Yöntem makalesi

Kemik İliği Stromal Hücre Göçünü Yönlendirmek için Mikro Ölçekli Sertlik Gradyanlarına Sahip Substratların Mikrofabrikasyonu

DOI:

10.3791/69473

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yumuşak litografi yoluyla çift katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) substratının üretimini detaylandırır. Yöntem, mikro ölçekte etkili sertlik gradyanları oluşturmak için yumuşak düz bir üst katmanla birleştirilmiş sert bir alt katmanda geometrik olarak modüle edilmiş mikro yapıları kullanır ve topografik müdahale olmadan hücresel mekanobiyoloji çalışmalarına olanak tanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin mekanik sinyallere nasıl tepki verdiğini anlamak, doku gelişimi ve hastalığın ilerlemesinde rol oynayan mekanizmaları aydınlatmak için çok önemlidir. Bununla birlikte, mevcut in vitro hücre kültürü substratları, kafa karıştırıcı topografik ipuçlarını ortadan kaldırırken, hücresel ölçekte fizyolojik sertlik gradyanlarını kopyalamada genellikle başarısız olur. Bu çalışmada, iki katmanlı bir polidimetilsiloksan (PDMS) substratı kullanan ayrıştırılmış bir sertlik modeli sunuyoruz. Bu alt tabaka, sırt ve oluk mikro yapılarına sahip sert bir alt katman üzerinde asılı duran yumuşak, düz bir üst filmden oluşur. Üst katman, hücre temas yüzeyinde tekdüze topografya ve kimyayı korurken, alttaki yapıdaki sertlik değişikliklerini etkili bir şekilde iletir. Sertlik modülasyonu, eşit aralıklarla yerleştirilmiş alternatif çıkıntıların ve olukların genişliğinin değiştirilmesiyle elde edilir. Taramalı elektron mikroskobu, düz yüzey morfolojisini ve tutarlı temas topografyasını doğruladı. Atomik kuvvet mikroskobu, sertlik değişimlerinin mikro yapıya bağlı olduğunu gösterdi: 20 μm modeller için elastik modüller, çıkıntılar için yaklaşık 950 kPa ve oluklar için 850 kPa idi; 50 μm paternler için bu değerler sırasıyla 1070 kPa ve 950 kPa civarındaydı. Fare birincil kemik iliği hücreleri iyi yapıştı ve substrat üzerine yayıldı, 50 μm modelinde (%61.49, p < 0.05) daha sert sırt bölgelerine doğru nükleer lokalizasyon tercihi gösterdi, böylece mekanik gradyanın etkili hücresel algısını doğruladı. Özetle, bu protokol, mikro ölçekli sertlik gradyanlarına sahip bir hücre kültürü substratı oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sunar, kimyasal veya topografya girişimini en aza indirir ve hücre mekanotransdüksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler, yapışma, göç, çoğalma ve farklılaşma4 dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçleri düzenlemek için çok önemli olan dış mikro çevreleri 1,2,3 içindeki mekanik uyaranları algılama ve bunlara yanıt verme yeteneğine sahiptir. İn vivo olarak, doku mikroçevresinin mekanik özellikleri, hem kemik ve kas kavşakları gibi fizyolojik bağlamlarda hem de tümörler 5,6,7 gibi patolojik durumlarda gözlenen matris sertliğindeki değişikliklerle önemli uzamsal heterojenlik sergiler. Bu mekanik faktörlerin kapsamlı bir şekilde araştırılması, hücre davranışını yöneten düzenleyici mekanizmaların anlaşılması için gereklidir. Bu mekanizmalar doku gelişimi, hastalığın ilerlemesi ve rejenerasyon ve onarım süreci gibi süreçlerde çok önemlidir 8,9.

Bu karmaşık mekanik mikro ortamı in vitro olarak simüle etmek için, hidrojeller veya elastomerler, çapraz bağlanma derecesini veya bileşen oranını 3,10,11,12,13 ayarlayarak değişen sertliğe sahip substratlar oluşturmak için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle fizyolojik koşulları 13,14,15,16,17 doğru bir şekilde taklit eden sürekli, mikro ölçekli sertlik gradyanlarını yeniden üretemeyen ayrık sertlik değişiklikleriyle sonuçlanır. Son çalışmalar, sertlik gradyanları oluşturmak için optik çapraz bağlama (örneğin, UV maruziyetini düzenlemek için bir fotomaske kullanma)18, mikroakışkan çok kanallı karıştırma19,20 ve difüzyon güdümlü araçlar21 gibi teknikleri araştırmıştır. Ne yazık ki, bu yaklaşımlar teknik olarak karmaşık olabilir ve ağ boyutu22, şişme23,24 ve topografya25 gibi ek değişkenler getirebilir. Rahatsız edici faktörlerin tanıtılması, sertliğe hücresel tepkilerin yorumlanmasını zorlaştırır. Destek yapısı olarak mikro sütun dizileri veya dama tahtası desenleri kullanan iki katmanlı bir PDMS sistemi, sertlik gradyanları26,27 olan hücre kültürü substratları oluşturmak için benimsenmiştir. Bu yaklaşımlar, izotropik sertlik modülasyonu elde etmek için kimyasal olarak homojen bir zarın altındaki ayrı temel desteklere dayanır ve hücre yapışmasını ve yayılmasını araştırmak için değerli platformlar sağlar. Bununla birlikte, in vivo doğal hücresel mikro çevre, mekanik özelliklerinde genellikle oldukça anizotropiktir28,29. Bu yönlü mekanik sinyallemenin temel biyolojik olayları derinden etkilediği varsayılmaktadır. Bu nedenle, mevcut biyofabrikasyon stratejileri, hücre yüklü substratlar içindeki mikro ölçekli sertlik gradyanlarını ve uzamsal heterojenliği doğru bir şekilde taklit etmeye bağlı olan, in vivo olarak gözlemlenen ince hücre sertliği etkileşimlerini kopyalama yeteneklerinde sınırlıdır.

Önceki araştırmalar, hücrelerin doğrudan hücresel temas halinde olmadıklarında bile katı nesnelerin etkili sertliğini algılayabildiğini göstermiştir30. Bu çalışmaya dayanarak, hücre altı ve tek hücreli mekanosensing ile ilgili boyut aralığı ile uyumlu olarak 5 ila 50 μm arasında değişen uzamsal ölçeklerde kontrollü sertlik gradyanları üreten yeni bir çift katmanlı polidimetilsiloksan (PDMS) hücre kültürü substratı sunuyoruz. Substrat iki farklı katmandan oluşur: ayarlanabilir geometrik mikro yapılara sahip sert bir PDMS alt katmanı ve hücreyle temas eden yüzey olarak hizmet eden tek tip, düz, yumuşak bir PDMS üst katmanı. Bu tasarım, tutarlı yüzey kimyası ve topografyayı korurken, yalnızca altyapı geometrisindeki değişiklikler yoluyla mekanik modülasyona izin verir. Sonuç olarak, sertlik sinyalini diğer fiziksel ve kimyasal ipuçlarından etkili bir şekilde ayırarak sertlik modülasyonu için biyolojik olarak daha uygun bir sistem sunar.

Geleneksel hidrojel bazlı alt tabakaların aksine, yaklaşımımız şişme, ağ boyutu veya yüzey topolojisinden etkilenmeden tek değişkenli mekanik çalışmalara olanak tanır. Alt tabakanın standart yumuşak litografi kullanılarak üretilmesi kolaydır ve yüksek oranda tekrarlanabilir31. Aynı zamanda yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile de uyumludur, bu da onu özellikle canlı zamanlı görüntüleme ve mikro ölçekli sertlik ipuçlarına hücresel tepkilerin nicel çalışmaları için çok uygun hale getirir. Bu makale, eksiksiz üretim protokolünü sunar, parametre kontrol stratejisini detaylandırır ve temsili hücre kültürü deneyleri ile substratın faydasını gösterir. Sonuç olarak, bu yaklaşım, mikro ölçekli bir sertlik gradyanına hücre tepkilerini keşfetmek için sağlam ve erişilebilir bir in vitro araç sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil fare kemik iliği stromal hücreleri (mBMSC'ler), farelerin tibia ve femurundan izole edildi (No. WP20230204, Wuhan Üniversitesi Hayvan Deneyleri Merkezi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır).

1. Ana kalıp hazırlama

NOT: Protokollerimiz, bu araştırma sırasında kullanılan epoksi bazlı negatif fotorezistlere özgüdür.

  1. Kurutmak için iki temiz silikon gofreti (50,8 ± 0,2 mm, <100> yönelimli, 525 ± 25 μm) birkaç dakika ocak gözüne yerleştirin.
  2. Ocak gözünden bir silikon gofret alın ve döndürme kaplamasına geçmeden önce oda sıcaklığına soğutun. Gofret merkezine 3-5 mL fotorezist uygulayın.
  3. 20 μm'lik bir özellik yüksekliği elde etmek için aşağıdaki döndürme protokolünü uygulayın: 7,1 × g'da 10 saniye döndürün, ardından 30 saniye boyunca 410 × g'da döndürün. 30 μm'lik bir özellik yüksekliği elde etmek için aşağıdaki döndürme protokolünü uygulayın: 7,1 × g'da 10 saniye döndürme, ardından 30 × 170 g'da döndürme. Döndürme kaplaması sırasında oluşabilecek kenar boncuklarını çıkarmak için dikkatlice bir neşter kullanın.
  4. Aşağıdaki şekilde yumuşak pişirin: Ocak gözünü 95 °C'ye ayarlayın, gofretin 13 dakika boyunca sıcak plaka üzerinde oturmasına izin verin. Gofreti ocak gözünden çıkarın ve ani bir sıcaklık düşüşünden kaçınarak doğal olarak oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  5. Fotomaskeyi fotorezist kaplı gofret üzerine hizalayın ve toplam 120 mJ/cm2 dozunda UV ışığına maruz bırakın.
  6. Pozlama sonrası aşağıdaki şekilde pişirin: iki ocak gözü (65 °C ve 95 °C) kullanarak, fotorezist kaplı gofretin 95 °C ocak gözüne aktarmadan ve 5 dakika orada bırakmadan önce 65 °C ocak gözü üzerinde 1 dakika oturmasına izin verin. Gofreti bir mikrofiber mendil yığınının üzerine taşıyın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  7. Gofreti PGMEA ile dolu bir Petri kabına aktararak geliştirin ve gofretin tamamını geliştiriciye daldırın. Manuel çalkalama ile geliştirmeyi hızlandırın.
    NOT: PGMEA yanıcıdır ve gözler ve solunum yolları için tahriş edicidir. Özel kaplarda "yanıcı organik atık" olarak atın.
  8. Geliştirmeden sonra, gofreti geliştiriciden çıkarın ve izopropanol içinde yıkayın. Numune yüzeyine yakın izopropanolde süt beyazı bir akış oluşursa (geliştirme tamamlanmamıştır), geliştirme sürecini tamamlamak için numuneyi tekrar geliştiriciye daldırın. Geliştirilen numuneyi, numune yüzeyine yakın süt beyazı bir akış oluşmayana kadar izopropanol içinde yıkayın. Tamamen geliştirildikten sonra, gofreti 15 dakika boyunca 150 °C'lik bir ocak gözüne yerleştirerek fotorezisti sert pişirin.
  9. Aşağıdaki yumuşak litografi işlemleri için gofreti florlayın: yüzeyi aktive etmek için gofreti 30 saniye (100 W) vakum altında oksijen plazmasına maruz bırakın ve ardından bir vakumlu kurutucuya yerleştirin. Vakumlu kurutucunun içine yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine 30 μL trikloro(1H,1H,2H,2H-tridekafloro-n-oktil) silan damlatın. Desikatörü 2 dakika boşaltın ve vakum durumunu 30 dakika koruyun. Silanizasyon işlemini tamamlamak için gofreti 90 °C'de 1 saat pişirin.
    NOT: İşlem boyunca ortam bağıl nemini %60'ın altında sıkı bir şekilde kontrol edin. Aşırı nem, beyaz uçucu olmayan polisiloksan çökeltileri oluşturan silanın hızlı hidrolizine neden olabilir. Çökeltiler, silan buharı dağılımının homojenliğini bozacak ve başarısız bir silanizasyona neden olacaktır. Trikloro(1H,1H,2H,2H-tridekafloro-n-oktil) silan su ile şiddetli reaksiyona girerek zehirli HCl dumanları açığa çıkardığı için işlemi bir başlıkta gerçekleştirin. Florlu/klorlu organik atık olarak bertaraf etmeden önce seyreltik alkali ile nötralize edin. Silanizasyon işlemi %90 başarı oranına ulaşır.

2. İmalat

NOT: Çift katmanlı polidimetilsiloksan (PDMS) substratını üretmek için kullanılan yumuşak litografi işlemi iki farklı adıma ayrılabilir: 1) Hem yapılandırılmış alt katmanın hem de üst katmanın hazırlanması, 2) iki PDMS katmanının bağlanması. Genel üretim verimi %80'in üzerindedir.

  1. PDMS hazırlığı
    1. Yapılandırılmış alt katman için, ön polimer ve kürleme maddesini ağırlıkça 10:1 oranında karıştırarak ve ardından vakum altında gazdan arındırarak PDMS öncüsünü hazırlayın. 1,5 mL PDMS öncüsünü (10:1) SU8 ana kalıbına tüm yüzeyi kaplayacak şekilde dökün, ardından vakum altında gazdan arındırın ve 30 dakika dinlendirin. Dikkatlice fırına alın ve 90 °C'de 1 saat kürleyin. Yapılandırılmış PDMS alt katmanını ana kalıptan çıkarın.
    2. Üst katman için, prepolimer ve kürleme maddesini ağırlıkça 30:1 oranında karıştırarak ve vakum altında gazdan arındırarak PDMS öncüsünü hazırlayın. PDMS öncüsünü florlu bir silikon gofret üzerine dökün. 9 μm'lik bir kalınlık elde etmek için aşağıdaki döndürme kaplama protokolünü uygulayın: 7'de döndürün.1 × g'da 10 saniye boyunca, ardından 2,300 × g'da 60 saniye boyunca döndürün.
    3. Döndürme kaplamadan sonra, tekdüzeliği kontrol etmek için PDMS filmini ortam ışığı altında görsel olarak inceleyin - özellikle çizgiler, kabarcıklar veya düzensiz kenar oluşumu gibi görünür kusurları inceleyin. Film, levha yüzeyinin tamamında tutarlı bir yansıtıcılıkla eşit şekilde şeffaf görünüyorsa bir sonraki adıma geçin; Değilse, döndürme kaplama işlemini yeni bir gofretle tekrarlayın. Homojen bir PDMS film kalınlığı sağlamak için kaplanmış gofreti düz bir yüzeye yerleştirin. Dikkatlice fırına alın ve 90 °C'de 3 saat kürleyin.
      NOT: 9,11 ± 0,34 μm kalınlığında filmler elde edilmiştir.
  2. Yapıştırma
    1. Yapılandırılmış PDMS alt katmanını (10:1) desenli tarafı aşağı bakacak şekilde PDMS üst katman filminin üzerine yerleştirin ve arayüzde kabarcıklar olmadan iki katman arasında iyi temas sağlayın.
    2. Düzeneği fırına taşıyın ve 90 °C'de 3 saat kürleyin.
    3. Düzeneğin bir mikrofiber doku yığını üzerinde oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Son çift katmanlı yapıyı gofretten ayırın ve daha sonra kullanmak üzere bir Petri kabında saklayın.
      NOT: Soyma sırasında üst katman ile alt katman arasında kabarcıklar oluşursa, bu genellikle iki katman arasında eksik yapışma olduğunu gösterir. Döndürme kaplamadan önce PDMS öncüsünün gazının tamamen giderildiğinden emin olun ve tam temas için PDMS alt katmanının uygulanmasından önce film yüzeyinin toz veya kirletici maddelerden arınmış olduğunu doğrulayın. Sıkma kaplama, montaj ve kürleme sırasında silikon levhanın düz olduğundan emin olun. Gofretin eşit olmayan silanizasyonu veya eşit olmayan PDMS kalınlığı nedeniyle film yırtılması meydana gelebilir. Sorunu çözmek için, %60 bağıl nemin altındaki silanizasyon sırasında ortam nemini sıkı bir şekilde kontrol edin. Silanizasyon işlemi %90 başarı oranına ulaşır.

3. Karakterizasyon

  1. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
    1. Temiz kenarlar elde etmek için numuneyi keskin bir bıçakla kesin.
    2. Kesit ve yüzey karakterizasyonunu sağlamak için numuneleri sırasıyla iletken karbon bant kullanarak 90° ve 0° SEM aşamalarına monte edin.
    3. SEM görüntüleme kalitesini artırmak ve numunelerin SEM görüntülerini toplamak için numuneleri 120 saniye boyunca altınla püskürtün.
  2. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)
    NOT: Modülün kantitatif nanomekanik haritalaması için ScanAsyst-Air probunu seçin.
    1. AFM konsol ucunu görüş alanının ortasına yerleştirin. Optik kol sistemini hizalayarak lazer noktasını konsolun en ucuna konumlandırın.
    2. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Haritalama (PeakForce QNM) ölçümlerinden önce, aşağıdaki temel parametreleri belirlemek için AFM konsolunu kalibre edin: Konsol Yay Sabiti: 0.40135 N/m; Sapma Hassasiyeti: 28,993 nm/V (sert bir referans numunesi üzerinde bir kuvvet eğrisi gerçekleştirilerek belirlenir); Uç Yarıçapı: ~21 nm (bilinen modüle sahip bir referans numuneye karşı bağıl yöntem kullanılarak kalibre edilmiştir).
    3. Tarama Parametreleri Listesinin Tarama panelinde, aşağıdaki ilk tarama ayarlarını yapılandırın: 50 μm aralıklı periyodik şeritler içeren numuneler için Tarama Boyutu'nu 70 μm olarak ayarlayın. 20 μm aralıklı periyodik şeritler içeren numuneler için Tarama Boyutu'nu 50 μm'ye ayarlayın. Örnekler/Çizgi ve Çizgiler'i 256 olarak ayarlayın (sonuçta 256 x 256 piksel görüntü elde edilir).
    4. Mikroskopta Devreye Alma Ayarlarını açın ve Devreye Alma Parametrelerinde Aletin varsayılan Tepe Kuvveti Devreye Alma Ayar Noktasını ayarlayın.
    5. İş Akışı Araç Çubuğundaki Etkileşim simgesine tıklayın ve otomatik yaklaşım sırasında gerçek zamanlı sinyalleri izlemeye devam edin.
    6. ScanAsyst Otomatik Kontrolün Bireysel moda ayarlandığından emin olun. İstenilen Deformasyon aralığını elde etmek için PeakForce Ayar Noktasını uygun bir değere ayarlayın: üst katman için PeakForce Ayar Noktası 0.020 nN'dir; yapılandırılmış alt katman için PeakForce Ayar Noktası 5 nN'dir.
    7. Yukarıdan aşağıya veya aşağıdan yukarıya düğmelere tıklayarak taramayı başlatın.
    8. Kuvvet Eğrisi İzleme ve Düzeltme: Kuvvet eğrileri bozuk görünüyorsa veya senkronizasyon sorunları gözlemleniyorsa (örneğin, düzensiz şekiller, tutarsız taban çizgileri), Kuvvet Monitörü penceresine sağ tıklayın ve kuvvet eğrisi hizalamasını ve hassasiyetini otomatik olarak düzeltmek için Otomatik Yapılandırma'yı seçin.
    9. Modül hesaplama kanalı ayarlarında, elastik modülün hesaplanması için kuvvet eğrisinin geri çekme kısmına sığdırmak için DMT modelini seçin.
    10. Yüksek çözünürlüklü topografya ve nanomekanik özellik haritasını elde etmek ve kaydetmek için yakala düğmesine tıklayın.
    11. AFM görüntü işleme ve analiz yazılımını kullanarak alım sonrası analiz gerçekleştirin. Kaydedilen AFM veri dosyalarını açın ve numune yüzeyindeki bölgeleri seçerek modül değerlerini çıkarın; Yazılımın yerleşik istatistiksel analiz araçlarını kullanarak hem üst katman hem de alt katman için ortalama modülü, standart sapmayı ve dağılım profillerini hesaplayın. İşlenmiş modül haritalarını ve nicel verileri dışa aktarın.
    12. Örnek başına AFM taraması sayısı: Her örnek için üç bağımsız tam alan taraması gerçekleştirin. Her taramanın, numunenin yapısal özellik boyutuyla eşleşen bir bölgeyi kapsadığından emin olun, 50 μm aralıklı periyodik şeritlere sahip numuneler için 70 μm × 70 μm ve 20 μm aralıklı şeritlere sahip numuneler için 50 μm × 50 μm. Temel yapının (10:1 PDMS) ve üst katman filminin (30:1 PDMS) modül ölçümleri için, veri güvenilirliğini sağlamak amacıyla aşağıdaki örnekleme stratejisini uygulayın.
      1. Üst katman filmi (30:1 PDMS): her ölçüm örtüşmeyen iki adet örtüşmeyen 5 μm × 5 μm taramadan oluşan modülü bağımsız olarak 2x ölçün.
      2. Temel yapı (10:1 PDMS): İki farklı periyodik şerit konfigürasyonu (20 μm ve 50 μm aralık) göz önüne alındığında, her konfigürasyon için modülü bağımsız olarak 2x ölçün.

4. İn vitro hücre kültürü deneyi

NOT: PDMS, hücre kültüründen önce hücre yapışmasını teşvik etmek için kaplanması gereken hidrofobik bir malzemedir ve hücre tipine göre uygun kaplama yöntemi seçilmelidir. Hücresel deney için birincil hücreler kullanılıyorsa etik onay alınmalıdır.

  1. Poli-D-lizin (PDL) kaplama
    1. Alt tabakayı 10 dakika alkole batırarak sterilize edin; daha sonra PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    2. PDL'yi (molekül ağırlığı 150.000 ila 300.000 Da) PBS kullanarak 0.1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda çözün. 24 oyuklu plaka boyutundaki alt tabaka için, 1 mL PDL çalışma solüsyonu ekleyin ve alt tabaka yüzeyini tamamen kaplamak için 4 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
    3. Kaplama tamamlandıktan sonra, PDL çalışma solüsyonunu çıkarın ve PBS ile 3 kez yıkayarak kalan PDL'yi çıkarın. Sonraki hücre deneyleri için substratı kullanın. Kaplama hemen kullanılmayacaksa kurutun ve 4 °C'de saklayın.
      NOT: Başarılı bir kaplama, faz kontrast mikroskobu altında, görünür kristal çökeltiler veya kuruma artefaktları olmadan homojen, özelliksiz bir yüzey sundu. Herhangi bir kristalleşme belirtisi veya düzgün olmayan kaplama olan substratlar atıldı.
  2. Primer fare kemik iliği stromal hücrelerinin (mBMSC'ler) izolasyonu ve kültürü
    1. Birincil fare kemik iliği stromal hücrelerini (mBMSC'ler) farelerin tibia ve femurundan izole edin.
    2. Hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 antibiyotik-antibiyotik ve %1 sodyum piruvat ile desteklenmiş α-MEM'den oluşan bir büyüme ortamında kültürleyin.
    3. Hücre-hücre temasından kaynaklanan potansiyel kafa karıştırıcı etkileri en aza indirmek için adım 4.1.3'te 5.000 hücre/cm2 yoğunlukta elde edilen substratlar üzerine geçiş 3'teki tohum hücreleri.
  3. İmmünofloresan boyama ve görüntüleme
    1. 16 saatlik kültürün (37 °C,% 5 CO2) ardından, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve 3x PBS ile yıkayın. Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ile geçirgen hale getirin ve 3 kez PBS ile yıkayın.
    2. Hücre iskeleti görselleştirmesi için, F-aktini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca falloidin (1:500 seyreltme) kullanarak boyayın ve kalan boyayı çıkarmak için 3 kez bol miktarda PBS ile yıkayın.
    3. Alt tabakayı hücre çekirdeklerinin aynı anda boyanmasıyla monte edin. Hücreleri kaplamak için DAPI ile bir damla gliserin uygulayın. Daha sonra, alt tabakanın üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin ve kenar boşluklarını oje kullanarak kapatın. Baloncuklardan mümkün olduğunca kaçının.
    4. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak hücresel morfolojiyi ve nükleer konumlandırmayı yakalayan floresan görüntüleri elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotolitografi, paralel sırt ve oluk mikro yapılarına sahip yeniden kullanılabilir silikon ana kalıpları üretmek için kullanıldı. Sırasıyla 20 ve 50 μm oluk genişliğine (mahya genişliği oluk genişliği ile aynıdır) sahip iki tasarım oluşturuldu. Her desenli alan 7 mm × 7 mm olarak ölçülmüştür. Silikon kalıpların hassasiyeti ve yeniden kullanılabilirliği, tekrarlanan alt tabaka üretim sürecini önemli ölçüde basitleştirdi. Ana kalıp daha sonra PDMS'deki mikro yapıları kopyalamak için kullanıldı. Alt tabakayı oluşturmak için ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, topografik olarak tekdüze özelliksiz bir yüzeyi korurken lokalize sertlik varyasyonları sunmak için tasarlanmış iki katmanlı PDMS tabanlı bir alt tabaka tasarlamak için yeni bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yaklaşım, tutarlı yüzey kimyası ve topografyayı korurken, yalnızca altyapı geometrisindeki değişiklikler yoluyla mekanik modülasyona izin verir. Sonuç olarak, sertlik sinyalini diğer fiziksel ve kimyasal ipuçlarından etkili bir şekilde ayırarak sertlik modülasyonu için biyoloj...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları (No. 2042024YXB018'den W. Ji'ye) tarafından mali olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  %4 paraformaldehitServicebio TeknolojisiG1101
AsetonŞanghay Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antibiyotik-Antimikotik
DAPI ile Antifade Montaj OrtamıBeyotime BiyoteknolojisiP0131DAPI  ile gliserin;
Hücre Kültür PlakasıYUVA70200124 kuyu
KurutucuSichuan Shubo (Grup) Co., Ltd913354-30SNİç çap=180mm
Fetal Sığır SerumuHyCloneSV30208.02
Ters floresans mikroskobuOlympusDP74
İzopropanolŞanghay Aladdin80109218GC≥ 99.7%
Maske hizalayıcıSichuan Nanguang Vakum Teknolojisi A., LtdH94-37
MEM Alpha modifikasyonuHyCloneSH30265.01
Nanoskop AnaliziBrukerSürüm 3.0AFM görüntü işleme ve analiz yazılımı.
Opera Phenix Plus Yüksek İçerikli Görüntüleme SistemiPerkin Elmer2400L23248 10x hava hedefiyle donatılmış
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Geliştirici Negatif Fotorezist; SPEC: UL; Yüzde:en az %99,7
FalloidinUelandy YP0052L594-Phalloidin
Fosfat tamponlu tuzlu çözeltisiHyCloneSH30256.01
Plazma TemizleyiciPlazma teknolojisi (Almanya)Flecto 10 
Poli-D-lizinBeyotime BiyoteknolojisiST508CAS Numarası 27964-99-4
Taramalı Prob MikroskobuBrukerBoyut İkonuPeakForce Nicitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) ve Point-and-Shoot Ramping deneysel çalışma alanları dahil olmak üzere Nanoskop kontrol yazılımını kullanır.
Nitrit kolu üzerinde silikon uçBrukerSCANASYST-AIRProb, tek V-şekilli, Al refleks kaplı bir konsola sahiptir; k= 0.4 N/m (nominal), f0 = 70 kHz.
Silikon waferlerShenzhen Titiz Teknoloji A., Ltd-50.8± 0.3mm çapı, (100) yönlü, 525 ve artı milyon; 25 μ m kalınlığında
Sodyum PiruvatGibco11360-070
Döner kaplamaÇin Bilimler Akademisi Mikroelektronik EnstitüsüKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Negatif Fotorezist; %72,3 katı gıda; Viskozite 4400; Yoğunluk 1.143g/ml
SYLGARD 184 Silikon Elastomer KitiDow Kimya Şirketi01673921
Trikloro(1H,1H,2H,2H-tridekafluoro-n-oktil)silanŞanghay Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML100Permeabilizasyon için %0,1 Triton X-100
Tripsin-EDTAGibco25200-072%0,25 Tripsin-EDTA (1 kat)
Vakumlu FırınMemmert (Almanya) VO 200 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 728-742 (2017).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
  4. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  5. Deymier, A. C., et al. Micro-mechanical properties of the tendon-to-bone attachment. Acta Biomater. 56, 25-35 (2017).
  6. Wang, Z., et al. Multi-omics investigations revealed underlying molecular mechanisms associated with tumor stiffness and identified sunitinib as a potential therapy for reducing stiffness in pituitary adenomas. Front Cell Dev Biol. 10, 820562(2022).
  7. Stylianou, A., Voutouri, C., Mpekris, F., Stylianopoulos, T. Pancreatic cancer presents distinct nanomechanical properties during progression. Ann Biomed Eng. 51 (7), 1602-1615 (2023).
  8. Cambria, E., et al. Linking cell mechanical memory and cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 24 (3), 216-228 (2024).
  9. Mittelheisser, V., et al. Evidence and therapeutic implications of biomechanically regulated immunosurveillance in cancer and other diseases. Nat Nanotechnol. 19 (3), 281-297 (2024).
  10. Sridharan, R., Cavanagh, B., Cameron, A. R., Kelly, D. J., O'Brien, F. J. Material stiffness influences the polarization state, function and migration mode of macrophages. Acta Biomater. 89, 47-59 (2019).
  11. Yi, B., Xu, Q., Liu, W. An overview of substrate stiffness guided cellular response and its applications in tissue regeneration. Bioact Mater. 15, 82-102 (2022).
  12. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophys J. 86 (1), 617-628 (2004).
  13. Song, Y., et al. Biphasic regulation of epigenetic state by matrix stiffness during cell reprogramming. Sci Adv. 10 (7), eadk0639(2024).
  14. Taufalele, P. V., et al. Matrix stiffness enhances cancer-macrophage interactions and M2-like macrophage accumulation in the breast tumor microenvironment. Acta Biomater. 163, 365-377 (2023).
  15. Xie, J., Bao, M., Hu, X., Koopman, W. J. H., Huck, W. T. S. Energy expenditure during cell spreading influences the cellular response to matrix stiffness. Biomaterials. 267, 120494(2021).
  16. Wu, B., et al. Stiff matrix induces exosome secretion to promote tumour growth. Nat Cell Biol. 25 (3), 415-424 (2023).
  17. Driscoll, T. P., et al. Integrin-based mechanosensing through conformational deformation. Biophys J. 120 (20), 4349-4359 (2021).
  18. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), 9(2012).
  19. Soliman, B. G., et al. Droplet-based microfluidics for engineering shape-controlled hydrogels with stiffness gradient. Biofabrication. 16 (4), 045026(2024).
  20. Kosmidis Papadimitriou, A., et al. Fabrication of gradient hydrogels using a thermophoretic approach in microfluidics. Biofabrication. 16 (2), 025023(2024).
  21. Isomursu, A., et al. Directed cell migration towards softer environments. Nat Mater. 21 (9), 1081-1090 (2022).
  22. Xia, J., et al. Regulation of cell attachment, spreading, and migration by hydrogel substrates with independently tunable mesh size. Acta Biomater. 141, 178-189 (2022).
  23. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nat Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  24. Li, X., et al. 3D culture of chondrocytes in gelatin hydrogels with different stiffness. Polymers. 8, 269(2016).
  25. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical regulation of cell behavior-cross talk between substrate stiffness and nanotopography. Engineering. 3 (1), 36-54 (2017).
  26. Lee, S., Hong, J., Lee, J. Cell motility regulation on a stepped micro pillar array device (SMPAD) with a discrete stiffness gradient. Soft Matter. 12 (8), 2325-2333 (2016).
  27. Hong, J., Lee, S., Park, S., Lee, J. Micro checkerboard patterned polymeric surface with discrete rigidity for studying cell migration. J Micromech Microeng. 25 (4), 045012(2015).
  28. Mostert, D., Van Der Putten, C., Sahlgren, C. M., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. Bioengineering structural anisotropy in living tissues. Nat Rev Bioeng. 3 (9), 727-741 (2025).
  29. Khuu, N., Kheiri, S., Kumacheva, E. Structurally anisotropic hydrogels for tissue engineering. Trends Chem. 3 (12), 1002-1026 (2021).
  30. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys: Condens Matter. 22 (19), 194116(2010).
  31. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  32. Leong, P. L., Morgan, E. F. Measurement of fracture callus material properties via nanoindentation. Acta Biomater. 4 (5), 1569-1575 (2008).
  33. Grant, C. A., Twigg, P. C., Tobin, D. J. Static and dynamic nanomechanical properties of human skin tissue using atomic force microscopy: effect of scarring in the upper dermis. Acta Biomater. 8 (11), 4123-4129 (2012).
  34. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J Appl Polym Sci. 131 (22), 41050(2014).
  35. Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
  36. Wang, D., et al. A novel approach for PDMS thin films production towards application as substrate for flexible biosensors. Mater Lett. 221, 228-231 (2018).
  37. Tonin, M., Descharmes, N., Houdré, R. Hybrid PDMS/glass microfluidics for high resolution imaging and application to sub-wavelength particle trapping. Lab Chip. 16 (3), 465-470 (2016).
  38. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  39. Psarski, M., et al. Hydrophobization of epoxy nanocomposite surface with 1H,1H,2H,2H-perfluorooctyltrichlorosilane for superhydrophobic properties. Cent Eur J Phys. 10 (5), 1197-1201 (2012).
  40. Pham, J. T., Xue, L., Del Campo, A., Salierno, M. Guiding cell migration with microscale stiffness patterns and undulated surfaces. Acta Biomater. 38, 106-115 (2016).
  41. Miranda, I., et al. Properties and applications of PDMS for biomedical engineering: a review. J Funct Biomater. 13, 2(2022).
  42. Zhang, W., Choi, D. S., Nguyen, Y. H., Chang, J., Qin, L. Studying cancer stem cell dynamics on PDMS surfaces for microfluidics device design. Sci Rep. 3 (1), 2332(2013).
  43. Toworfe, G. K., Composto, R. J., Adams, C. S., Shapiro, I. M., Ducheyne, P. Fibronectin adsorption on surface-activated poly(dimethylsiloxane) and its effect on cellular function. J Biomed Mater Res A. 71 (3), 449-461 (2004).
  44. Wang, L., Sun, B., Ziemer, K. S., Barabino, G. A., Carrier, R. L. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane) surfaces affect adhesion of Caco-2 cells. J Biomed Mater Res A. 93 (4), 1260-1271 (2010).
  45. Lu, M., Ding, L., Zhong, T., Dai, Z. Improving hydrophilicity and adhesion of PDMS through dopamine modification assisted by carbon dioxide plasma. Coatings. 13, 126(2023).
  46. Jiang, B., Guo, H., Chen, D., Zhou, M. Microscale investigation on the wettability and bonding mechanism of oxygen plasma-treated PDMS microfluidic chip. Appl Surf Sci. 574, 151704(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrofabrikasyon SubstratlarKemik li i Stromal H creleriPDMS SubstratS rtl Oluk Mikro yap larAtomik Kuvvet MikroskopisiTaramal Elektron MikroskopisiH cre Mekanotransd ksiyonuElastisite Mod lleri

İlgili makaleler