoregülasyonu desteklemek için önceden ısıtılmış bir ısıtma pedine (37-38 °C olarak tutulur) yerleştirin ve korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi uygulanır.
      NOT: Arka patiyi pensle nazikçe sıkarak yeterli anestezi derinliğini doğrulayın. Ameliyata sadece çekilme refleksi gözlemlenmediyse devam edin.
2. Saç derisi hazırlığı ve kesi
   1. Ameliyat öncesi lidokain uygulanarak kesi bölgesinde lokal anestezi sağlanır. %1 lidokain (5 mg/mL) bir solüsyon kullanın ve planlanan kesi hattı boyunca yaklaşık 0,05-0,1 mL deri altına enjekte edin. Anestezin etkisini göstermesi için en az 2-3 dakika bekleyin, ardından saç derisi kesisine geçin.
   2. Saç derisini iyot bazlı bir çözeltiyle iyice dezenfekte edin.
   3. Deriyi gergin gerin ve steril bir bistüri kullanarak kafatası boyunca yaklaşık 3-4 mm ortada bir kesi yapın.
   4. Aynı bisterle periostumu nazikçe kazıyarak kafatası yüzeyini ortaya çıkarın.
3. Stereotaktik çerçeve kurulumu, koordinat tanımı ve kraniotomi
   1. Farenin başını kulak barları kullanarak stereotaktik çerçeveye sabitleyin.
   2. Stereotaktik kolu kullanarak, koronal ve sagital kafatası dikişlerinin kesişim noktası olan Bregma'yı bulun, ardından stereotaktik kolu 2 mm ön ve 1 mm lateral (sağda) frontal korteksteki hedef enjeksiyon yerine Şekil 1B'de belirtildiği şekilde taşıyın ve cerrahi bir işaretleyici ile işaretleyin.
      NOT: Enjeksiyon yapılması amaçlanan bölgede bir kan damarı varsa, kanamayı önlemek için konum 0,5 mm'ye kadar ayarlanabilir.
   3. Hassas bir diş matkabıyla kafatasını dikkatlice delin, dura mater'e girmemeye dikkat edin.
   4. Açılışı steril penslerle nazikçe delerek doğrulamak için kesin bir kırılma için hissedin.
4. Tümör hücresi enjeksiyonu
   NOT: Bu adımda hızlı çalışın, çünkü ECM oda sıcaklığında katılaşmaya başlar ve bu enjeksiyonun doğruluk ve tutarlılığını etkileyebilir.
   1. Tümör hücresi süspansiyonunu pipetle yukarı aşağı iyice tekrar askıya alın, böylece eşit dağılım sağlanır.
      NOT: Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için vortekslerden kaçının.
   2. Hücre süspansiyonundan 3 μL 10 μL'lik Hamilton şırıngasına yükleyin ve uygun tutucu kullanarak stereotaktik çerçeveye yerleştirin.
   3. Şırınga iğnesini dikkatlice burr deliğinin üzerine yerleştirin.
      NOT: İğne sırasında tekrarlanabilirliği artırmak için iğnenin eğiğinin sola baktığından emin olun.
   4. İğneyi beyin dokusuna dikey olarak 3,5 mm derinliğe sokun. Bu derinliğe ulaşıldığında, enjeksiyon sırasında ve sonrasında hücre süspansiyonunun reflü oluşmasını önlemek için iğneyi yavaşça 0,5 mm geri çekin.
   5. 3 μL tümör hücresi süspansiyonunu 1 dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Tüm hacim verildikten sonra, iğneyi hücrelerin ve ECM'nin yerleşmesi için 2 dakika daha yerinde tutun, böylece reflü riskini en aza indirin.
   6. Şırıngayı dikkatlice çekin ve fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın.
5. Dikiş ve anesteziden iyileşme
   1. Kafatasını steril %0,9 NaCl çözeltisiyle nazikçe durulayın.
   2. Burr deliğini kemik mumu ile kurutup kapatın.
   3. Saç derisi kesisini 3 ila 4 dikiş kullanarak kapatın; her dikişin doğru iyileşme için üç sıkı düğümle yara kenarlarına yakın bağlandığından emin olun.
   4. Fare kulaklarını, belirlenen tanımlama numarasına uygun bir kulak punch deseniyle işaretleyin.
   5. İyileşme sırasında korneanın kurumasını önlemek için gerekirse göz merhemini tekrar uygulayın. Hemen sonra, fareyi termoregulasyonu desteklemek ve anestezi iyileşmesini kolaylaştırmak için önceden ısıtılmış bir ısıtma pedine (37-38 °C olarak tutulur) geri döndürün.
      NOT: Uyanık ve iyileşmekte olan hayvanlar arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan yaralanmaları önlemek için farelerin iyileşme sırasında bireysel olarak tutulması önerilir.
   6. Hamilton şırıngasını iyice temizleyin ve dezenfekte edin; iğne ve fıçıyı üç kez ardışık durulayın: önce damıtılmış su, sonra %70 etanol ve son olarak steril %0,9 NaCl çözeltisiyle.
   7. Temizlikten sonra Hamilton şırıngasını bir sonraki kullanımına kadar buzda saklayın.

3. Ameliyat sonrası işlemler

1. Postoperatif analjezi
   1. Fare hala anestezi altındayken deri altı olarak analjezikler uygulanarak ameliyat sonrası hemen ağrı gidermesini sağlayabilirsiniz.
      NOT: Bu tür işlem için uygun ağrı aljezikleri kullanın. Örneğin, vücut ağırlığı 10 mg/kg karprofen.
   2. Fare tamamen uyandığında ve normal motor fonksiyonuna kavuştuğunuz, temiz bir kafese ve taze yatak örtüsüne aktarın. Hayvanın normal davranış ve nefes alma düzenlerini kısa süreliğine izleyin.
   3. Tam iyileşmeden sonra, ameliyattan sonra en az 24 saat boyunca içme suyu (örneğin, vücut ağırlığı 200 mg/kg metamizol) ile analjezi uygulanır.
      NOT: Su alımını teşvik etmek için içme suyunu %0,5 sakaroz ile tatlandırın. İçme şişelerini ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve her gün değiştirin. Her şişeyi etiketleyerek analjezik alımını takip edin. Eğer ağrı aljezikleri içme suyla tüketilmiyorsa veya ağrı belirtileri gözlemlenirse, tam iyileşmeye kadar her 12 saatte bir deri altına Karprofen (10 mg/kg vücut ağırlığı) verin.
2. Fare izleme
   1. Ameliyattan sonraki ilk 48 saat boyunca her 24 saatte bir tüm fareleri yakından izleyin, motor fonksiyon ve davranışları değerlendirin. 3. günden itibaren, vücut ağırlığı ölçümleri dahil en az her 3 günde bir fareleri izleyin.
   2. Eğer rahatsızlık veya anormal davranış belirtileri gözlemlenirse (örneğin, motor aktivite bozukluğu, alışılmadık davranış), daha önce tarif edildiği gibi Asılı Tel Testi yapılacaktır. Fare testi geçerse, izlemeye devam edin ve testi her iki günde bir tekrarlayın.
   3. Fareleri önceden tanımlanmış insancıl son noktalardan birine ulaştıktan hemen sonra ötenazi yapın (bkz. Bölüm 3.4): Kilo kaybı > başlangıç vücut ağırlığından %20 (0. gün), Asılı Tel Testi'ni geçememe veya 48 saate kadar süren sürekli orta derecede sıkıntı yaşanması.
3. Terapötik tedavi (isteğe bağlı)
   1. Tam ameliyat sonrası iyileşmenin ardından, deneysel tasarıma bağlı olarak terapötik bir rejim başlatılabilir. Eğer durum buysa, tedavi başlatma zamanını çalışma protokolünde net bir şekilde tanımlayın ve izleme planını, terapötik müdahalenin beklenen etkileri ve potansiyel yan etkilerini yansıtacak şekilde uyarlayın.
      NOT: Tedaviler, hayvanlar normal davranış, sabit kilo gösterene ve ameliyat sonrası sıkıntı belirtisi göstermedikten önce başlamamalıdır.
4. Ötenazi ve doku koleksiyonu
   NOT: Fareler, önceden belirlenmiş insani uç noktalarına ulaştıkta veya belirli deneysel zaman noktalarında özel araştırma hedefleri gerektirdiği şekilde hemen ötenazi yapılmalıdır.
   1. Fareyi uygun bir yöntemle anestezi edin (bkz. adım 2.1.2).
   2. Toraks boşluğunu açın ve 10-20 mL buz soğukluğu steril %0,9 NaCl ile transkardiyal perfüzyon yapın, ardından 10-20 mL buz soğukluğu 4% paraformaldehit (PFA) uygulanır.
      NOT: Eğer sonraki uygulamalar için (örneğin, RNA izolasyonu veya FACS) taze doku gerekiyorsa, PFA perfüzyon adımı çıkarılabilir.
   3. Beyin ve diğer ilgi çekici organları toplayın.
      NOT: Organlar sıvı azotta snap-dondurulabilir, FFPE işleme için formalinde sabitlenebilir veya doğrudan sonraki analizler için kullanılabilir.
5. Yapılandırılmış ölüm sonrası analiz
   NOT: Metastatik büyümeyi doğrulamak ve ilgili histopatolojik özellikleri karakterize etmek için, beyin dokusunun ölüm sonrası analizi hem doğal (taze dondurulmuş) hem de sabit (FFPE) örneklerle yapılmalıdır.
   1. Doku diseksiyonu
      1. Beyni, enjeksiyon bölgesi seviyesinde diseksiyon, Şekil 1C'de sunulan şemada belirtildiği gibi.
      2. Ön kısmı taze dondurulmuş (FF) işlem için kalın. Bu kısmı enjekte edilen (i.) ve enjekte edilmemiş (n.i.) yarımkürelere ayırın.
      3. Formalin fiksasyonu ve parafin gömülmesi (FFPE) için orta kısmı koruyun.
      4. Arka kısmı, beyincik ve beyin sapı dahil olmak üzere atın.
   2. Örnek işleme
      1. Ön kısmı sıvı azotta snap-dondurun ve FF örneklerini -80 °C'de depolayın, sonra daha fazla kullanılana kadar.
      2. Merkezi kısmı oda sıcaklığında 5-7 mL %4 PFA ile FFPE işlemden önce 48 saat sabitleyin.
         NOT: PFA fiksasyonu, toksik buharlara maruz kalmamak için uygun PPE giyilerek kimyasal bir duman kapastonunda yapılmalıdır.
   3. Metastatik yükün nicelendirilmesi (FF örnekleri)
      1. Beyin dokusu için optimize edilmiş uygun bir ekstraksiyon kiti veya protokolü kullanarak toplam RNA'yı izole edin.
         NOT: RNA izolasyonu, kontaminasyonu ve tehlikeli reaktiflere maruz kalmayı önlemek için uygun PPE kullanılarak biyolojik güvenlik dolabında yapılmalıdır.
      2. Tümör hücresine özgü bir belirteç ( örneğin Ck8) kullanılarak nicel PCR (qPCR) yapın.
         NOT: Ek hedefler (örneğin, bağışıklık veya stromal hücre belirteçleri) uygun gen belirteçleri seçilerek değerlendirilebilir. RNA dizileme (RNA-dizi), transkriptom çapında analiz için alternatif olarak kullanılabilir.
      3. İlgi konusu geni (örneğin Ck8) bir ev genine (HK) normalleştirerek göreli tümör yükünü hesaplayın.
   4. Histolojik analiz (FFPE örnekleri)
      1. Parafine formalin sabit doku yerleştirin.
      2. Örnekleri mikrotom kullanarak 3 μm kalınlığında dilimlere ayırın.
         NOT: Mikrotom kullanımı, uygun PPE'ye sahip eğitimli personel tarafından yapılmalıdır; kesim yapmadığında bıçak koruyucu kullanılmalı ve bıçakları keskin kaplara atarak güvenliği sağlamak için gereklidir.
      3. Standart Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyama ile immünohistokimya (IHC) uygulayın; örneğin Ck8 (tümör hücreleri), Cd3 (T hücreleri), Iba1 (mikroglia/makrofajlar) ve Gfap (astrositler) gibi ilgili antikorlar kullanılarak.
         NOT: H&E ve IHC prosedürleri, güvenliği sağlamak ve kimyasal maruziyeti önlemek için iyi havalandırılan bir alan veya duman kapasası içinde yapılmalıdır.
      4. Yüksek çözünürlüklü slayt tarayıcısı kullanarak tüm lekelenmiş slaytları dijital olarak tararak dijital bir doku kütüphanesi oluşturun.
      5. Yayınlanmış^protokol 10,12'ye göre beyin metastazı histolojik büyüme desenini (HGP) değerlendirin.

Sonuçlar

Stereotaktik enjeksiyon protokolü (Şekil 1), bilimsel soruya bağlı olarak vahşi tip veya genetik olarak değiştirilmiş suşlar dahil olmak üzere hem sinjenik hem de ksenograft fare modellerine uygulanabilir. Beyinde büyüyebilen uygun herhangi bir hücre hattı kullanılabilir. Beyni kolonizelik edebilen fare tümörü hücre hatlarına örnek olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak gereken, meme tümörü hücreleri 4T1 ve 410.4, kolorektal kanser hücreleri CMT93 ve melanom hücre hattı B16-F10 bulunur. Tümör hücrelerinin beyinde metastaz oluşturması için gereken süre hücre hattına göre değişir; birkaç günden birkaç haftaya kadar değişir ve nüfuz noktası da değişkendir. ~%70 penetranslı bir model kullanmanızı öneriyoruz; yani en az 10 hayvandan 7'si maksimum 20 hafta deneysel sürede metastaz geliştirir (Şekil 2A). Her hücre hattı bireysel olarak optimize edilmeli ve enjekte edilen hücre sayısı dikkatlice titrasyon edilmelidir.

Örneğin, iki yakın ilişkili sinjenik meme kanseri beyin metastazı modelini karşılaştırdık: 410.4 ve onun türevi 4T1. Genetik^{benzerliklerine rağmen 17}, bu hücre hatları beyinde metastaz davranışları ve büyüme kalıpları belirgin şekilde farklı gösterir¹⁶. Her ikisi de benzer metastatik yük sağlar (Şekil 2B), her biri benzersiz bir zaman akışı gösterir (Şekil 2C) ve açıkça farklı yüksek ggp'ler gösterir (Şekil 2D). Farklı hücre hatları arasında kolonizasyon verimliliğini sistematik olarak değerlendirmek ve karşılaştırmak için, enjekte edilen hücre sayısını, medyan hayatta kalma süresini ve kolonizasyon başarısını entegre eden matematiksel bir formül olan Kolonizasyon İndeksi'ni geliştirdik (Şekil 2E-G).

Stereotaktik enjeksiyonu ilk kez yaparken veya yeni bir hücre hattı test edilirken, büyüme desenlerini dikkatlice değerlendirmek ve hayvanlar, ameliyatlar ve deneyciler arasında sonuçları karşılaştırmak çoğaltılabilirliği sağlamak için gereklidir. Kritik bir adım, hücre süspansiyonunun sızıntısı gerçekleşebileceği tümör hücresi enjeksiyonudur. Bu durum, özellikle tümör hücrelerinin kafatasına ve/veya meningelere iatrojenik tohumlanmasıyla, yanıltıcı tümör lokalizasyonuna yol açabilir; bu da gerçek intraserebral kolonizasyonu temsil etmeyen yanlış pozitif meningeal metastazlara ve ardından ikincil meningeal yayılmaya yol açabilir. Bu senaryolar Şekil 3'te gösterilmiştir.

Şekil 1: Farelerde stereotaktik intrakortikal tümör hücresi enjeksiyonu için pre-, intra- ve post-operatif işlemler. İşlemin şematik özeti. (A) Ameliyat öncesi aşama hayvanların aklimatizasyonu, sağlık değerlendirmesi, cerrahi alanın hazırlanması ve tümör hücresi askısını içerir. (B) Ameliyat dışı aşama, anestezi indüksiyonu, saç derisi kesi, stereotaktik çerçeveye yerleştirilme, hassas kranioomi, stereotaktik koordinatlarla beyin korteksine tümör hücreleri enjekte edilmesi, yara kapanması ve anesteziden iyileşmeyi içerir. (C) Ameliyat sonrası aşama, analjeziklerin uygulanmasını, ameliyat sonrası iyileşmeyi, genel sağlık durumunu ve nörolojik semptomların gelişimini değerlendirmek için rutin izlemeyi (Asılı Tel Testi) içerir; ardından ötenazi ve organ toplama işlemleri yapılır. Taze donmuş (FF) dokuda metastatik yükü qPCR ile değerlendirmek ve dijital slayt kütüphanesinden FFPE örneklerindeki histolojik büyüme desenlerini değerlendirmek için yapılandırılmış bir ölüm sonrası analiz dahil edilmiştir. Önemli prosedür aşamaları, zamanlama ve cerrahi iş akışına vurgu yapmak için sıralı olarak gösterilmiştir. Görsel BioRender'da oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 4T1 ve 410.4 meme kanseri hücrelerinin stereotaktik enjeksiyonu sonrası beyin metastazı fare modellerinde metastatik büyümenin temsilci sonuçları. (A) ECM enjekte edilen kontrol Balb/C farelerinde tümör büyümesinin olmadığını ve tümör hücresi-ECM süspansiyonları (Met) enjekte edilen farelerde görünür metastatik lezyonların varlığını gösteren makroskopik görüntüler. (B) ECM enjekte edilen kontrol farelerinde (CTRL) ve 4T1 ile 410.4 meme kanseri hücrelerinden türeyen beyin metastazlarına sahip farelerde metastatik yükün nicelendirilmesi. Metastatik yük, tümör belirteci olarak Ck8 kullanılarak qPCR ile değerlendirildi; Gapdh ve Pgk1 ise ev genleri (HK) olarak kullanıldı. Veriler, bireysel veri noktalarıyla ortalama değerler olarak sunulur. İstatistiksel analiz tek yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi (n = 5; ****P < 0.0001) yapıldı. (C) Kaplan-Meier sağ kalım eğrileri, sadece ECM (kontrol, siyah), 4T1 (turuncu) veya 410.4 (mavi) tümör hücresi ile stereotaktik olarak enjekte edilen farelerin genel hayatta kalma (OS) örneklerini karşılaştırmak. İstatistiksel analiz, Log-rank (Mantel-Cox) testi kullanılarak yapıldı (4T1 vs 410.4; n = 10; ***P < 0.001). (D) 4T1 ve 410.4 hücrelerinden türetilen beyin metastazlarının temsil histolojik görüntüleri; büyüme desenlerindeki farklılıkları gösteren kohort ve iplik benzeri infiltratif epitel HGP'leri de içerir. Doku kesitleri anti-sitokeratin 8 antikoru ile boyandı. (E) Kolonizasyon Indeksi (CI) kullanılarak kolonizasyon verimliliğinin karşılaştırmalı analizi. 4T1 (turuncu) ve 410.4 (mavi) CI değerleri gösterilmiştir. (F) CI hesaplamak için kullanılan formül. (G) Her iki model için CI'ye dahil edilen parametreleri özetleyen tablo. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Başarılı ve optimal olmayan stereotaktik enjeksiyon sonuçlarının temsilci örnekleri. (A,C) Farklı bölgelerde metastik büyümeyi gösteren makroskopik görüntüler: (A) yanlış enjeksiyon ve tümör hücrelerinin sızıntısı sonucu kafatası ve meninglerde tümör büyümesi, (C) doğru intrakortikal enjeksiyondan sonra başarılı parenkimal metastaz. (B,D) Karşılık gelen histolojik kesitler, (B) intrameningeal tümör büyümesini ve ardından beyin parenkimine infiltrasyonu ile (D) yerleşik bir parenkimal metastazdan meninglere ikincil yayılmayı doğrular. Doku kesitleri anti-sitokeratin 8 antikoru ile boyandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Stereotaktik intrakraniyal enjeksiyon tekniği, tümör hücrelerinin veya hücresel karışımların deneysel farelerin beyin korteksine doğrudan hassas ve lokel olarak taşınmasını sağlar. Yapılandırılmış bir otopsi sonrası analizle birleştiğinde, bu model özellikle metastatik büyüme, ikincil organ içi yayılım ve olası ölüm nedenleri dahil olmak üzere beyin metastazının geç evrelerini incelemek için değerlidir. Buna karşılık, sistemik enjeksiyon yöntemleri (örneğin, kuyruk veneri veya intrakardiyak enjeksiyon), tümör hücresinin dolaşımda hayatta kalması, ekstravazasyon ve uzak organlarda tohumlama gibi metastatik kaskadın erken adımlarını araştırmak için daha uygundur. Ancak, bu yaklaşımlar beyne özgü değildir ve genellikle düşük ve tutarsız beyin kolonizasyon^{oranlarına yol açar} 18,19,20.

Sistemik modeller ayrıca yüksek biyolojik değişkenlik göstermektedir; özellikle hangi beyin bölgelerinin etkilendiği açısından, terapötik çalışmaları zorlaştırır ve büyük hayvan kohortları gerektirir. Ayrıca, hayvanlarda sık sık ekstrakranial metastaz gelişir ve bu da erken deneme üretiminin durdurulmasına yol açabilir¹⁹. Bu sınırlamalar, geç evre beyin metastazlarının incelenmesinde faydalarını önemli ölçüde azaltmaktadır. Ayrıca, ikincil yayılma ve yeniden kolonizasyon sistemik modellerle özellikle zordur; çünkü birincil tümörden kaynaklanan birincil yayılım ile zaten kurulmuş bir metastazdan kaynaklanan ikincil yayılım arasındaki ayrım neredeyse imkansızdır. Ayrıca, özellikle makro-metastatik büyüme ve beyin metastazlarının yüksek seviyelerinin değerlendirilmesi için yapılandırılmış bir ölüm sonrası analizi bu ortamlarda sınırlıdır.

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) ve organotipik beyin dilimi (co)-kültürleri gibi ex vivo ^{sistemlerle karşılaştırıldığında,} stereotaktik enjeksiyon birkaç kritik avantaj sunar. Ex vivo modeller yerli beyin mimarisinin bazı yönlerini korur ve hastalardan veya bağışçılardan gelen yerleşik ve sızan bağışıklık hücrelerini içerebilir, ancak vaskülerleşme, sistemik sinyal ve in vivo tümör mikroçevresinin tam karmaşıklığından, özellikle T hücrelerinin veya diğer kan veya kemik iliğinden kaynaklanan bağışıklık hücrelerinin daha fazla infiltrasyonundan^{yoksun 23}. Bu sınırlamalar, uygulamalarını kısa vadeli çalışmalar ve ilaç taraması veya temel metastatik hücre-beyin etkileşim testleri gibi basitleştirilmiş ortamlarla sınırlandırır. Buna karşılık, stereotaktik yaklaşım tümör ilerlemesi, bağışıklık yanıtı ve canlı bir organizmada terapötik müdahalenin uzun vadeli çalışmalarını destekler. Önemli olarak, nörolojik semptomların insancıl bir son nokta olarak değerlendirilmesi, makro-metastatik başlangıcının klinik olarak önemli bir ölçümü sağlar. Bu da modeli, özellikle translasyonel araştırmalarda değerli olan insan hastalık sürecini daha da yansıtıcı kılar. Hayvan kullanımını içerse de, 3R'lere (Yerini Değiştirme, Azaltma ve Geliştirme) bağlılıkla ele alınan etik hususları gündeme getirse de, bu model şu anda tamamen ex vivo alternatiflerle değiştirilemiyor. Beyin metastazının tam fizyolojik bağlamını taklit edebilme yeteneği, metastatik dinamikler ve yoğun sinir sindromu spesifik patofizyoloji anlayışımızı ilerletmek için vazgeçilmez hale getirir.

Birçok avantajına rağmen, stereotaktik enjeksiyon modelinin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Önemli bir endişe, enjeksiyon sırasında tümör hücresi süspansiyonunun sızması ve yanıltıcı büyüme desenlerine yol açabileceğidir. Özellikle, tümör hücrelerinin meningelere istemeden yapışması, iatrojenik meningeal^{metastaz 8'e} yol açabilir ve bu da bu hücre hattındaki metastatik yayılmanın doğal gidişini doğru yansıtmaz. Veri güvenilirliğini sağlamak için, belirli bir tümör hücre hattının büyüme desenleri hayvanlar, cerrahi işlemler ve deneyciler arasında tutarlı şekilde karşılaştırılmalıdır. Tümör hücre sızıntısını en aza indirmek için, jel benzeri kıvamı ve vücut sıcaklığında katılaşabilme yeteneği sayesinde ekstrasellüler matriks (ECM) kullanmayı öneriyoruz. Ancak, ECM aynı zamanda erken katılaşmayı önlemek için enjeksiyon sırasında hızlı müdahale ihtiyacı gibi zorluklar da barındırır. Protokolümüzdeki bir diğer husus, tümör hücrelerinin ECM ve serum içeren ortam karışımına enjekte edilmesidir. FBS, beyinde genellikle sınırlı olan besinleri sağlayarak tümör hücre nakletini artırırken, aynı zamanda iltihabı da teşvik edebilir. Eğer bu bir endişe kaynağıysa, serumsuz ortamlar veya dengeli tuz çözeltileri (örneğin, HBSS veya PBS) alternatif olarak kullanılabilir.

Ayrıca, stereotaktik enjeksiyon teknik olarak damar içi (damar damar) enjeksiyonu gibi diğer yöntemlere göre daha zorludur. Tekrarlanabilirliği sağlamak için özel eğitim gerektirir ve işlem çok daha zaman alıcıdır; genellikle hayvan başına 15-30 dakika sürerken, damar içi enjeksiyonlar için 3-5 dakika sürer. Bu uzun süre, seans başına işlenebilen hayvan sayısını sınırlar; bu da istatistiksel güç elde etmek için büyük grupların gerektirdiği terapötik çalışmalar için zorluk oluşturabilir. Ancak bu sınırlama, enjeksiyonların birkaç gün boyunca dağıtılmasıyla etkili bir şekilde ele alınabilir; bu da sadece deneysel esnekliği ve uygulanabilirliği artırmakla kalmaz, aynı zamanda tümör hücresi davranışı ve konak yanıtı açısından daha gerçekçi bireyler arası farklılıkları yansıtan değerli biyolojik çeşitlilik de getirir.

Son olarak, bu modelin metastatik kaskadın önceki adımlarını atladığını belirtmek önemlidir; daha önce tartışıldığı gibi. Uygun deneysel model, araştırma sorusu ve incelenen metastaz evresi temelinde seçilmelidir. Geç evre beyin kolonizasyonunu araştırmak için stereotaktik intrakortikal enjeksiyon altın standart olarak kalmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hayvan kulak yumruk penseleri	LabArt
Bepanthen® Göz ve burun merhemi	Bayer Vital GmbH	1578675
Kemik mumu	B.Braun	210434
Pamuk çubukları	Hartmann	143213
Cultrex Bazal Zar (ECM) Ekstraktı	B& D	3432-005-01
Dezenfektan	B.Braun	107190
Matkap Ucu	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Göz makası	Hermle	501
Hamilton şırıngası (10µ L cilt)	VWR	5491135
Isıtma pedleri	Intergastro	258122
Fare Burnu/Diş Çubuğu Testi (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Noyes göz makası	Hermle	545
Paur 60 derece ve derece; hint non noptore Fare Kulak Çubukları	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Skalpel	PFM Medical AG	17027
Semkin standart forseps	Hermle	710
Seralon poliamid dikişi (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Stereotaksik Matkap - Jacobs Chuck-18000rpm	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Rat adaptörü olmadan stereotaksik	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
5& için Şırınge Hdder 10µ l Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC İğne Tutucuları Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425