Method Article

E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Escherichia coli'den elastin benzeri polipeptit (ELP) arındırılması için hızlı, tekrarlanabilir organik çözücü bazlı ekstraksiyon ve çökeltme yöntemini tanımlar; bu yöntem, geleneksel ELP arıtma yöntemlerine potansiyel olarak ölçeklenebilir bir alternatif sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastin benzeri polipeptitler (ELP), memeli tropoelastininde bulunan motifleri taklit eden tekrarlayan pentapeptid dizilerinden oluşturulmuş mühendislik biçimli biyopolimerlerdir. Benzersiz özellikleri, ilaç ve gen teslimatından doku mühendisliğine ve hedefli moleküler görüntülemeye kadar geniş bir biyomedikal uygulama yelpazesi için ideal aday yapar. Escherichia coli (E. coli) ekspresyonundan alınan geleneksel arıtma yöntemleri, kapsayıcı cisimlerin oluşumu nedeniyle ELP için etkisiz olabilir. Ters geçiş döngüsü (ITC) gibi diğer yöntemler, ELP'nin daha düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST) özelliklerini kullanarak lipopolisakkaridler (LPS) gibi kirleticilerden ayırır, ancak genellikle çok sayıda ısıtma ve soğutma adımı gerektirir; bu da zaman alıcıdır ve ELP yapısının dizisi, konsantrasyonu ve moleküler ağırlığına bağlı olarak düşük geri kazanıma yol açabilir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, ELP'nin doğadaki hidrofobikliğini kullanarak doğrudan E. coli hücre pelletlerinden hızlı, sağlam ve geniş çapta uygulanabilir arındırma sağlayan organik çözücü tabanlı ekstraksiyon-çökeltme iş akışı geliştirdik. Bu yöntem, hücre bozulmasına yardımcı olmak ve ELP'yi tek adımda seçici olarak çözünürmek için polar organik çözücüler kullanır. Sonraki çökeltme adımı, kalıntı organik çözücüleri, düşük moleküler ağırlıklı safsızlıkları ve endotoksinleri etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve 3 saat içinde LPS seviyelerinin 1 EU/mL'nin altında yüksek saf ELP elde edilir. Atomik kuvvet mikroskopisi verileri, bu şekilde saflaştırılan ELP-füzyon proteinlerinin, füzyon protein fonksiyonunu koruyan ters misel benzeri yapılara kendiliğinden bir araya gelebileceğini göstermektedir. Bu hızlı arıtma yöntemi, araştırmacılara ELP'yi saflaştırmak için basit ve potansiyel olarak ölçeklenebilir bir yol sunar ve ELP ile füzyon proteinlerinin malzeme ve biyomedikal uygulamalar için esnek yapı taşları olarak kullanılması için yeni olanaklar yaratır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastin benzeri polipeptitler (ELP'ler), tekrarlayan (VPGXG)nmotifleri 1,2,3,4,5,6,7,8,9 içeren biyopolimerlerdir. Pentapeptid ünitesindeki misafir kalıntısı X, prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir. X'teki varyasyonlar, ELP yapısının hidrofobikliği, termal geçiş davranışı ve fonksiyonel özelliklerini ayarlamak için kullanılab....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Malzeme hazırlığı

  1. Bakteriyel suş: İfade konakçısı olarak kimyasal olarak yetkin Escherichia coli BL21(DE3) hücreleri kullanın.
    NOT: Yüksek dönüşüm verimliliği ve rekombinant protein üretimine uygunlukları nedeniyle seçilmişlerdir.
  2. İfade plazmidi: Ampisilin direncine sahip ELP-I-Cm2 füzyonproteinini kodlayan pET21(+) vektör kullanın. Plazmid vektörünü addgene'den satın alın. Intein'in ucundaki BsrG I noktasını kullanarak Cm2 genini yerleştirin.
    NOT: Bu proteinin plazmid DNA dizisi Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
  3. Büyüme ortamı: 1200 m....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolün son aşamalarından geçtikten sonra, bir sonraki adım SDS-PAGE analizi ve Coomassie mavisi boyama ile ekstraksiyon-çökeltme sonucunun görselleştirilmesini sağlar. Organik ekstraksiyondan önce bir liz aşaması olduğunda, belirgin bir ELP bandı belirgin olmalıdır. ELP-I-Cm2 durumunda, bu bant 100 kDa'da görünür (Şekil 3A).

Farklı organik çözücü kombinasyonlarının taraması, değişken ekstraksiyon verimlilikleri göstermiştir (<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC daha önce ELP19'un kromatografik olmayan arındırılması için kullanılmıştır; ancak zaman alıcı ve düşük verimli bir süreç olabilir. Yukarıda detaylandırılan yöntemlerde, ELP-I-Cm2 füzyon proteininin hızlı saflaştırılması için bir yaklaşımı tanımlıyoruz ve organik çözücü tabanlı ekstraksiyon-çökeltme yönteminin çok çeşitli ELP ve ELP füzyonların saflaştırılmasında nasıl etkili kullanılabileceğini gösteriyoruz. Organik çözücü protokolü sadece ITC'den daha hızlı o.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmayı destekledikleri için Purdue Üniversitesi Kanser Araştırma Enstitüsü ve NIH CCSG programına (CA23168) teşekkür ediyoruz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MerkaptoetanolBio-Rad161-0710SDS-PAGE Bileşeni
%30 Akrilamid/Bis-akrilamidTCIA3218SDS-PAGE Bileşeni
AsetonFisher ScientificA949Organik Çözücü
AsetonitrilFisher ScientificA996Organik Çözücü
AmpicilinAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiA-301-25Antibiyotik
APS (Amonyum Persülfat)Bio-Rad1610700SDS-PAGE Bileşeni
ButanolFisher ScientificL13171Organik Çözücü
EDTAFisher BiyoreagentleriBP118-500Liz Tamponu Bileşeni
EtanolDecon LabsUN1170Organik Çözücü
Etil AsetatFisher ScientificE195Organik Çözücü
GliserolResearch Products InternationalG22020-0.5Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
Hidroklorik AsitFisher ScientificA144SI-212Liz Tamponu Bileşeni
Anında Coomasie lekesiAbcamAB119211SDS-PAGE Bileşeni
IPTGAltın Biyo- Altın Biyoteknoloji12481C25Protein İfadesi Bileşeni
İzopropanolFisher ScientificA451-1Organik Çözücü
K2HPO4 (Potasyum Fosfat Monobazik)Wards'ın Bilimi470302-246Bölüm 2 Tampon Bileşeni
KH2PO4 (Potazyum Fosfat Dibazik)Wards'ın Bilimi470302-254Bölüm 2 Tampon Bileşeni
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
LizozimAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiL-040-1Liz Tamponu Bileşeni
MetanolFisher ScientificA452Organik Çözücü
Doğal Örnek TamponuBio-Rad161-0738SDS-PAGE Bileşeni
Protein MerdiveniAltın Biyo- Altın BiyoteknolojiP008-500SDS-PAGE Bileşeni
Çözümleme Jel TamponuBio-Rad1610798SDS-PAGE Bileşeni
Sodim Dodesil Sülfat (SDS)Termo BilimselJ18220-36SDS-PAGE Bileşeni
Sodyum HidroksitFisher ScientificS318-500Liz Tamponu Bileşeni
Üst üste Gel TamponuBio-Rad1610799SDS-PAGE Bileşeni
TEMEDBio-Rad1610801SDS-PAGE Bileşeni
Tris ÜssüFisher BiyoreagentleriBP-152Liz Tamponu Bileşeni
TriptonResearch Products InternationalT60065-1000.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni
Maya EkstraktıResearch Products InternationalY20025-1000.0Harika Et Suyu (TB) Medya Bileşeni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles