Yöntem makalesi

In vitro Bakteriyel Ubiquitinasyonun Yeniden Yapılandırılması ve VCP/p97 aracılı Eliminasyonun Yeniden Yapılması

DOI:

10.3791/69454

⸱

2 Ocak 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Streptococcus pneumoniae'nin memeli hücre lizat veya saf ubiquitin enzim kompleksi kullanılarak ubiquitinasyon yöntemini tanımlar; ardından arıtılmış VCP/p97-UFD1-NPLOC4 protein kompleksiyle tedavi edilip, bakteriyolitik aktivitesini değerlendirir; böylece ubiquitin bağımlı bağışıklık efektörlerinin incelenmesi mümkün olur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitinasyon, sitozolik bağışıklıkta kritik rol oynayan çok yönlü bir translasyon sonrası modifikasyondur. Konak hücrelerin istilası sırasında, patojenik bakteriler başlangıçta bir endozom içinde kapanır; buradan kurtulur ve lizozomal bozulmadan kaçınmak için sitozole kaçarlar. Sitozole girdikten sonra, bakteriler konak E3 ligazları tarafından hızla ubiquitin zincirleriyle etiketlenir ve otofaji ve proteasom dahil olmak üzere birden fazla efektör yol aracılığıyla temizlenme için işaretlenir. Bireysel yolların bakteriyel eliminasyona katkısını tanımlamak için, in vitro yeniden yapılandırma kontrollü ve net bir yaklaşım sunar. Burada, Streptococcus pneumoniae (SPN) modeli bakteriyel patojen olarak, memeli hücre lizatları veya saf ubiquitin enzim kompleksi kullanılarak ubiquitinasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; ardından arıtılmış VCP/p97-UFD1-NPLOC4 kompleksiyle tedavi uygulanarak bakteriyolitik aktivitesinin diğer hücresel faktörlerden bağımsız olarak değerlendirilmesini sağlıyoruz. Genel olarak, bu prosedür, bağışıklık bağlantılı ubiquitin ligazlar ve efektörlerin işlevini hücresiz bir bağlamda aydınlatma potansiyeline sahiptir; bu tür mekanizmaların diseksiyonu sağlam hücrelerde zorlayıcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitin (Ub), hedef substratları C-terminal glisine kovalent olarak bağlayarak modifiye eden küçük, 8,6 kDa'lık bir proteindir ve ubiquitination1 adı verilen süreçte ε-amino grubu lizin kalıntılarıyla izopeptid bağı oluşturur. Bu olgu, E1 ubiquitin aktive edici enzim, E2 ubiquitin konjuge edici enzim ve E3 ubiquitinligazı 1,2,3 içeren bir dizi düzenlenmiş adımla yönetilir. Ub, yedi lizin kalıntısı (Linear/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 ve K63) üzerinden monomer veya farklı uzunluklarda zincirler olarak bağlanabilir.4. Bu benzersiz Ub zincirleri, proteazomal bozulma, hücresel trafik, DNA onarımı ve seçici otofaji 3 gibi çeşitli hücresel işlevler için moleküler belirteç olarak görev yapar.

Ubiquitinasyonun kanonik rolü uzun süredir hücresel homeostazın korunmasıyla ilişkilendirilmiş olsa da, örneğin proteasomlar aracılığıyla yanlış katlanmış proteinleri bozmak veya belirli yükleri seçici otofajiye yönlendirmek gibi nedenlerle, ubiquitin'in bakteriyel enfeksiyonlara karşı sitozolik bağışıklık sisteminin kritik bir algılama mekanizması olarak da işlev gördüğü artık açıktır. Hücre içi bakteriler, ekstrahücre bağışıklık yanıtıyla tespit edilmemek için sık sık konak hücrelere sızır ve korunaklı bir ortamda üremekiçin 7,8. Birçok patojen, onları taşıyan vakuollere geri dönülmez zarar vermek için sekretor sistemler ve toksinler kullanır; böylece sitozolun içine kaçarak besin 9,10 elde edilir. Sitosol'e girdikten sonra, bu bakteriler belirli E3 ligazlarla poliubiquitin zincirleriyle süslenir; bu zincirler moleküler bir "ölüm etiketi" olarak görev yapar ve onları seçici eliminasyona yönlendirir. Örneğin, E3 ligaz SMURF1, Mycobacterium tuberculosis'i doğrudan yüzeyinde K48 bağlantılı poliubiquitinasyonu başlatarak ve bu da proteasom11 aracılığıyla bozulmaya yol açar. Parkin, bakteri içeren vakuollarda birikir ve K63 bağlantılı ubiquitinzincirleri 12'yi oluştururken, ARIH1 ve LRSAM1 sırasıyla K48 ve K6 zincirlerine sahip bakterilerin yüzeylerini değiştirerek bakteri büyümesiniengeller 13,14. E3 ligazların çoğu öncelikle ana protein substratlarını hedef alırken, bazı ligazlar mikrobiyal bileşenler için belirgin bir özgüllük gösterir. RNF213, Salmonella enterica serovar Typhimurium15'te bulunan lipopolisakkaridleri (LPS) tanımlar ve ubiquitinasyonlar; SCFFBXO2 kompleksi, Grup A Streptococcus'ta bulunan bakteriyel glikanları ubiquitination16 için bir substrat olarak tanır ve ksenofajiyi kolaylaştırır. SCFFBXW7 kompleksi ise, Streptococcus pneumoniae (SPN) yüzey proteinlerindeki degron motiflerini tanır. Bunlar arasında β-galaktosidaz A (BgaA) ve Pnömokok yüzey proteini A (PspA) bulunur; bunlar K48 bağlantılı poliubiquitin zincirleriyle etiketlendikten sonra K48 bağlantılı Ub-spesifik antikor kullanılarak doğrulanmıştır; muhtemelen proteazomal sistemi çekerek etkili bakteriyeleliminasyona olanak tanır 17.

Bu sitozolik istilacıların ubiquitin ile etiketlenme süreci iyi anlaşılmış olsa da, proteazomal sistemin bu kadar büyük mikrobiyal varlıkları nasıl ortadan kaldıracağı sonraki mekanizma şüphelidir. Son araştırmalar, konak AAA+ ATPaz, VCP/p97 (Valosin içeren protein) bu süreçte kritik bir rol oynadığını ortaya koymuştur. UFD1 ve NPLOC4 gibi kofaktörlerle iş birliği içinde, VCP poliubiquitin ile işaretlenmiş bakterileri tespit edebilir ve bakteriyel zardan ubiquitinated proteinleri fiziksel olarak çıkararak onları patlatır ve proteazomal mekanizmaya bağlı olmadan sitozolik ortamdan atılmasına yardımcıolur 18.

Konak sitozol, patojenlerin uzaklaştırılmasını garanti etmek için paralel ve güvenli bir şekilde çalışan karmaşık bir bağışıklık yolları ağı içerir. Bu gereklilik, güçlü bir savunma için kritik öneme sahiptir, ancak bireysel bağışıklık faktörlerinin rolünü tanımlama ve inceleme çabalarınızorlaştırır. Bu bağlamda, in vitro yeniden yapılandırma sistemleri, kontrollü koşullar altında belirli yolları analiz etmek için faydalı bir platform sunar. Burada, memeli hücre lizatları veya E1-E2-E3-Ub enzimleri ile saflaştırılmış konak etkileyici kompleksleri kullanılarak SPN'nin ubiquitinasyonu ve canlılık kaybı sürecini özetleyen hücresiz bir sistem sunuyoruz. Bu iki aşamalı protokolde, önce bakteriler üzerinde poliubiquitin zincirlerinin konjugasyonunu kolaylaştırıyor, ardından bunların VCP/p97 ile UFD1 ve NPLOC4 ile ilişkilendirilerek eliminasyonunu değerlendiriyoruz. Bu yolu in vitro yeniden oluşturarak, hücresel karmaşıklıkları atlarız ve özellikle VCP'nin patojeni nötralize etme yeteneğini araştırırız. Bu kesin kurulum, substrat tanıma, zincir özgüllüğü, efektörün eylem modu ve etkili bir yanıt başlatmak için gerekli temel bileşenlerin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü ve lizat hazırlığı

  1. A549 hücrelerini eritin ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile tam DMEM kullanarak T25 şişesinde yetiştirin. %5CO2 ile nemlendirilmiş bir ortamda 37 °C'de kuluçka yapın. Hücreleri bakım için üç geçişten geçirin, ardından 2 ×10-6 hücreyi bir T75 şişesine aktarın. Kültür, hücre yoğunluğu 8-10 × 10-6 hücreye ulaşana kadar devam edin.
  2. Hücreleri, pH 7.4'te 200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl ve %5 gliserol içeren reaksiyon tamponu ile 4 °C'de T75 termosundan kazıyın. Kazınan hücreleri 120 × g ile 10 dakika boyunca santrifüjlenerek pellet yapın, ardından reaksiyon tamponunda tekrar süzülerek yaklaşık 0,6 mL nihai hacmi 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde elde edin.
    NOT: Tüm örnek buzda işlenmelidir.
  3. Hücre süspansiyonunu dar bir prob (çapı ucu 2 mm) ile 40 μm genlikte, 2 s açı/kapama darbeleriyle 2-2,5 dakika boyunca sonikle sonikleştirin, karışım buz üzerinde tutulur. Soniklenmiş örnekleri 21.000 × g ile 45 dakika boyunca santrifüjleyin, ortaya çıkan süpernatantı toplan ve 2-3x 50x proteaz inhibitörü kokteyli ekleyin.
    NOT: Ya lizati aynı gün ubiquitinasyon reaksiyonu için hemen kullanın ya da sıvı azotla ani dondurup -80 °C'de saklayın; Ancak, etkili bir ubiquitinasyon için en fazla 3 gün içinde kullandığınızdan emin olun. 2 ila 4 mg/mL arasında değişen lizat konsantrasyonu ubiquitinasyon için uygundur.

2. Bakteriyel kültür

  1. Bakteri, Streptococcus pneumoniae (SPN) R6 sürünü (Serotip II), gece boyunca 37 °C'de, %5 CO2 ile Todd Hewitt et suyu tozu (3,7 g/100 mL) ve maya ekstraktı tozu (1,5 g/100 mL) içeren THY ortamında yetiştirin.
    NOT: Ortam koyu kahverengi renkte değiştiyse bakteriyi aşılamaktan kaçının. Streptococcus pneumoniae , Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) patojenek olarak sınıflandırılır; önlemler alın ve sertifikalı bir biyogüvenlik kabini kullanımı dahil olmak üzere doğru BSL-2 muhafaza protokollerine uyun.
  2. Ertesi gün, gece kültüründen 37 °C'de %5CO2 ile taze THY ortamına (1:10) aşılanın ve SPN'yi 600 nm (OD600 nm) Optik Yoğunluğu 0,4'e ulaşana kadar büyütün. SPN (900 μL SPN kültürü ve 600 μL gliserol) (%50) gliserol stoku hazırlayın ve -80 °C'de saklayın.
  3. Ubiquitination deneyi gününde, yeni bir SPN stokunu -80 °C'den eritip tamamen 5 mL THY ortamına aşılayın ve OD600 nm 0.4'e ulaşana kadar büyümesine izin verin.
    NOT: Bakteriyel kültür, yaklaşık 10,8 SPN hücresi başınayaklaşık 10,8 SPN hücresine karşılık gelen 0,4 nm OD 600 nm'ye kadar yetiştirildi. Bu korelasyon, koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılması ile belirlendi; kültür 1x PBS ile seri seyreltilerek bakteriyel hücre konsantrasyonunu azaltarak sayılabilir koloniler elde edilebilecek ve THY'den daha zengin bir ortam olan BHI agar plakalarında lekelenme yapıldı.

3. Memeli lizatından in vitro ubiquitination testi

  1. Yaklaşık 10-7 SPN hücresi alın ve reaksiyon tamponu ile (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl ve pH 7.4'te %5 gliserol) en az üç kez iyice yıkayarak bakterileri bir sonraki tamponda yeniden süsle alın, ardından 21.000 × g 5 dakika boyunca santrifüjle 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 21.000 × g ile peletlenerek sonuna kadar sertleştirin.
  2. SPN pelletini A549 memeli hücre lizat ile birlikte saflaştırılmış ubiquitin (350 μM) ve 1 mM ATP ile yeniden süsküyerin ve 27 °C'de 1-2 saat kuluçka yapın.
    NOT: Memeli hücre lizatını dondurmaktan ve eritmekten kaçının. Lizatın ubiquitinasyon testinin yapıldığı gün hazırlanması en iyisidir.
  3. İnkubasyon sonrası, bakteriyi 1 M Urea içeren reaksiyon tamponu ile bir kez yıkanın, ardından sadece reaksiyon tamponu ile iki yıkama ve %1 paraformaldehit (PFA) ile fiksasyon yapılır. Fiksasyondan sonra, hücreleri 15 dakika boyunca glisin içeren PBS (1 mg/mL) ile kuluçka edin, ardından iki adet 1x PBS yıkaması yapılsın.
    NOT: 1 M üre yıkaması, kovalent olmayan etkileşimleri hafifçe bozmak için kullanılır ve böylece sadece kovalent olarak ubiquitinated bakteriler kalmıştır. Sonrasında, kalıntı üreayı çıkarmak için reaksiyon tamponu ile iyice yıkanmak önemlidir; çünkü üre, varlığı in vitro öldürme testini etkileyebilir.
    Negatif kontrol olarak, tüm reaksiyon karışımını hazırlayın ve enzimatik aktiviteyi engellemek için buz üzerindeki bakterilerle kuluçka yapın. İnkubasyondan hemen sonra örneği durulayın ve reaksiyonun durumunu korumak için %1 PFA ile sabitleyin.

4. E1-E2-E3 enzim kompleksinden in vitro ubiquitination testi

  1. Önce ubiquitin (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 kompleksi (500 nM) ve 2 mM ATP içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın (200 mM HEPES, 100 mMMgCl 2, 1 M KCl ve pH 7.4'te %5 gliserol), böylece toplam reaksiyon hacmi 100-150 μL olur.
    NOT: Tüm enzimleri -80 °C'de sakla. Birden fazla donma-erime döngüsünden oluşarak aktivite kaybını önlemek için, küçük aliquotlar oluşturun ve her ubiquitinasyon reaksiyonu için yenilerini kullanın.
  2. Bakteriyi (107 CFU) bu ubiquitin enzim içeren reaksiyon karışımına yeniden süslü bırakın ve 27 °C'de 2 saat kuluçka yapın. Daha sonra, bakteriyi en az 3 kez 1 M üre içeren reaksiyon tamponu ile yıkanır, ardından %1 paraformaldehit (PFA) ile fiksasyon yapılır. Fiksasyondan sonra, hücreleri 15 dakika boyunca glisin içeren PBS (1 mg/mL) ile kuluçka edin, ardından iki adet 1x PBS yıkaması yapılsın.
    NOT: Aşırı hücre kaybı varsa, yıkama sayısı azaltılabilir.

5. Ubiquitinated bakterilerin görselleştirilmesi

  1. Numuneyi %1 PFA ile sabitledikten sonra, %3 BSA'da 1 saat boyunca 27 °C'de kuluçka yapın, ardından 1x PBS ile iki yıkama yapın.
  2. Ubiquitinated bakterileri, immünfloresan testlerinde genellikle kullanılanlardan daha yüksek konsantrasyonlarda birincil bir antikor kullanarak yeniden süsyemeye alın. Bakteriye özgü bir antikor ile birlikte %1 BSA içeren PBS ile seyreltilmiş anti-ubiquitin antikoru (1:100) kullanarak 27 °C'de 1 saat boyanma yapın.
    NOT: Optimal antikor boyama için, antikor kaybını en aza indirmek için düşük protein bağlayıcı santrifüj tüpü kullanın veya en iyi sonucu almak için daha yüksek bir antikor konsantrasyonu kullanın.
  3. Daha sonra bakterileri 1x PBS ile iki kez yıkayın ve ardından karşılık gelen ikincil antikorla sırasıyla Alexa Fluor 488 ve 555 ile konjuge edilmiş, 27 °C'de 1 saat boyunca tekrar süzülür.
  4. Etiketlenmiş bakteri örneğini yaklaşık 10-20 μL drop dökümle uygulayın ve DAPI ile veya olmadan 5-10 μL montaj ortamı karıştırın, ardından üzerine bir örtü yapıştırın ve fazla sıvıyı emek için mendil kağıdı kullanın. Son olarak, aynı gün örneği konfokal mikroskop altında gözlemleyin.

6. Protein ifadesi ve arındırılması

  1. Vahşi tip VCP/p97'nin ifadesi için, VCP içeren pET28a plazmidini standart bir E. coli dönüşümprotokolü 20 ile E. coli BL21-DE3 suşuna dönüştürün. Dönüşümden sonra bir gece boyunca 37 °C'de Luria çorbasında (LB) kuluçka kolonileri oluştu. Ertesi gün, 1:50 kültürünü iyi havalandırılmış LB içeren bir şişeye aşılayın veOD 600 nm 0.7-0.8'e ulaşana kadar büyümesine izin verin. Kültüre 200 μM IPTG eklenir ve 37 °C'de 5 saat boyunca 180 rpm'de çalkalama ile inkübe edilir; SDS-PAGE kullanarak protein ifadesini doğrulayın.
    NOT: Tüm bakteriyel büyüme ve ifade aşamasında, Kanamisin (50 μg/mL) seçim basıncı olarak kullanılmıştır.
  2. Vahşi tip UFD1'in ifadesi için, UFD1 içeren pET41b plazmidini standart E. coli dönüşümprotokolü 20 ile E. coli BL21-Rosetta suşuna dönüştürün. Dönüşümden sonra bir gece boyunca 37 °C'de Luria çorbasında (LB) kuluçka kolonileri oluştu. Ertesi gün, 1:50 kültürünü iyi havalandırılmış LB içeren bir şişeye aşılayın veOD 600 nm 0.7-0.8'e ulaşana kadar büyümesine izin verin. Kültüre 1 mM IPTG ekleyin ve 37 °C'de 5 saat kuluçka yapın, 180 rpm'de çalkalayın; SDS-PAGE kullanarak protein ifadesini doğrulayın.
  3. Vahşi tip NPLOC4'ü ifade etmek için, NPLOC4 içeren pET41b plazmidini standart E. coli dönüşümyöntemi 20 kullanılarak E. coli BL21-Rosetta suşuna dahil edin. Luria çorbasındaki (LB) dönüşümden oluşan kolonileri gece boyunca 37 °C'de kuluçka altına alın. Ertesi gün, kültürün 1:50 seyreltmesini LB ile dolu iyi havalandırılmış bir şişeye aktarın ve optikyoğunluğu OD 600 nm'de 0.7-0.8'e ulaşana kadar büyümesine izin verin. Bundan sonra, kültüre 1 mM IPTG eklenin ve 18 °C'de 16 saat boyunca kuluçka sürecine devam edin ve 180 rpm'de çalkalayın; SDS-PAGE analizi yaparak protein ifadesini doğrulayın.
    NOT: E. coli BL21-Rosetta suşunda yapılan tüm bakteriyel büyüme ve ifade adımı için, seçim basıncı olarak Kanamisin (50 μg/mL) ve Kloramfenikol (20 μg/mL) kullanıldı. pET28a-p97 ve pET41b-NPLOC4 dizileri, Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
  4. Protein ekspresyonundan sonra, bakteri hücrelerini 21.000 × g ile 10 dakika boyunca santrifüj edin ve pelleti 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM PMSF, %5 gliserol, pH 8 içeren liz tamponunda yeniden süzülür.
  5. Hücreleri dar bir prob (uç çapı, 6 mm) kullanarak 50 μm genlikte 1 saat boyunca soniklenin ve 4 °C'de 20 saniyelik açıp-kapama darbesiyle alın. 15.000 × g kullanarak 1 saat boyunca enkazı pellet ile süpernatı toplayın.
    NOT: Toplam sonikasyon 1 saat (30 dakika ON ve 30 dakika OFF 20 saniyelik darbeler olarak) gerçekleştirildi ve süreç, bulanık hücre süspansiyonu saydam hale gelene kadar devam etti. Yüksek hızlı santrifüjleme, hücre kalıntılarının pellet halinde kalmasını ve lizatın protein arıtma kolonuna yüklenmesi sırasında yerinden çıkmamasını sağlamak için gereklidir.
  6. Süpernatantı 0,4 μm filtreden geçirin ve affinite arındırması için Ni-NTA boncuklarıyla dolu kolona yükleyin; önceden arıtma tamponu ile dengelenir (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, %5 gliserol, pH 8).
  7. Protein açısından zengin kolon, 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, %5 gliserol, pH 8 ve yaklaşık 400 mL imidazol içeren 30-60 mM imidazol içeren yıkama tamponu ile durulayın ve ardından proteini 50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-merkaptoetanol, %5 gliserol, pH 8 ve 250 mM imidazol içeren bir elülasyon tamponu ile elüasyon ile elüasyonla elüasyonla yapın.
    NOT: İmidazole konsantrasyonu ve yıkama hacmi, analiz edilen spesifik proteine göre değişebilir. Saflığı değerlendirmek için SDS-PAGE yapılmalıdır. Kolonun, eluent Bradford reaktifiyle negatif reaksiyon gösterene kadar iyice yıkamak şarttır. Elulanan fraksiyon, hedef proteinin belirgin ve yoğunlaştırılmış bir bandını gösterir; bu bant çoğunlukla örneği temsil etmelidir; diğer proteinlerin ise çok az izi vardır.
  8. Çeşitli fraksiyonları toplayın, bunları SDS PAGE ile analiz ederek hangi fraksiyonların saf proteinleri içerdiğini belirleyin ve ardından PD-10 kolonunu kullanarak reaksiyon tamponu (200 mM HEPES, 100 mM MgCl 2, 1 MKCl ve pH 7.4'te %5 gliserol) tampon değişimi gerçekleştirin.
    NOT: Protein konsantrasyonunu Bradford Reaktifi (Coomassie Brilliant Blue G-250) ile ölçün. Tüm proteinler sıvı azotta hızlı dondurulup -80 °C'de saklanmalıdır.

7. In vitro bakteriyel öldürücü test

  1. 6 μM VCP/p97 ile 1 μM NPLOC4 ve UFD1 karışımını birleştirin, ardından hacmi yaklaşık 90 μL olarak reaksiyon tamponu ile doldurun. Bu reaksiyon karışımının buz üzerinde 2 saat kuluçka olmasına izin verin.
  2. P97-UFD1-NPLOC4 içeren reaksiyon karışımına 1-2 mM ATP ekleyin ve ardından ubiquitinated SPN (107 hücre) ile 37 °C'de 2 saat süreyle birleştirin.
  3. Bakteriyel yaşamı değerlendirmek için, tedaviden hemen sonra, reaksiyon karışımından 1 μl aliquot alın, seri bir sulandırma (1:1, 1:10, 1:100 ve 1:1000) uygulanır ve her seyreltmeden 10-2 μL Beyin Kalp İnfuzyonu (BHI) agar plakalarına yerleştirilir. Bu prosedür, 2 saat kuluçkadan sonra reaksiyondan alınan 1 μL aliquot kullanarak tekrarlayın.
    NOT: Daha iyi sonuçlar için tüm seyreltmeleri tespit edin.
  4. 0 saat ile 2 saat arasındaki koloni oluşum birimlerini (CFU) değerlendirin. Bakteriyel canlılığı (%) hesaplayın; 2 saat içindeki CFU sayısını 0 saat içindeki CFU sayısına bölerek ardından sonucu 100 ile çarpın.
    NOT: Daha güvenilir sonuçlar elde etmek için, ısıyla denatüre edilmiş VCP/p97, UFD1-NPLOC4 kofaktör kompleksi içermeyen VCP/p97 veya ATPaz eksikliği olan VCP/p97 varyantını negatif kontrol olarak karşılaştırmak için kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolümüz, memeli A549 hücrelerinin ubiquitinasyon sürecini başlatmak için gerekli bileşenler açısından zengin bir hücre lizat üretmek amacıyla kullanımını detaylandırmaktadır (Şekil 1A). Bu lizat, ister yoğunlaştırılmış durumda olsun ister UBE1 (E1 ubiquitin aktive edici enzim), UbE2C (E2 ubiquitin konjuge enzim) ve Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 kompleksi (E3 ubiquitin ligaz) gibi saflaştırılmış bileşenlerle değiştirilerek bakterilerin in vitro ubiquitina...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada detaylandırılan in vitro yeniden yapılandırma sistemi, bakteriyel ubiquitinasyon ve eliminasyonun moleküler karmaşıklıklarını araştırmak için sağlam bir çerçeve sunarken, birkaç önemli sınırlama dikkate alınmalıdır. Arındırılmış proteinlerin suprafizyolojik konsantrasyonlarına olan bağımlılık, ubiquitinasyon mekanizması (E1, E2, E3 ligazlar, ubiquitin) ve konak efektör kompleksi (VCP/p97, UFD1, NPLOC4) gibi faktörler, patojenlerin ubiquitinasyonu ve temizlenmesi hakkında ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IIT Bombay'deki Biyo-güvenlik Seviye 2 Tesisi ve Konfokal Mikroskopi Tesisine teşekkürlerimizi sunarız. Sourav Ghosh. (17/06/2018(i) EU-V), Sumit Rakshit (221610197857) ve Udit Kumar Das (24D0061) sırasıyla CSIR, UGC, Hindistan Hükümeti ve IIT Bombay bursları almıştır. Anirban Banerjee, Hindistan Hükümeti Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu'ndan (Hibe Numarası SPR/2019/000808) ve Ignite Yaşam Bilimleri Vakfı'ndan (Grant Numarası IGNITE/FG-OC/2021/004) araştırma fonları almıştır. Finansman kuruluşları, çalışmanın tasarımı, veri toplama ve analizinde, yayımlanma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50X Proteaz inhibitörü kokteyliPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
A549 hücre hattı ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572   
Anti-Ubiquitin antikorEnzoBML-PW8810-0100
Anti-Ubiquitin K48-Specific, klon Apu2 antikoruSigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (yüksek glikoz)HiMedia AL251
FBSGibco (ABD kökenli)38220090
GliserolPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldehit Sigma AldrichE6148
pET28a-p97 plazmidLaboratuvarımızPlazmid talep üzerine temin edilebilir
pET41b-NPLOC4 plazmidLaboratuvarımızPlazmid talep üzerine temin edilebilir
pET41b-UFD1 plazmidAddgenePlazmid #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Streptococcus pneumoniae R6 sızıltıATCCATCC BAA-255Risk Grubu -2 patojeni, BSL-2 tesisinde ele alınacak
Todd Hewitt et suyu tozuHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
UreaHiMedia MB032
Maya özlü toz ve nbsp;HiMedia RM027

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (5), 322-324 (2015).
  2. Ciechanover, A. Proteolysis: from the lysosome to ubiquitin and the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (1), 79-87 (2005).
  3. Damgaard, R. B. The ubiquitin system: from cell signalling to disease biology and new therapeutic opportunities. Cell Death Differ. 28 (2), 423-426 (2021).
  4. Deol, K. K., Lorenz, S., Strieter, E. R. Enzymatic logic of ubiquitin chain assembly. Front Physiol. 10, 835(2019).
  5. Kikkert, M., et al. Human HRD1 is an E3 ubiquitin ligase involved in degradation of proteins from the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 279 (5), 3525-3534 (2004).
  6. Korac, J., et al. Ubiquitin-independent function of optineurin in autophagic clearance of protein aggregates. J Cell Sci. 126 (Pt 2), 580-592 (2013).
  7. Asmat, T. M., Agarwal, V., Saleh, M., Hammerschmidt, S. Endocytosis of Streptococcus pneumoniae via the polymeric immunoglobulin receptor of epithelial cells relies on clathrin- and caveolin-dependent mechanisms. Int J Med Microbiol. 304 (8), 1233-1246 (2014).
  8. Ercoli, G., et al. Intracellular replication of Streptococcus pneumoniae inside splenic macrophages serves as a reservoir for septicaemia. Nat Microbiol. 3 (5), 600-610 (2018).
  9. Chakravortty, D., Rohde, M., Jäger, L., Deiwick, J., Hensel, M. Formation of a novel surface structure encoded by Salmonella pathogenicity island 2. EMBO J. 24 (11), 2043-2052 (2005).
  10. Surve, M. V., et al. Heterogeneity in pneumolysin expression governs the fate of Streptococcus pneumoniae during blood-brain barrier trafficking. PLoS Pathog. 14 (7), e1007168(2018).
  11. Franco, L. H., et al. The ubiquitin ligase SMURF1 functions in selective autophagy of Mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host defense. Cell Host Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
  12. Manzanillo, P. S., et al. The ubiquitin ligase Parkin mediates resistance to intracellular pathogens. Nature. 501 (7468), 512-516 (2013).
  13. Polajnar, M., Dietz, M. S., Heilemann, M., Behrends, C. Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18 (9), 1572-1585 (2017).
  14. Huett, A., et al. The LRR and RING domain protein LRSAM1 is an E3 ligase crucial for ubiquitin-dependent autophagy of intracellular Salmonella typhimurium. Cell Host Microbe. 12 (6), 778-790 (2012).
  15. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection. Nature. 594 (7861), 111-116 (2021).
  16. Yamada, A., Hikichi, M., Nozawa, T., Nakagawa, I. FBXO2/SCF ubiquitin ligase complex directs xenophagy through recognizing bacterial surface glycan. EMBO Rep. 22 (11), e52584(2021).
  17. Apte, S., et al. An innate pathogen sensing strategy involving ubiquitination of bacterial surface proteins. Sci Adv. 9 (12), eade1851(2023).
  18. Ghosh, S., et al. Host AAA-ATPase VCP/p97 lyses ubiquitinated intracellular bacteria as an innate antimicrobial defence. Nat Microbiol. , (2025).
  19. Mitchell, G., Isberg, R. R. Innate immunity to intracellular pathogens: balancing microbial elimination and inflammation. Cell Host Microbe. 22 (2), 166-175 (2017).
  20. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  21. Blythe, E. E., Olson, K. C., Chau, V., Deshaies, R. J. Ubiquitin- and ATP-dependent unfoldase activity of p97/VCP-NPLoc4-UFD1L is enhanced by a mutation that causes multisystem proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (22), E4380-E4388 (2017).
  22. Ducker, C., Ratnam, M., Shaw, P. E., Layfield, R. Comparative analysis of protein expression systems and PTM landscape in the study of transcription factor ELK-1. Protein Expr Purif. 203, 106216(2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Streptococcus PneumoniaeUbikuitin Enzim KompleksiMemeli H cre LizatUFD1 NPLOC4 KompleksiS per z n rl kl MikroskopiKriyojenik Elektron MikroskobiKoloni Olu turan Birimler

İlgili makaleler