Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

2.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

9 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Escherichia coli'den elastin benzeri polipeptit (ELP) arındırılması için hızlı, tekrarlanabilir organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme yöntemini tanımlar; bu yöntem, geleneksel ELP arıtma yöntemlerine potansiyel olarak ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

Özet

Elastin benzeri polipeptitler (ELP), memeli tropoelastininde bulunan motifleri taklit eden tekrarlayan pentapeptid dizilerinden oluşturulmuş mühendislik biçimli biyopolimerlerdir. Benzersiz özellikleri, ilaç ve gen teslimatından doku mühendisliğine ve hedefli moleküler görüntülemeye kadar geniş bir biyomedikal uygulama yelpazesi için ideal aday yapar. Escherichia coli (E. coli) ekspresyonundan alınan geleneksel arıtma yöntemleri, kapsayıcı cisimlerin oluşumu nedeniyle ELP için etkisiz olabilir. Ters geçiş döngüsü (ITC) gibi diğer yöntemler, ELP'nin daha düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST) özelliklerini kullanarak lipopolisakkaridler (LPS) gibi kirleticilerden ayırır, ancak genellikle çok sayıda ısıtma ve soğutma adımı gerektirir; bu da zaman alıcıdır ve ELP yapısının dizisi, konsantrasyonu ve moleküler ağırlığına bağlı olarak düşük geri kazanıma yol açabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, ELP'nin doğadaki hidrofobikliğini kullanarak doğrudan E. coli hücre pelletlerinden hızlı, sağlam ve geniş çapta uygulanabilir arındırma sağlayan organik çözücü tabanlı ekstraksiyon-çökeltme iş akışı geliştirdik. Bu yöntem, hücre bozulmasına yardımcı olmak ve ELP'yi tek adımda seçici olarak çözünürmek için polar organik çözücüler kullanır. Sonraki çökeltme adımı, kalıntı organik çözücüleri, düşük moleküler ağırlıklı safsızlıkları ve endotoksinleri etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve 3 saat içinde LPS seviyelerinin 1 EU/mL'nin altında yüksek saf ELP elde edilir. Atomik kuvvet mikroskopisi verileri, bu şekilde saflaştırılan ELP-füzyon proteinlerinin, füzyon protein fonksiyonunu koruyan ters misel benzeri yapılara kendiliğinden bir araya gelebileceğini göstermektedir. Bu hızlı arıtma yöntemi, araştırmacılara ELP'yi saflaştırmak için basit ve potansiyel olarak ölçeklenebilir bir yol sunar ve ELP ile füzyon proteinlerinin malzeme ve biyomedikal uygulamalar için esnek yapı taşları olarak kullanılması için yeni olanaklar yaratır.

Giriş

Elastin benzeri polipeptitler (ELP'ler), tekrarlayan (VPGXG)nmotifleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9 içeren biyopolimerlerdir. Pentapeptid ünitesindeki misafir kalıntısı X, prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir. X'teki varyasyonlar, ELP yapısının hidrofobikliği, termal geçiş davranışı ve fonksiyonel özelliklerini ayarlamak için kullanılabilir; bu materyaller çeşitli biyomedikal uygulamalarda geniş çapta araştırılmış ve modüler biyouyumlu malzemeleroluşturulur 10,11,12 .

Kimyasal sentez, kısa peptitler üretmek için kullanılabilse de, yüksek moleküler ağırlıklı ELP'ler veya füzyon proteinlerinin işlevselliğinikorumak için uygun değildir 13,14. Bu tür nedenlerle, ELP'ler genellikle E. coli'de rekombinant olarak ifade edilir ve böylece büyük miktarlarda dizi olarak tanımlanan üretime olanak tanır. Ancak, bu yaklaşım zorluklar da getirebilir. E. coli'de ekspresyonları sırasında, ELP'ler genellikle yoğun inklüzasyon cisimlerinde birikir ve fonksiyonel protein15'i çıkarmak için verimli iyileşme stratejileri gerektirir. Ayrıca, bakteriyel ekspresyon konak hücre proteinleri, nuklein asitler ve lipopolisakkaridler (endotoksinler) gibi istenmeyen biyomolekülleri de dahil eder; bunlar arıtma sırasında ELP'den ayrılması gerekir. Geleneksel çözücü yöntemler, örneğin sodyum dodesil sülfat (örneğin, sodyum dodesil sülfat (SDS) veya Triton X-100) veya urea gibi kaotropik ajanlar kullanılarak ELP füzyon dizilerimizde sınırlı başarı elde etmiştir. Deneyimimize göre, Triton ve üre pelet fazından ELP çıkaramadı, SDS ise kısmi çözünürmeyi mümkün kıldı ancak aşağı akış affinite arındırmasını engelledi ve hidrofobik ELP dizisinden tamamen çıkarılması zordu.

Bugüne kadar, ters geçiş döngüsü (ITC), ELP'ler için en yaygın kullanılan arıtma yöntemi olarak kalmaktadır. Bu teknik, LCST davranışlarını kullanarak ELP'yi sıcaklık ve tuzgradyanları 16 boyunca seçici olarak çökeltir ve çözümlemektedir. Ancak, daha düşük moleküler ağırlıklı proteinlerle, ITC zaman alıcı çok adımlı bir süreçtir ve dahil edici cisimlerde hapsolmuş ELP'ler için pek uygun değildir; birden fazla ITC döngüsü gerektirir ve bu da heradımda protein kaybına yol açabilir 7,16.

Bu sınırlamaları aşmak için organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme iş akışını benimsedik. Yakhnin ve ark. ilk olarak 1998'de etanol ve tuz gradyanları kullanarak GFP arındırması için hidrofobisite odaklı bir bölme stratejisigöstermiş olsa da, geliştirdiğimiz yeni yöntem, E. coli hücrelerinden ELP füzyon proteinlerini doğrudan çıkarmak için organik çözücükarışımları kullanmaktadır 7. Sweet ve ark. ile Darji ve ark. bu yaklaşımı ELP füzyonlara uyarlamış, organik çözücü ekstraksiyonunun fonksiyonel ELP'lerin hızlı iyileşmesini sağlarken yapısal bütünlük vebiyoaktiviteyi koruduğunu göstermiştir 8,9. Bu yaklaşım, bakteri hücrelerini lizelemek ve tek bir işlemde ELP'leri çıkarmak için sonikasyon ve organik çözücüler kullanır; konak proteinlerin ve nükleik asitlerin çoğunu çökeltirir. ELP açısından zengin organik fazın geri kazanılması ve ardından ELP'lerin çözücülerden ve çözünmüş safsızlıklardan izole edilmesi için hızlı çökeltme ile yüksek saf ELP'ler elde edilir. Bu yaklaşım, endotoksin seviyeleri 1 EU/mL'nin altında olan E. coli peletlerinden üç saatten kısa sürede saf ELPelde edebilir 7,8.

Bugüne kadar yapılan çalışmalar, bu yöntemin birden fazla ITC döngüsü veya çözünürme adımı olmadan farklı moleküler ağırlık ve izoelektrik noktaya sahip ELP yapılarını ve ELP füzyon proteinlerini saflaştırabildiğini göstermektedir (Şekil 1). Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve geçirimli elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme, bu şekilde saflaştırılan ELP-füzyon proteinlerinin ters misel-benzeri yapılar oluşturduğunu (Şekil 2) göstererek, organik çözücü ekstraksiyonu sırasında ELP füzyon alanlarının yapı ve işlevinin korunmasına yardımcı olduğunu göstermektedir. Bu kolaylaştırılmış iş akışı, çeşitli biyomedikal uygulamalar için daha hızlı ve daha güvenilir ELP arıtmasını sağlar 7,8. Özellikle, Aayush ve ark. bu yöntemle saflaştırılan ELP yapılarının epidermal büyüme faktörü-reseptör bağlanmafonksiyonu 18'i koruduğunu bildirerek, bu yöntemin sadece saf ELP materyali üretmekle kalmayıp, aynı zamanda füzyon protein domaininin aktivitesini de koruduğunu vurgulamıştır.

Bu yöntemin ELP-enzim füzyonu izole etmedeki faydasının bir ek göstergesi olarak, ELP-Intein-Chorismate mutaz 2 (ELP-I-Cm2) yapısını saflaştırmak için ayrıntılı organik çözücü tabanlı bir yöntem tanımlıyoruz (Şekil 3). Bu yöntem, ilaç dağıtımı ve nanomateryal uygulamaları için diğer ELP'lerin hızlı arındırılması için faydalı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Malzeme hazırlığı

  1. Bakteriyel suş: İfade konakçısı olarak kimyasal olarak yetkin Escherichia coli BL21(DE3) hücreleri kullanın.
    NOT: Yüksek dönüşüm verimliliği ve rekombinant protein üretimine uygunlukları nedeniyle seçilmişlerdir.
  2. İfade plazmidi: Ampisilin direncine sahip ELP-I-Cm2 füzyonproteinini kodlayan pET21(+) vektör kullanın. Plazmid vektörünü addgene'den satın alın. Intein'in ucundaki BsrG I noktasını kullanarak Cm2 genini yerleştirin.
    NOT: Bu proteinin plazmid DNA dizisi Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
  3. Büyüme ortamı: 1200 mL ortam için harika et suyu (TB) ortam hazırlığı
    1. 1100 mL ultrasaf suya 16 g Tripton, 32 g maya ekstraktı, 16 g prolin, 6,8 mL gliserol ekleyerek (Bölüm 1) hazırla. Tüm bileşenleri çözecek kadar iyice karıştırın. Son hacmi ultra saf suyla 1200 mL'ye ayarlayın.
    2. Potasyum fosfat tamponu (Bölüm 2) 23,1 g KH2PO4 ve 125,4 g K2HPO4 karıştırarak hazırlanın ve ardından hacmi ultra saf suyla 1 L'ye getirin.
    3. Bileşenleri (1. ve 2. Bölümler) ayrı ayrı otoklav edin. Otoklavlamadan sonra, TB tabanını dört 300 mL aliquot'a ayırarak ortamı birleştirin. Steril koşullarda her aliquot'a 33 mL fosfat tamponu ekleyin.
  4. İfade için katkı maddeleri
    1. IPTG: IPTG ile indüksiyon işlemi 1,2 mM nihai konsantrasyonda yapılır (örneğin, 330 mL kültüre 396 μL 1 M IPTG eklenir).
    2. Antibiyotik: Plazmid seçimini sağlamak için son konsantrasyon olan 100 μg/mL'ye ampisilin ekleyin.
  5. Liz tamponu (pH 8.5): Liz tamponunu 10 mM Tris Baz ve 22 mM etilenidiamintetraasetik asit (EDTA) ile hazırlayın. Gerektiğinde HCl veya NaOH kullanarak pH'ı 8.5'e ayarlayın.
  6. Ekstraksiyon için organik çözücüler
    1. Dahil edici cisimlerden ELP-I-Cm2 füzyon proteinini çıkarmak için çeşitli organik çözücüler (Tablo 1) kullanın. Bu çözücüleri hem tek tek hem de ikili kombinasyonlar halinde (1:1 vol: vol) test ederek verimlilik ve ELP saflığını değerlendirin.
      NOT: Kullanılan tüm çözücüler HPLC Grade'dedir, Asetonitrile (Optimum derecesi), Etanol (USP sınıfı) ve 1-Butanol (%99 saf) hariç.
      DIKKAT: Yukarıda listelenen tüm çözücüler uçucu ve yanıcıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (laboratuvar önlüğü, nitril eldiven ve göz koruma cihazı) kimyasal bir buhar davlumbazında ele alınmalıdır. Birçok plastik çeşit organik çözücülerle uyumlu değildir. Polipropilen plastik ürünler, organik çözücülerle ekstraksiyon-çökeltme deneyleri için şiddetle tavsiye edilir; aksi takdirde, kullanılacak plastik eşyalar değerli bir örnek olmadan test edilmeli ve kullanıma uygun olup olmadığından emin edilmelidir. Çözücü atıkların bertarafı, ilgili kurumsal tehlikeli atık politikalarında belirtilen prosedürlere uymalıdır.

2. Hücre lizisi ve hazırlığı (Şekil 4A)

  1. Yeniden süspansiyon: 1 g hücre pelletini tartın ve 4 mL taze hazırlanmış lizis tamponu içinde tekrar askıya alın. Pelet tamamen dağınıp tampon ile karışana kadar nazikçe vortex yapın.
  2. Enzimatik lizi: Hücre duvarı sindirimine yardımcı olmak için ~5 mg lizozim ekleyin. Süspansiyonun 4 °C'de 1 saat kuluçka olmasına izin verin. Bu, hücre lizisini artırmak için kısmi enzimatik sindirimi kolaylaştırır.
  3. Sonikasyon: Kuluçkadan sonra, hücre lizisini tamamlamak ve genomik DNA'yı kesmek için numuneyi sonikle geçirin. Aşırı ısınmayı önlemek için kısa süreli mikrouçlu sonik patlamaları (350 W cihaz, güç seviyesi 3) kullanın (örneğin, 5 saniye açık/10 saniye kapalı, gerektiğinde tekrarlanarak). Örnekleri buz üzerinde sonikle geçirin ve ultrasonik enerjiyi uygulayın, genellikle yaklaşık 5-8 dakika boyunca görünür partiküllerden arındırılmış uniform bir lizatat elde edilene kadar.
    NOT: Sonikasyon tamamlandıktan sonra, ekstraksiyon ve çökeltme adımlarından önce ve sonra arıtma ilerlemesini izlemek için ELP ekspresyon analizi için numunenin 100 μL aliquotunu (veya lizatını) depolayın.
  4. Santrifüj ve ifade analizi.
    1. Lizat, 10.000 g ile 20 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle aydınlaştırın, ardından süpernatantı (çözünür fraksiyonu) pelletten dikkatlice ayırın (çözünmez/kapanma-vücut fraksiyonu).
    2. SDS-PAGE ile her iki fraksiyonda ELP ekspresyonunu değerlendirin: üst gövdeden bir aliquot (örneğin, 10-20 μL) çekilin ve eşdeğer bir pelet kütlesini lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) aynı hacme yeniden askıya alın; Her birini 4x Laemmli tamponu ile son 1x karıştırın, 95 °C'de 5 dakika ısıtın ve doğrudan karşılaştırma mümkün olacak şekilde eşit miktarda yükleyin.
    3. Hedef ELP ağırlıklı olarak çözünürse, organik-çözücü ekstraksiyonuna geçin ve arındırılmış üst sıvı kullanılsın. Eğer çoğunlukla çözünmezse (dahil edici cisimler), süpernatantı atabilir ve kapsayıcı vücut iş akışına (yıkama/çözümleme ve ekstraksiyon) devam eder; pellet organik çözücü ekstraksiyonuyla işlenir.
  5. Pellet yıkama ve kurutma (sadece dahil edici gövdelerde ELP için): Santrifüj tüplerini ters çevirerek kalıntı lizis tamponunun yerçekimi destekli boşalmasına izin verin. Görünür sıvı boşaldıktan sonra (~1-2 dakika), pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika hava kurumasına bırakın, organik çıkarımdan önce fazla nemden arındığından emin olun.

3. Organik Ekstraksiyon (Şekil 4B)

NOT: Her ELP'nin yüksek saflıkta ekstraksiyonlar elde etmek için tercih edilen bir çözücü koşulu vardır (örneğin, Şekil 1'deki AC performansı). Bu nedenle, 28 organik çözücü ve kombinasyonlarının ilk taraması test edilmeli ve izolatlar PAGE tarafından analiz edilip ilgi duyulan yapı için optimal çözünürme verimlilik koşulları belirlenmelidir.

  1. Çözücü taraması. Adım 1.6'da gösterilen bireysel çözücüleri ve onların 1:1 (v/v) ikili çözücü karışımlarını eken. Sürecin etkinliğini artırmak için ek karışımları (örneğin, 1:2, 2:1, 4:1) değerlendirin.
    NOT: Şu anda, en etkili çözücüleri veya kombinasyonları mantıklı bir şekilde seçmek için bir rehber yoktur, bu nedenle, hidrofobik protein agregalarını daha önce çözmüş çözücülerden seçim yapmak için bir tarama kampanyası gereklidir. Arıtma için kullanılacak organik çözücü ekstraktantının nihai seçimi, bu ekrandan elde edilen izolatların SDS-PAGE analizine dayanmalıdır.
  2. Çıkarma prosedürü
    1. Çözücü ekleme: Lizis'ten sonra elde edilen hava kurutma pelet/üst maddeye 4 mL organik çözücü veya çözücü karışımı ekleyin. Karışık kombinasyonlar için, hassas hacimsel oranlar (örneğin, 1:1 kombinasyon için her birinden 2 mL) emin olun.
    2. Vorteks: Süspansiyonu 1 dakika boyunca sertçe girdabla girdirerek çözücünün pellete iyice karışmasını ve nüfuz etmesini sağlar.
    3. İnküpensasyon (Tutma süresi): Süspansiyonun 20 °C'de 5 dakika boyunca kuluçka yapmasına izin verin; böylece hücre dışı proteinlerin toplanıp tortulması için yeterli etkileşim süresi sağlanır, ELP'ler ise organik fazda çözünür.
    4. Santrifüjleme: Karışımı 13.000 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca 20 °C'de santrifüjlenerek çözünmüş proteinleri kalıntı çözünmeyen kalıntılardan ayırır.
    5. Süpernatant toplama: Süpernatantı dikkatle toplayın, pelleti rahatsız etmeden. Üst katman çözünmüş ELP'yi içerirken, pelet konak hücre proteinleri, nüklein asitler ve lipidler içerir.
    6. Hacim ölçümü: Kurtarılan süpernatantın hacmini kesin olarak kaydedin. Süpernatantın herhangi bir pellet parçacıklarından arınmış olmasına dikkat edilmelidir. Bu ölçüm, aşağı akış yağış aşaması için kritiktir.

4. Protein çökeltmesi

  1. Anti-çözücü ekleme: Organik süpernatana ölçülen hacmin 2,33 katı olan aseton veya asetonitril ekleyin.
  2. Kuluçka: Karışımı 20 °C'de 5-7 dakika kuluçka yapın.
  3. Santrifüj: 10.000 g ile 20 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj.
  4. Pellet işleme: Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice atıp tüpü hafif bir azot gazı akışı altında kapapasız bırakarak 10-15 dakika hava ile kurutulabilir veya kapalı olmayan santrifüj tüplerini tüy içermeyen mendillere ters olarak 20 °C sıcaklıkta 1 saat boyunca (ısı uygulanmaz) inkubasyon yapın.

5. Protein pellet işlenmesi ve yeniden süspansiyon

  1. Yeniden süspansiyon: Çökeltme ve hava kurutmadan sonra, protein pelleti 50 μL fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) içinde yeniden süzülür. Pelletin tamamen çözündüğünden emin olmak için nazikçe yukarı aşağı pipet yapın.
  2. Depolama: Yeniden askıya alınmış proteini kısa ve orta süreli kullanım için -20 °C'de depolayın. Protein fonksiyonel bütünlüğünü korumak için tekrar eden donma-çözülme döngülerinden kaçının.

6. SDS-PAGE üzerinden doğrulama

  1. Örnek hazırlama: Saflaştırılmış proteini 4× SDS-PAGE yükleme tamponu ile 3:1 oranında karıştırın ve homojenlik sağlamak için kısa bir girdap yapın.
  2. Elektroforez koşulları: ELP-I-Cm2 için %15 SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve izleme boyası tabana ulaşana kadar 100-120 V sıcaklıkta çalıştırın.
    NOT: Jeldeki %'deki çapraz bağlama, ilgi çeken ELP yapısının boyutuna göre olmalıdır
  3. Boyama ve görselleştirme: Jeli Instant Blue Coomassie boyama veya başka uygun bir boyayla 20 °C'de 2 saat boyunca boyayın. Deionize suyla durulayarak temiz bir arka plan elde edilene kadar detain. Aktivite testlerinde izole edilen proteini, organik çözücü ekstraksiyon-çökeltme arıtma iş akışından sonra aktivite tutumunun gerçekleşip gerçekleşmediğini doğrulamak için test edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokolün son aşamalarından geçtikten sonra, bir sonraki adım SDS-PAGE analizi ve Coomassie mavisi boyama ile ekstraksiyon-çökeltme sonucunun görselleştirilmesini sağlar. Organik ekstraksiyondan önce bir liz aşaması olduğunda, belirgin bir ELP bandı belirgin olmalıdır. ELP-I-Cm2 durumunda, bu bant 100 kDa'da görünür (Şekil 3A).

Farklı organik çözücü kombinasyonlarının taraması, değişken ekstraksiyon verimlilikleri göstermiştir (Şekil 3B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ITC daha önce ELP19'un kromatografik olmayan arındırılması için kullanılmıştır; ancak zaman alıcı ve düşük verimli bir süreç olabilir. Yukarıda detaylandırılan yöntemlerde, ELP-I-Cm2 füzyon proteininin hızlı saflaştırılması için bir yaklaşımı tanımlıyoruz ve organik çözücü tabanlı ekstraksiyon-çökeltme yönteminin çok çeşitli ELP ve ELP füzyonların saflaştırılmasında nasıl etkili kullanılabileceğini gösteriyoruz. Organik çözücü protokolü sadece ITC'den daha hızlı o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışmayı destekledikleri için Purdue Üniversitesi Kanser Araştırma Enstitüsü ve NIH CCSG programına (CA23168) teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2-MerkaptoetanolBio-Rad161-0710SDS-PAGE Bileşeni
%30 Akrilamid/Bis-akrilamidTCIA3218SDS-PAGE Bileşeni
AsetonFisher ScientificA949Organik Çözücü
AsetonitrilFisher ScientificA996Organik Çözücü
AmpicilinAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiA-301-25Antibiyotik
APS (Amonyum Persülfat)Bio-Rad1610700SDS-PAGE Bileşeni
ButanolFisher ScientificL13171Organik Çözücü
EDTAFisher BiyoreagentleriBP118-500Liz Tamponu Bileşeni
EtanolDecon LabsUN1170Organik Çözücü
Etil AsetatFisher ScientificE195Organik Çözücü
GliserolResearch Products InternationalG22020-0.5Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
Hidroklorik AsitFisher ScientificA144SI-212Liz Tamponu Bileşeni
Anında Coomasie lekesiAbcamAB119211SDS-PAGE Bileşeni
IPTGAltın Biyo- Altın Biyoteknoloji12481C25Protein İfadesi Bileşeni
İzopropanolFisher ScientificA451-1Organik Çözücü
K2HPO4 (Potasyum Fosfat Monobazik)Wards'ın Bilimi470302-246Bölüm 2 Tampon Bileşeni
KH2PO4 (Potazyum Fosfat Dibazik)Wards'ın Bilimi470302-254Bölüm 2 Tampon Bileşeni
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
LizozimAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiL-040-1Liz Tamponu Bileşeni
MetanolFisher ScientificA452Organik Çözücü
Doğal Örnek TamponuBio-Rad161-0738SDS-PAGE Bileşeni
Protein MerdiveniAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiP008-500SDS-PAGE Bileşeni
Çözümleme Jel TamponuBio-Rad1610798SDS-PAGE Bileşeni
Sodim Dodesil Sülfat (SDS)Termo BilimselJ18220-36SDS-PAGE Bileşeni
Sodyum HidroksitFisher ScientificS318-500Liz Tamponu Bileşeni
Üst üste Gel TamponuBio-Rad1610799SDS-PAGE Bileşeni
TEMEDBio-Rad1610801SDS-PAGE Bileşeni
Tris ÜssüFisher BiyoreagentleriBP-152Liz Tamponu Bileşeni
TriptonResearch Products InternationalT60065-1000.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
Maya EkstraktıResearch Products InternationalY20025-1000.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni

Kaynaklar

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ELP SaflaştırmaOrganik Çözücü EkstraksiyonuProtein PresipitasyonuE. Coli Ekspresyonuİnklüzyon CisimleriEndotoksin GidermeSDS-PAGE AnaliziFüzyon Proteini AktivitesiKendi Kendine Düzenlenen Nanopartiküller
E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.