Yöntem makalesi

Mekanik Hücre Esneme Biyoreaktörü kullanarak 3D Kolajen Gömülü A549/MRC-5 Alveolar Organoidlerin Üretimi

DOI:

10.3791/69447

⸱

27 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of British Columbia - Okanagan, 2Centre for Heart Lung Innovation, St. Paul's Hospital, University of British Columbia

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, A549 alveolar epitel hücreleri ve MRC-5 akciğer fibroblastlarından organoid üretimini, hücre dışı matris hidrojel iskelesi üzerinde üretmeni, ardından 3D kolajen jellerine gömülüp hücre germe biyoreaktör kullanılarak mekanik gerilmeye maruz kalmayı ve alveolar mekanobiyoloji araştırmasını sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nefes dinamiği ve mekanik zorlanma alveolar biyolojide kritik roller oynasa da, solunum yolu hastalıklarının patogenezine katkıları sıklıkla göz ardı edilir. Bu boşluğu gidermek için, alveolar epitelyal-fibroblast organoidlerin hücre esneme biyoreaktör kullanılarak kontrollü mekanik zorlanmaya maruz kaldığı bir organoid model geliştirdik. Bu platform, alveolar dokunun mekansal organizasyonunu ve çok hücreli karmaşıklığını çoğaltır ve hücre-hücre iletişimi ile mekanotransdüksiyonun sağlık ve hastalıkta doku yapısını ve işlevini nasıl etkilediğinin araştırılmasına olanak tanır. Bu protokolde, bazal membran ekstrasellüler matriks hidrojelinde A549 alveolar epitelyal ve MRC-5 akciğer fibroblast hücre hatları kullanılarak epitelal-fibroblast organoidlerin üretimi ve kültürlenmesi yöntemlerini açıklıyoruz. Organoidler daha sonra enzimatik olmayan izole edilir ve biyoreaktördeki özel plakalarda 3D kolajen jellerine gömülür. Solunum alevlenmelerinde görülen patolojik solunum desenlerini taklit etmek için equibiaxial gerilme uygulamak için prosedürleri özetliyoruz. Son olarak, hücreye özgü belirteçler için immünboyama ve bağışıklık aracı salınımını profil etmek için immünotestleri içeren standart bir karakterizasyon iş akışı sunuyoruz. Bu analizler birlikte organoid yapı ve fonksiyonun değerlendirilmesini destekler. Bu protokol, mekanik stres altında alveolar biyolojiyi incelemek için kullanıcı dostu, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir platform sunar; çeşitli deneysel hedeflere ulaşmak ve akciğer hastalığı mekanizmaları üzerine araştırmaları ilerletmek için kolayca değiştirilebilir parametrelerle donatılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alveoller, solunum sisteminin terminal keseleridir ve gaz değişiminin ana noktası olarak hizmet verir. Esas olarak gaz değişimi, bağışıklık fonksiyonları ve yapısal bütünlüğün korunmasından sorumlu olan alveolar tip I ve II epitel hücrelerinden oluşur; ayrıca duvar içindeki fibroblastlardan oluşur; bu hücreler ekstraselüler matrishomeostazı 1'i sağlar. Bu ve diğer yerleşik hücreler solun sırasında sürekli olarak döngüsel gerilme ve kesme stresine maruzkalırlar 2. Bu mekanik ipuçları, hücre yapısını, farklılaşmasını ve iletişimini etkileyen biyokimyasal sinyalleredönüştürülür 3.

Patolojik mekanik zorlanma, kronik obstruktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi akciğer hastalıklarında gözlemlenir. KOAH, parenkimal yıkım, kronik iltihap ve küçük hava yollarının daralmasıyla karakterize edilen ilerleyici birdurumdur 4. Bu hastalıkta, alveolar duvarların yıkılması, elastin kaybı, fibroza yol açan ekstraselüler matriks (ECM) yeniden şekillendirilmesi ve kronik iltihap birlikte akciğerin yapısal hasara dayanmayeteneğini zayıflatır 5,6. Bu, solunum sırasında heterojen ve anormal alveolar deformasyona yol açar; bu durum hastalık alevlenmeleri sırasında daha da kötüleşir 7,8.

Alveolar biyolojiyi incelemek için birkaç in vitro yaklaşım kullanılsa da, her birinin belirgin sınırlamaları vardır. 2D ko-kültür sistemleri, hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasını kolaylaştırır ancak doku mimarisini veya ekstrasellüler matriks dinamiklerini yakalayamaz, bu da fizyolojik önemi azaltır. Statik 3D kültürler, yapısal organizasyonu ve matris etkileşimlerini daha iyi korur, ancak canlı dinamik mekanik ipuçlarını içermezler. Mikrofluidik ve organ-on-chip platformları, sıvı akışını ve mekanik gerilimi taklit ederek yüksek fizyolojik hassasiyet sağlar, ancak genellikle teknik olarak karmaşık, düşük verimlilik vemaliyetlidirler 9. Buna karşılık, burada sunulan 3D mekanik olarak zorlanmış organoid model, yapısal karmaşıklık, hücresel heterojenlik ve mevcut modellerde sıkça göz ardı edilen kontrollü mekanik uyarımcı, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir bir platformda birleştirir ve fizyolojik önem ile deneysel erişilebilirlik arasında denge sunar10,11.

KOAH gibi hastalıklara katkıda bulunan karmaşık mekanizmaları anlamak ve terapötik hedefleri bulmak için hastalık modelleri oluşturulmuştur. Önemine rağmen, mekanik deformasyon genellikle KOAH gibi akciğer hastalıklarının mekanizmalarını ve patogenezini incelemek için kullanılan in vitro alveolar modellerde göz ardı edilir. Bu boşluğu gidermek için, alveolar epitelyal-fibroblast organoidlerin bir taban matriksinde kültürlenmesi, bunların 3D kolajen jellerine alınıp gömmesi, hücre esneme biyoreaktör kullanılarak döngüsel mekanik zorlanma uygulanması ve temel yapısal ile fonksiyonel sonuçların değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu 3D mekanik organoid modeller, hücresel etkileşimleri ve insan alveolar nişinin mikro ortamını daha iyi yakalarak epitelal-mezenkimal çapraz konuşma12 incelenmesini mümkün kılar.

Biyoreaktör, yapılandırılabilir parametrelerle eşit eksenli gerilme uygular; bu da hem fizyolojik hem de patolojik koşulları modellemek için %30'a kadar uzama ve 5 Hz'e kadar frekanslara olanak tanır. Bu çalışmada, patolojik nefes almayı taklit etmek için 24 saat boyunca 0,4 Hz'de %18 zorlanmaya maruz kalan kollajen-I hidrojellerine gömülü organoid modeller oluşturduk. Hücre spesifik belirteçler için immünboyama ve mekanik gerilme sonrası bağışıklık aracı salınımını niceleyen immünotestleri içeren standartlaştırılmış bir karakterizasyon iş akışı oluşturduk. Bu çalışmanın amacı, mekanik stres altında alveolar biyolojiyi araştırmak için fizyolojik olarak ilgili, kullanıcı dostu ve uyarlanabilir bir platform sağlamaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm adımlar aseptik teknik, steril malzemeler ve reaktifler gerektirir ve personelin biyotehlike maddelere maruz kalmasını ve kültürlerin kontaminasyonunu azaltmak için biyolojik güvenlik dolabında gerçekleştirilir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü ve hücre stoklarının oluşturulması

  1. Organoid oluşumundan önce, A549 ve MRC-5 kültürü standart doku kültüründe işlenmiş plastik şişelerde (T75 cm2) yaklaşık %70-80 birleşimle Dulbecco'nun Modified Eagle Medium (DMEM) ile %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin ile desteklenmiştir; burada "tam DMEM" olarak adlandırılır.
  2. Hem A549 hem de MRC-5 için, 2 x 104 hücre/cm2 ölçüsünde, toplam 10 mL tam DMEM haciminde tohumlanın. Kültür hücreleri, nemli ortamda %5CO2 ile 37 °C'de yaklaşık %70-%80 birleşime ulaşılana kadar.
  3. En iyi büyüme koşullarını sağlamak için kültür ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
  4. Alt kültür, termostaki tüm ortamları %70-80 birleştiğinde aspire edilerek, bir kez sıcak fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) yıkanarak ve ardından 4 mL tripsin-EDTA eklenir.
  5. 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın ve şişeleri parlak alan mikroskobu ile görselleştirerek tam ayrılmayı garanti edin. 4 mL tam DMEM ekleyerek nötralize edin.
  6. Hücreleri, tripan mavi dışlama sayımı gibi tercih ettiğiniz tekniklerle sayın.
  7. Hücre süspansiyonunu 200 x g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı aspire ederek konik tüpün dibinde bir hücre pelleti bırakın. Hücre pelletini uygun bir hacimde tam DMEM'de nazikçe triturasyon ile yeniden askıya alın.
  9. Dondurma için, %10 DMSO içeren tam ortamda yeniden süzülerek 1 x 106 hücre/mL elde edin. Organoid oluşumu için 1 x 106 hücre/mL elde etmek için tekrar süzülme yapın.

2. 3D alveoller epitelyal-fibroblast organoid modelinin olgunlaşmasının oluşturulması ve karakterizasyonu

NOT: Bodrum matrisi gece boyunca buzda çözülmeli ve bu aşamalarda buzda tutulmalıdır. Daha yüksek sıcaklıklar matrisin katılaşmasına neden olabilir.

  1. Bodrum matrisi ve gelişmiş DMEM karışımından oluşan 2:3 karışımı hazırlayın. Bu çözelti 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 300 μL eklenir; böylece her kuyunun altının eşit şekilde kaplanmasını sağlar. Plakayı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 1 saat boyunca kuluçka edin, böylece matriks katılaşabilir.
  2. Organoidler için kültür ortamı olacak tam DMEM'de %5 bazın matrisi çözümü hazırlayın. Her kuyu için, 60 μL taban matrisini 1.140 μL tam DMEM içinde seyreltirerek 1,2 mL bu çözelti alın.
  3. Bodrum matris karışımı katılaştığı sürede, 300.000 A549 hücresi ile 30.000 MRC-5 hücresi, 200 μL içinde tam DMEM'de hazırlanmış %5 taban matris çözeltisinde karıştırın.
  4. 2:3 bazal karışımı katılaştıktan sonra, A549/MRC-5 karışımından 200 μL pipetleyin ve ardından 24 kuyu plakasını 37 °C, %5 CO₂ altında 21 gün boyunca inkübe etmeye geri getirerek alveolar organoidlerin büyümesi ve farklılaşması sağlanır.
  5. Kültürleri sonraki 48 saat boyunca ışık mikroskobu altında görselleştirin. Hücreler bu zaman diliminde toplanmalıdır.
  6. %5 bodrum matrisi/DMEM çözümünü her 48 saatte bir 200 μL yeni 5% ortamla değiştirin. Hidrojelin içine gömülü organoidleri rahatsız etmemek için, plakayı nazikçe eğin ki eski çözelti aspirasyondan önce kuyu duvarı boyunca toplansın.
  7. Olgunlaşmanın 3., 9. ve 21. günlerinde, organoidleri 10x objektif büyütmede görüntüleyin ve her kuyunun dört temsilci görüntüsü veya görüş alanı alın. 3, 9 ve 21. günlerdeki erken organoid morfolojisinin temsilci görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir.
  8. Her görüş alanı için, çapı 50 μm'den büyük tüm organoitleri sayın. Görüş alanının bilinen alanını kullanarak, ortalama bir alan sayısından kuyu başına ortalama toplam organoid sayısını çıkararak, 24 kuyu plaka yüzey alanının 1,9 cm² olduğunu varsayılır.
    NOT: Bu analizler Fiji13 gibi görüntü analiz yazılımları kullanılarak yapılabilir.
  9. Organoidlerin ortalama çapı ve alanı da ölçülerek kültürdeki organoidlerin büyüme özellikleri hakkında nicel bilgi elde edilebilir.

3. 3D alveolar epitelyal-fibroblast organoidlerin toplanması

NOT: Organoidlerin hasadı için tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.

  1. 21 günlük olgunlaşmadan sonra, üst yüzeyi aspire edin ve yaklaşık 1-2 ml buz gibi soğuk PBS ile nazikçe yıkayın.
  2. 1-2 ml soğuk organoid hasat çözeltisi ekleyin ve tabağı 2-8 °C'de 30-90 dakika boyunca orta derecede sallayarak kuluçka yapın.
    NOT: Organoidler kuyunun dibinde yüzerken inkubasyonu durdurun.
  3. Dissosiyasyonu parlak alan mikroskopisi ile izleyin. Kuyunun altındaki bodrum matrisi artık görünmediğinde ve organoitler askıya alındığında ayrışma tamamlanmış sayılır. Bir hücre kazıyıcı, organoid-bazsal matris hidrojelini nazikçe yerinden çıkarmak ve süreci hızlandırmak için kullanılabilir.
  4. Tüm kuyunun içeriğini buz üzerinde 50 mL'lik konik bir tüpe halinde topla.
  5. Santrifüj 500 × g'de 2-8 °C'de 5 dakika koyun. Süpernatantı aspire edin, organoid pelleti 1-2 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın, ardından tekrar santrifüj yaparak bir pelet elde edin. PBS'yi aspire edin.

4. 3D kollajen gömülü alveolar-fibroblast organoidlerin oluşturulması ve mekanik zorlanma uygulaması

NOT: Hücre esneme biyoreaktörle uyumlu köpük çaplı dairesel köpük kültür plakaları kullanın. Bu protokolde kullanılan kültür plakasının büyüme alanı ~6,6cm2'dir.

  1. 2 mg/mL kolajen I jeli içeren çalışan bir çözelti hazırlayın. Çözelti 1× PBS, 11,4 mM NaOH ve 2 mg/mL kolajen I içermeli, son hacim steril suyla ayarlanmalıdır. Dairesel köpük 6-kuyu tabakasının her kuyusu için 2 mL bu kolajen I çözeltisi hazırlayın.
  2. Plakanın çevresindeki köpük ankrajlara 2 mg/mL kolajen I çözeltisinden 1 mL ekleyin, böylece tam doygunluk sağlanır.
    NOT: Köpük ankrajlar, doğru yapışma sağlamak için kolajen I çözeltisi ile iyice doydurulmalıdır. Eksik doygunluk, mekanik zorlanma uygulaması sırasında kolajen jelinin ayrılmasına yol açabilir ve hedeflenen hedefe kıyasla etkili bir deformasyonun azalmasına yol açabilir.
  3. Organoid pelleti 6 mL 2 mg/mL fare kuyruğu kolajeni ile tekrar askıya alın ve 1 mL süspansiyon pipetiyle 6 delikli dairesel köpük plakanın ortasına yerleştirin; böylece organoid ile enfekte edilmiş kolajen karışımının, dairesel köpük çapalarına eklenen ilk organoidsiz kolajenle karışmasını sağlar.
    NOT: Her kuyuya organoid süspansiyon eklerken baloncuklar oluşturmaktan kaçının.
  4. Plakaları bir kuluçka içinde (37 °C, %5CO2) bırakarak kollajen-I'i 1 saat boyunca polimerize edin. Polimerizasyondan sonra jel bulanık görünmelidir.
  5. 3D kollajen gömülü A549/MRC5 organoidlerinin üzerine 2 mL tam DMEM ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca kuluçka makinesine geri getirin.
  6. Kültür ortamını DMEM + %1 FBS ile değiştirin ve mekanik zorlanma maruziyetinden önce gece boyunca kuluçka yapın.

5. Hücre esnetme biyoreaktörünün kurulumu ve mekanik gerilime maruz kalması

  1. Taban plakasının her kuyusuna yükleme istasyonları yerleştirin. Bunlar, doku treni plakalarının esnek membranının etraflarında deformasyon yapmasını ve 3D kültürü denge eksenli gerilime maruz bırakmasını sağlayan altı adet 25 mm çapında yükleme direği içerir.
  2. Yükleme direklerinin üstüne ince bir silikon yağ tabakası uygulayın.
  3. Her 6 kuyruklu plakanın altına kırmızı contalar yerleştirin.
  4. Hazırlanan plakaları yükleme direklerinin üstündeki taban plakasına yerleştirin.
  5. Bu cihazı %5CO2 içeren 37 °C'lik, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine taşıyın ve hızlı bağlantı bağlantılarını taban plakasına bağlayın. 5.1'den 5.6'ya kadar olan adımları tekrarlayın, ancak bağlantıları çıkararak zorlanmayan bir kontrol oluşturun.
    NOT: Isteğe bağlı olarak, tek bir BioFlex kuyusunun dibine vakum basıncı uygulanmasını engelleyen ve aynı plakada zorlanmayan kontrol kültürünün üretilmesini engelleyen bir tüp sızdırmazlık durdurucu uygulanabilir.
  6. Üzerine bir Plexiglas levha ile örtün ve sıkı bir mühür sağlamak için ~5-10 lbs ağırlık ekleyin.
  7. Hava kompresörünü açın ve hava kompresöründen çıkış valfini açın.
  8. Vakum basınç pompasını açın ve vakum tankının çıkışına bağlı basınç rezervuarı valfini açın. Vakum basıncının yaklaşık 90 kPa olduğundan emin olun.
  9. Biyoreaktör kontrolörünün yakınında bulunan hava kompresöründen gelen giriş valfini açın. Basıncı havalandırma portunda 15 PSI'den fazla olmamasını sağlayın.
  10. Gemi yazılımını başlatın ve istenen döngüsel mekanik gerilme parametrelerini kurun. Bu çalışma için, 24 saat boyunca 0,4 Hz'de %18 deformasyon genliği uygulandı. Bunu yapılandırmak için yeni bir rejim oluşturun, minimum uzamayı %0, maksimum uzamayı %18'e ayarlayın ve protokolü başlatın.
  11. Gerilme seansı boyunca hareketin görünür olmasını sağlamak için plakayı ve zarı gözlemleyin. Zar yükleme direklerinin etrafında deforme olmalı.
  12. Su hapsındaki nemi periyodik olarak kontrol edin ve bilgisayar ekranında çalışma süresi, ilerleme ve sürün uygun morfolojisini gözlemleyin.
  13. Strain rejimi tamamlandıktan sonra temel plaka montajını ayırın ve gerilmiş kültürleri 24 saat kuluçkaya geri döndürün, ardından sonraki karakterizasyon analizleri yapılacak.
  14. Sistemi başlatma sırasının tersine çevirerek kapatın ve sökün: önce basınç rezervuarı valfini, vakum basınç pompasını, hava kompresörü çıkış valfini ve son olarak hava kompresörünü kapatın veya kapatın.
  15. Mekanik gerilmeye maruz kaldıktan sonra 24 saatlik kuluçkadan sonra süpernatantı toplayın. Kullanıma kadar -80 °C'de saklanın.

6. İmmünoflüoresans yoluyla organoidlerin morfolojik karakterizasyonu

  1. Organoid-kolajen jel modelini PBS ile üç kez yıkayarak 1 mL PBS nazikçe ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
  2. PBS'yi dikkatlice aspire edin ve yıkama işlemini toplamda üç kez tekrarlayın.
  3. Modeli, 4 °C'de 1 saat boyunca 2 mL %4 paraformaldehit inkübe ederek düzeltin.
  4. Modelleri yukarıda tarif edildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Kolajen jeli bağlı esnek kuyularda dairesel köpük ankrajları nazikçe kesmek için bir skarpel kullanın ve Petri kabına yerleştirin.
  6. Organoidleri, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS'de %0,1 Triton X-100 ile 2 mL inkübe ile geçirin.
  7. Modelleri PBS ile üç kez yıkayın.
  8. Oda sıcaklığında PBS'de 3 mL %5 sığır serum albümini (BSA) ile inkubasyon yoluyla modelleri inkubasyon yoluyla engelleyin. Bloklama çözümünü çıkarın ve bir sonraki adıma geçin.
  9. Modelleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin; anti-insan zonula occludens-1 (ZO-1) içeren boyama kokteyli ile 1:100 seyreltmede Alexa Fluor 594 ile konjuge edilmiş, F-aktinin değerlendirilmesi için 1:1000 seyreltmede Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş falloidin ve 1:4000 seyreltmede nükleer leke DAPI ile konjuge edilmiştir. Sulandırıcı PBS'de %1 BSA'nın 1 mL miktarıdır. Kuluçka öncesi plakanın kenarlarını 4 °C'de bantlayın.
  10. Ertesi gün boyama kokteyl çözeltisini aspire edin ve modelleri PBS ile üç kez yıkayın.
  11. Konfokal mikroskopla görüntü alın ve temsil organoidlerden 5 μm dilimlerde 40x objektif büyütmede Z-yığınları alın.
  12. Fiji görüntü analiz yazılımı kullanarak floresans yoğunluğunu analiz edin. Farklı çevresel koşullar arasında doğru karşılaştırma sağlamak için organoid alanıyla ortalama floresans yoğunluğunu normalize edin.

7. ELISA ve laktat dehidrojenaz (LDH) sitotoksisite testi ile organoidlerin fonksiyonel karakterizasyonu

  1. Üreticinin protokolüne göre ticari olarak mevcut ELISA kitleri kullanarak buz üzerinde süpernatantları eritin ve interlökin-6 (IL-6) ile interleukin-8 (IL-8) salgısını değerlendirin.
  2. Ticari olarak mevcut bir LDH absorbans testi kullanarak sitotoksisite belirtecisi olan LDH salınımını değerlendirin.
  3. Rekombinant LDH proteini kullanarak 0,5 μg ile 0,5 ng arasında yarı-log konsantrasyonlarda standart bir eğri oluşturun. Her örnekten LDH konsantrasyonlarını standart eğri kullanarak interpolasyon yapın.

8. Isteğe bağlı: RNA veya protein analizleri için örneklerin izolasyonu

  1. İmmünoflüoresans boyama için %4 paraformaldehit eklemek yerine, 1 mL RLT'ye 10 μL içinde β-merkaptoetanol içeren hazırlanmış RLT tamponu ekleyin.
  2. Model başına 300 μL kullanın ve hücreleri tamamen ayırmak ve lizlemek için yukarı aşağı pipet yapın.
  3. Lizatı RNazsız bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri kuru buz üzerine yerleştirerek hızlı dondurun. Uzun süreli depolama için -80 °C'ye aktarın.
    NOT: Alternatif olarak, protein çıkarımı için RIPA tamponu şu şekilde kullanılabilir: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4-7.5; 150 mM NaCl; %1 NP-40 veya Triton X-100; %0,5 sodyum deoksikolat; Deiyonize suda %0,1 SDS. Hazır hazırlanmış RIPA tamponu da ticari olarak mevcuttur.
  4. Her model başına 200 μL ekleyin, 5 dakika buzda koyun, sonra lizatı toplayın.
  5. 15.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca döndürün, pellet hücre kalıntılarını biriktirin ve uzun süreli depolama için -80 °C'ye aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre hattı kaynaklı alveolar epitelyal-fibroblast organoidler belirlendi ve 21 günden fazla süre kültürlendi. Bu süre boyunca morfolojik değişiklikler gözlemlendi; organoid sayısı, alan ve çapı 3., 9. ve 21. günlerde ölçülerek büyüme ve gelişim izlendi. Kuyu başına organoid sayısı, 9. ve 21. günlerde 3. güne kıyasla anlamlı şekilde azalmıştır (Şekil 2A). Buna karşılık, ortalama organoid alan ve çapı 9. ve 21. günlerde önemli ölçüde arttı; bu da büyüme ve ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) alveolar epitelyal-fibroblast organoidler, mekanik yük altında akciğer yapısı ve fonksiyonunu modellemek için fizyolojik olarak son derece önemli bir platform sunar. 2D veya hatta 3D ortak kültür sistemlerinin aksine, organoidler in vivo akciğer mikroçevresinin kritik özelliklerini, mekansal organizasyon, epitelyal-mezenkimal çapraz konuşma ve ekstraselüler matriks (ECM) etkileşimlerinikorur 14. Mekanik zorlanma, astım, KOAH ve ventilatör ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel çıkar çatışması olarak değerlendirilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin tamamlanmasını sağlayan katkıları sayesinde Providence Hava Yolu Merkezi'nin desteğini takdir etmektedir. Bu çalışma, MITACS (ID IT27789) tarafından, Providence Hava Yolu Merkezi (PAC) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) (IDs AWD-024378 ve AWD-024440) ile iş birliği içinde finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüEppendorf0030 125.215
15 mL konik tüpFisher Scientific14-959-53A
%16 paraformaldehitThermo Fisher Scientific28908
2-merkaptoetanolMillipore SigmaM3148
50 mL konik tüpFisher Scientific14-432-22
6-kuyu (esnek zar) Tissue Train dairesel köpük plakasıFlexcell InternationalTTCF-5001
A549 hücreleriAmerikan Tip Kültürü Koleksiyonu (ATCC)CCL-171
Hava kompresörüCalifornia Air Tools10020DSPCAD
Sığır serum albüminiMillipore SigmaA9418
Buffer RLTQiagen79216
CO2 Kuluçka MakinesiPHCBIMCO-170AICUVL-PA
Cultrex organoid hasat çözümüBio-Techne3700-100-01
CyQUANT LDH sitotoksisite test kitiThermo Fisher ScientificC20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimetil sülfoksitSigma AldrichD2650-100ML
Dulbecco' ' modifiye edilmiş Eagle' s ortamı (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092
EVOS XL Çekirdek mikroskobuThermo Fisher ScientificAMEX1200
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher ScientificA5209501
Fiji görüntü analiz yazılımıUlusal Sağlık Enstitüleri
Flexcell FX-6000 Gerilim ve Doku Tren sistemi (Flexlink FX-6000 Gerilim kontrolörü, basınç rezervuarı, taban plakası, akrilik pencere, 25 mm çapında silindirik yükleme istasyonları, su tuzağı, FlexSoft FX-6000 V1.0 yazılımı ve çeşitli borular içerir)Flexcell InternationalFX6000T
İnsan İnterlökin-6 Çift Setli ELISABio-TechneDY206
İnsan İnterlökin-8 Duoset ELISABio-TechneDY208
Leica DMi8 konfokal mikroskobuLeica Microsystems11889122
Matrigel Bazal Zar MatrisiCorning356237
MRC-5 hücreleriATCCCCL-185
ParafilmMillipore SigmaP7793
Penisilin/streptomisin (Pen/Streptokok)Thermo Fisher Scientific15140122
Falloidin etiketleme probları, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)Thermo Fisher Scientific14190-144
Fare kuyruğu kolajeni ISigma-AldrichC3867
Rekombinant insan laktat dehidrojenaz proteini (aktif)AbcamAb93699
RIPA liz tamponuThermo Fisher Scientific89901
RNase-free mikrofuge tüpleriThermo Fisher ScientificAM12400
T75 cm2 kültür şişesiGreiner658175
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
ZO-1 monoklonal antikor (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594Thermo Fisher Scientific339194

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knudsen, L., Ochs, M. The micromechanics of lung alveoli: structure and function of surfactant and tissue components. Histochem Cell Biol. 150 (6), 661-676 (2018).
  2. Novak, C., Ballinger, M. N., Ghadiali, S. Mechanobiology of pulmonary diseases: a review of engineering tools to understand lung mechanotransduction. J Biomech Eng. 143 (11), 110801(2021).
  3. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  4. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 350 (26), 2645-2653 (2004).
  5. Bidan, C. M., Veldsink, A. C., Meurs, H., Gosens, R. Airway and extracellular matrix mechanics in COPD. Front Physiol. 6, 346(2015).
  6. Burgess, J. K., Gosens, R. Mechanotransduction and the extracellular matrix: key drivers of lung pathologies and drug responsiveness. Biochem Pharmacol. 228, 116255(2024).
  7. Harris, C., et al. An in vitro investigation of the inflammatory response to the strain amplitudes which occur during high frequency oscillation ventilation and conventional mechanical ventilation. J Biomech. 88, 186-189 (2019).
  8. Xu, Y., et al. Strain analysis in patients at high risk for COPD using four-dimensional dynamic-ventilation CT. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 17, 1121-1130 (2022).
  9. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  10. Al Yazeedi, S., Guo, T. J. F., Sohd, J., Abokor, F. A., Osei, E. T. Dynamic mechanical stimulation of alveolar epithelial-fibroblast models using the Flexcell tension system to study lung disease mechanisms. Front Med. 12, 1552803(2025).
  11. Guo, T. J. F., Faiz, A., Osei, E. T., Pouwels, S. D. Editorial: Next generation in vitro models to study chronic pulmonary diseases, volume II. Front Med. 12, 1683514(2025).
  12. Lim, M. J., Kim, S. J., Jo, A., Kim, S. W. Enhanced application potential of alveolar organoids through epithelial and niche cell interactions. Sci Rep. 15 (1), 17538(2025).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Purev, E., Bahmed, K., Kosmider, B. Alveolar organoids in lung disease modeling. Biomolecules. 14 (1), 115(2024).
  15. Manuyakorn, W., et al. Mechanical strain causes adaptive change in bronchial fibroblasts enhancing profibrotic and inflammatory responses. PLoS One. 11 (4), e0153926(2016).
  16. Kılıç, A., et al. Mechanical forces induce an asthma gene signature in healthy airway epithelial cells. Sci Rep. 10 (1), 966(2020).
  17. Tam, A., et al. Hedgehog signaling as a therapeutic target for airway remodeling and inflammation in allergic asthma. Cells. 11 (19), 3016(2022).
  18. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. J Allergy Clin Immunol. 134 (3), 509-520 (2014).
  19. Ivanov, A. I., Parkos, C. A., Nusrat, A. Cytoskeletal regulation of epithelial barrier function during inflammation. Am J Pathol. 177 (2), 512-524 (2010).
  20. Barnett, K. C., et al. An epithelial-immune circuit amplifies inflammasome and IL-6 responses to SARS-CoV-2. Cell Host Microbe. 31 (2), 243-259.e6 (2023).
  21. Li, Y., et al. HB-EGF-induced IL-8 secretion from airway epithelium leads to lung fibroblast proliferation and migration. BMC Pulm Med. 21 (1), 347(2021).
  22. Guo, T. J. F., Singhera, G. K., Leung, J. M., Dorscheid, D. R. Airway epithelial-derived immune mediators in COVID-19. Viruses. 15 (8), 1655(2023).
  23. Thomas, D., Choi, S., Alamana, C., Parker, K. K., Wu, J. C. Cellular and engineered organoids for cardiovascular models. Circ Res. 130 (12), 1780-1802 (2022).
  24. Li, K., He, Y., Jin, X., Jin, K., Qian, J. Reproducible extracellular matrices for tumor organoid culture: challenges and opportunities. J Transl Med. 23 (1), 497(2025).
  25. Vande Geest, J. P., Di Martino, E. S., Vorp, D. A. An analysis of the complete strain field within Flexercell membranes. J Biomech. 37 (12), 1923-1928 (2004).
  26. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Front Physiol. 11, 566(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor
Posted by JoVE Editors on 8/19/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69447

Etiketler

3D KolajenA549 H creleriMRC 5 FibroblastlarMekanik GerinimEpitelyal Fibroblast Organoidlerimmunboyama Mark rleriOrganoid KarakterizasyonuMekanotransd ksiyon
Video yakında

İlgili makaleler