Method Article

Biyomarker Keşfinde Hedeflenmemiş Gözyaşı Sıvısı Lipidomikleri için Fenol Kırmızı İplik Tabanlı Örnekleme Prosedürü

DOI:

10.3791/69474

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Myopia Research, School of Optometry, The Hong Kong Polytechnic University, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR), 3Department of Food Science and Nutrition, The Hong Kong Polytechnic University, 4Research Centre for SHARP Vision (RCSV), The Hong Kong Polytechnic University, 5Department of Applied Biology and Chemical Technology, The Hong Kong Polytechnic University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fenol kırmızı iplikler ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) tabanlı iş akışı kullanılarak insan gözyaşı sıvısı örnekleri toplamak için benzersiz bir klinik protokolü açıklar; böylece gözyaşı lipidomik profili keşfedilir. Basit metil tert-bütil eter (MTBE)/metanol bifazlı ayırma yöntemi, gözyaşı biyobelirteç keşfi için yüksek geri kazanımla hızlı gözyaşı lipid çıkarımı sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözyaşı lipidleri, gözyaşı filmi stabilitesi ve göz yüzeyi sağlığı için çok önemlidir. Gözyaşı bileşimindeki değişiklikler, meibomian bez disfonksiyonu ve dislipidemi gibi göz ve sistemik hastalıklarla ilişkili olabilir. Gözyaşı lipidlerinin profillenmesi, hastalık teşhisi ve yönetimi için biyomarker keşfine yardımcı olabilir. Ancak, yaygın gözyaşı örnekleme yöntemleri belirgin sınırlamalar taşır: Schirmer şeritleri göz yüzeyiyle geniş temas alanı nedeniyle göz tahriş ve rahatsızlığa neden olurken, mikrokapiler tüp toplama, özellikle farklı personel tarafından yapıldığında operatör değişkenliği nedeniyle düşük tekrarlanabilirlik sağlayabilir. Bu sınırlamalar, lipidomik verilerin doğruluğunu ve tutarlılığını tehlikeye atabilir. Bu çalışma, gözyaşı lipidomikleri için optimize edilmiş minimal invaziv fenol kırmızı iplik (PRT) tabanlı örnekleme yöntemini tanıtmaktadır. PRT'nin ince yapısı, göz tahriş riskini en aza indirir ve hızlı ve nazik bir gözyaşı toplanmasını sağlar. Bu kullanıcı dostu ve kolay uygulanabilir yöntem, daha düşük gözyaşı hacmi veya yabancı cisim hissine daha düşük toleransı olan denekler için uygundur ve operatöre bağlı değişkenliği azaltarak daha tekrarlanabilir örnek toplama sağlar. PRT tarafından toplanan gözyaşı lipidleri, optimize edilmiş bir metanol/metil tert-butil eter (MTBE) faz ayırma protokolü kullanılarak çıkarıldı ve LipidSearch yazılımıyla yüksek çözünürlüklü LC-Orbitrap-IQX MS/MS ile analiz edildi. İş akışı, her biri belirli yağlı asit türevi ürün iyonları ile karakterize edilen 700'den fazla benzersiz gözyaşı lipid türünü tespit etti. Bu sonuçlar, PRT tabanlı örneklemenin gözyaşı lipidomik analizi için sağlam lipid iyileşmesi sağladığını göstermektedir. Bu minimal invaziv ve tekrarlanabilir yaklaşım, klinik ve deneysel gözyaşı lipid araştırmaları için pratik bir platform sunar. Sonuç olarak, bu aynı zamanda biyobelirteç keşfini ve hastalık izlemeyi de kolaylaştırabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gözyaşı filmi, göz yüzeyini patojenlerden koruyan ve okulerhomeostazı koruyan en dıştaki engeldir 1,2; gözyaşı filmindeki lipid tabakası ise gözyaşı buharlaşmasını önlemede ve gözyaşı filminin stabilitesinikorumada temel bileşendir 3,4. Gözyaşı lipid bileşiminin düzensizliği, kuru göz hastalığı (DED), meibomian bez disfonksiyonu (MGD) ve alerjik konjonktivit 5,6,7,8 gibi çeşitli göz hastalıklarıyla ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, gözyaşı lipidomiklerinin ayrıntılı karakterizasyonu, bu göz hastalıklarının altında yatan moleküler patolojilerin daha kapsamlı anlaşılması için kritik ve trend bir araştırma yönühaline gelmiştir 9.

Gözyaşı lipidomik yaklaşımı klinik olarak önemli bir öneme sahip olsa da, gözyaşı lipidomiğinde kritik bir zorluk, standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir toplama ve analiz iş akışı oluşturmaktır. Mevcut yırtık örnekleme yöntemleri, Schirmer şeritleri ve mikrokapiller tüpler her biri kendine özgü sınırlamalar sunmaktadır. Schirmer şeritleri, göz yüzeyiyle geniş bir temas alanına sahiptir ve bu genellikle göz tahrişi ve refleks yırtılmasınaneden olur 9,10. Buna karşılık, mikrokapiler tüp toplama işlemi operatör tekniğine büyük ölçüde bağlıdır ve farklı personel tarafından gerçekleştirildiğinde tutarsız sonuçlarverebilir 11. Ayrıca, bu örnekleme araçlarının yanlış kullanımı göz yüzeyi hasarı riski taşıyabilir. Bu sınırlamalar, aşağı akış verilerinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini tehlikeyeatabilir 12,13. Ayrıca, karmaşık işlem prosedürleri gerektiren gözyaşı toplama yöntemleri, farklı laboratuvarlar ve klinik ortamlar arasında erişilebilirlik ve standartlaştırılmalarını sınırlayabilir. Bu nedenle, doğal gözyaşı lipid profilini koruyabilen, invaziv olmayan, sağlam ve tekrarlanabilir bir gözyaşı toplama ve işleme iş akışı oluşturma acil bir ihtiyaç vardır.

Son çalışmalar, fenol kırmızı ipliklerin (PRT) proteomik ve metabolomik uygulamalarda aşağı akış akışı analizlerinde faydasını vurgulamıştır14,15. PRT, gözyaşı toplama aracı olarak doğuştan avantajlar sunar. Nazik yapısı, minimal invaziv yapısı ve basit örnekleme prosedürü, teknik karmaşıklığı en aza indirebilir ve operatöre bağlı değişkenliği azaltabilir, ancak çoğu denek tarafından iyi tolereedilir 14,16. Ancak, PRT tabanlı gözyaşı lipidomik analizi için özel olarak standartlaştırılmış bir iş akışı henüz kurulmamıştır.

Bu protokol, tekrarlanabilir gözyaşı lipidomikleri için entegre bir iş akışı sunar: lipid analizine uyarlanmış kullanıcı dostu PRT tabanlı gözyaşı toplama yöntemi, tanımlanmış çözücü-örnek oranları ve depolamakontrolleri 17,18 ile optimize edilmiş metil tert-bütil eter (MTBE)/metanol lipid çıkarma protokolü ve yüksek çözünürlüklü LC-MS/MS kullanılarak modifiye edilmiş bir lipid tanımlama yöntemi. Bu standartlaştırılmış yaklaşım, sonraki biyobelirteç keşfi ve hastalık karakterizasyonu için tutarlı bir gözyaşı lipidomik profilleme sağlar. Ayrıca, düşük yırtık hacmi veya yabancı cisim hissine karşı toleransı azalan kişiler için özellikle uygundur (Şekil 1).

figure-introduction-1
Şekil 1: İnsan gözyaşı lipidomikleri için Fenol Kırmızı İplik (PRT) tabanlı iş akışının şematik genel bakışı. PRT yöntemiyle deneklerden gözyaşı sıvısı toplanır ve bu da minimum rahatsızlıkla tutarlı örnek alınmasını sağlar. Örnek işleme, ardışık MTBE/metanol bifazik ekstraksiyon, SpeedVac aracılı konsantrasyon ve sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) için gözyaşı lipid özetlerinin yeniden yapılandırılmasını içerir. Lipidomik profiller daha sonra LC-MS/ MS ile alınır ve LipidSearch yazılımı kullanılarak notlama ve tanımlamaya tabi tutulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Hong Kong Politeknik Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı. Katılımcılar, çalışmaya katılmadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay verdiler. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Fenol Kırmızı İplik (PRT) bazlı insan gözyaşı sıvısı koleksiyonu

  1. Eldiven takın ve çalışma istasyonunu dezenfekte ederek numune kontaminasyonunu önleyin.
  2. PRT paketini açmadan önce onun mühürlü olduğundan ve süresi geçmediğinden emin olun.
  3. İpliği bükülmüş kancanın karşısındaki ucundan tutun. PRT'nin bükülmüş kanca yarısına dokunmaktan her zaman kaçın.
  4. Deneğe üst burun yönüne bakmasını iste.
  5. Deneğin alt göz kapağını nazikçe aşağı çekin ve PRT'yi, alt temporal palpebral konjunktivada, dış kantusa yakın konumlanmış olarak PRT'ye sokun (Şekil 2).

figure-protocol-1
Şekil 2: Gözyaşı toplama sırasında fenol kırmızı ipliğin konumu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Deneğe gözlerini nazikçe kapatmasını ve PRT'nin yüz cildine dokunmasını önlemek için başını hafifçe öne eğmesini iste.
    NOT: Emilen yırtık, pH duyarlı fenol kırmızısı nedeniyle alınan PRT bölgesini gösteren kırmızı boya cephesi oluşturur. Lipidomik analiz için yeterli gözyaşı sıvısı sağlamak için, genellikle 2 dakika içinde tamamlanan 50 mm PRT eşdeğer yırtma hacmi toplamak tercih edilir.
  2. Deneğin alt göz kapağını nazikçe aşağı çek ve örneklenmiş PRT'yi çıkar. Örneklenen bölgeye dokunmaktan kaçının.
  3. PRT'nin örneklenen bölgesinin uzunluğunu kaydedin ve PRT'yi steril forseps yardımıyla yeni bir örnek tüpüne aktarın.
    NOT: Örneklenen PRT uzunluğu <50 mm ise, lütfen deniden 1-3 dakika dinlenmesini ve aynı gözle toplamayı tekrarlamasını rica edin. Her örneklenen PRT'yi ayrı bir örnek tüpüne aktarın.
  4. Numune tüplerini düzgün şekilde etiketleyin ve kapalayın.
  5. Eldivenleri ve forsepsleri metanol ile iyice temizleyin ve kağıt mendillerle temizleyin, böylece yırtık kalıntılarını veya kirleri giderin, sonra kurumasına izin verin.
  6. Diğer göz için 1.2-1.10 adımlarını tekrarlayın.
  7. Numune tüplerini parafilm ile mühürleyin ve numuneyi geçici depolama için -20°C'de veya uzun süreli depolama için -80°C'de hemen saklayın. Gereksiz donma ve erime döngülerinden kaçının ve örneklenen PRT'yi ışıktan koruyun.

2. Örneklenmiş PRT'nin işlenmesi

  1. PRT'leri işlemeden önce mikro-makası metanol ile önceden yıkayın.
  2. PRT'lerin bükülmüş kanca ucunu (yani ilk 3 mm) atın (Şekil 3).

figure-protocol-2
Şekil 3: Fenol kırmızı ipliğin (PRT) fiziksel görünümü. (A) Kullanılmayan PRT, bükülmüş kanca ucu. (B) Belirtilen kesim kesilip lipid çıkarımı için toplanan PRT kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Örneklenen PRT bölgesi (yani fenol kırmızı boya ön kısmının üzerindeki bölge) 2 mm parçalara bölünür ve bu parçaları temiz 1,5 mL organik çözücü toleranslı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

3. Örneklenen PRT'den lipid ekstraksiyonu için MTBE/metanol bifazik ayrımı

DIKKAT: MTBE ve metanol yanıcı ve uçaklıdır. İyi havalandırılan bir alanda veya buhar kapasonu için kullanın. Açık alevlerden ve kıvılcımlardan kaçının. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Ellerinizi tuttuktan sonra yıka.

  1. Örnekleri buzun üzerine koyun.
  2. Her örnek ve girdaba 15 saniye boyunca 232 μL buz gibi soğuk metanol (MS derecesi) ekleyin.
  3. Örnekleri önceden soğutmalı ultrasonik temizleyicide 15 dakika sonikle geçirin.
  4. Her örnek ve girdaba 15 saniye boyunca 774 μL MTBE (HPLC derecesi) ve 194 μL deiyonize su ekleyin. Örnekteki MTBE:metanol:su hacmi oranı 4:1.2:1 (v/v/v) olmalıdır.
  5. Örnekleri 15 dakika boyunca önceden soğutmalı ultrasonik temizleyicide tekrar sonikle geçirin.
  6. Numuneyi termomikserde 8 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin, 1.200 rpm'de çalkalayın.
  7. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
  8. Ortaya çıkan karışımları 10.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenin.
  9. Santrifüjlemeden sonra karışımlar iki faza ayrılır (Şekil 4).
    NOT: Faz ayrımı tamamlandıktan sonra, örnekte iki farklı tabaka için incelenin: üst organik faz (MTBE açısından zengin) şeffaf ve hafif süt opaklığına sahip olmalıdır; alt sulu faz ise fenol kırmızısı göstergesinin varlığına bağlı sarı bir renk gösterir. Yalnızca bu faz özellikleri gözlemlendiğinde devam edin, Şekil 4'te gösterildiği gibi.

figure-protocol-3
Şekil 4: MTBE-metanol-suyu kullanarak lipid ekstraksiyonunun faz ayrımı: üst organik faz ve alt sulu faz. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Lipid içeren üst organik fraksiyonun 700 μL'sini dikkatlice topla ve önceden soğutulmuş yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktar.
  2. Alttaki sulu faz, tehlikeli kimyasal atık olarak kalıntı MTBE ve metanol içeren atılır. Atıkları etiketli, mühürlü kaplarda toplayın ve kurumsal tehlikeli atık protokollerine ve yerel düzenlemelere uygun olarak bertaraf edin. Çözücüleri gidere dökmeyin.
  3. Lipid özlerini buzdolabında SpeedVac konsantratör kullanarak 4 saat boyunca 4 °C'de kurutun.
    NOT: Tam kurumayı sağlamak için, örnek kuruluğunu 2 saat içinde periyodik olarak kontrol edin. Numuneler tamamen kuruyana kadar kurutma süresini gerektiği kadar uzatın.
  4. Kurutulmuş lipid özleri kısa süreli depolama için -20 °C veya uzun süreli depolama için -80 °C sıcaklıkta saklanır.

4. LC- MS/MS analizi için çıkarılmış gözyaşı lipidinin yeniden oluşturulması

  1. Kurutulmuş lipid özlerini, 50 μL buz soğukluğu metanol (MS sınıfı)/kloroform (HPLC derecesi) karışımı (1:1, v/v) çözücü olarak yeniden oluşturun (her 1 mm PRT için 1 μL çözücü) ve ardından 15 dakika boyunca önceden soğutulmuş ultrasonik temizleyicide sonikasyon yapıldı.
  2. Yeniden oluşturulmuş lipid özetlerini 14.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle yapın.
  3. Süpernatantın 40 μL'sini dikkatlice cam bir iç kaplama takılmış bir otosampler cam şişesine aktarın.
  4. Şişeyi yarıksız septum açık bir kapakla sıkıca kapatın ve LC-MS/MS analizine hazır hale getirin.

5. LC-MS/MS ile örnek alımı

  1. Sıvı Kromatografi için, sütun odası ve örnekleyici sıcaklıklarını sırasıyla 50 °C ve 4 °C olarak ayarlayın.
  2. Her enjeksiyon için, örnekten 5 μL ters faz LC kolonuna (C18; 1,7 μm, 100 mm × 2,1 mm) yüklenin ve lipidleri 24 dakikalık bir ayrım gradyanında 0,3 mL/dakika akış hızında fraksiyonize edin.
    1. Mobil faz A'yı 60:40 asetonitril (MS sınıfı): su (v/v) ile 5 mM amonyum formatı (MS sınıfı) ve %0,1 (v/v) formik asit (MS sınıfı) ile içeren mobil faz A ve 90:10 izopropanol (MS sınıfı):asetonitril (v/v) ile 5 mM amonyum formatı ve %0,1 (v/v) formik asit içeren mobil faz B karışımını kullanın.
    2. Aşağıdaki gradyanı kullanın: 0-2 dakika: %40 B; 2-2,5 dk: %40 B; 2,5-3 dakika: %58 B; 3-18 dk: %99 B; 18-20 dakika: %99 B; 20-20,1 dk: %40 B; 20.1-24 dk.
  3. Orbitrap Kütle Spektrometresi için, püskürtme voltajını pozitif mod için +3,5 kV, negatif mod için -2,5 kV olarak ayarlayın.
  4. Kılıf gazı akış hızını 45 Arb'ye, yardımcı gaz akışını ise 10 Arb'ye ayarlayın.
  5. Süpürme gazı akış hızını 2 Arb olarak ayarlayın.
  6. İyon transfer tüpünün sıcaklığını 300 °C'ye ve buharlaştırıcı sıcaklığını 320 °C'ye ayarlayın.
  7. Veriye bağlı edinim (DDA) modunu kullanın.
  8. MS1 için çözünürlüğü 120.000, tarama aralığı 100-2000 m/z, standart AGC hedefi, otomatik enjeksiyon süresi, dinamik dışlama 6 saniyeye ve yoğunluk eşiğini 5.0e4'e ayarlayın.
  9. MS2 için çözünürlüğü 15.000, otomatik tarama menzili, standart AGC hedefi, dinamik enjeksiyon süresi, izolasyon penceresi 1,6 m/z, çarpışma enerjisi tipini yüksek enerjili çarpışma ayrımcılığı (HCD) olarak ve normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE) olarak 15, 30 ve 40 kademeli değerlere ayarlayın.
  10. Ham verileri LipidSearch yazılımı veya diğer uyumlu platformlarla analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bileşik gözyaşı örnekleri, iki hafta arayla yapılan üç bağımsız ziyarette 16 sağlıklı gönüllüden toplandı (R1, en eski parti; R2, R3 her biri ardışık olarak iki hafta sonra toplandı). LipidSearch'i katı kriterlerle (örneğin, Sinyal-Gürültü Oranı ≥100, C derecesi veya üzeri, iyon yoğunluğu ≥30.000) kullanarak, sırasıyla R1-R3'te 773, 890 ve 1.025 benzersiz lipid türü tespit ettik (Şekil 5A). Pozitif iyon modunda %26,0 Grade A (yani, hem lipid sınıfı hem de ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PRT tabanlı gözyaşı örneklemesi ve lipid ekstraksiyonunun avantajları
Burada sunulan PRT tabanlı gözyaşı lipidomik iş akışı, kapsamlı gözyaşı lipid profili için minimal invaziv ve pratik bir örnekleme yöntemi sunar. Schirmer şeritlerine kıyasla, uzun süreli temas ve daha büyük örnek hacmleri gerektiren PRT örnekleri hızlıdır, 2 dakika içinde tamamlanabilir, daha az gözyaşı hacmi veya yüksek göz hassasiyeti olanlar dahil olmak üzere çeşitli popülasyonlar tarafından iyi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, InnoHK girişimi, Hong Kong Özel İdari Bölge Hükümeti ve Hong Kong Politeknik Üniversitesi'ndeki SHARP Vizyonu Araştırma Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Hong Kong Politeknik Üniversitesi'nin Kimya ve Çevresel Analiz Araştırma Tesisi (UCEA) ve Yaşam Bilimleri Araştırma Tesisi (ULS) tarafından sağlanan teknik desteği minnettarlıkla takdir etmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetonitril (ACN), LC-MS sınıfıRCI LabscanLM1005
BERAAT UPLC CSH C18 SütunuWaters Corporation186005297130Å, 1.7µ m, 2.1 mm X 100 mm
Amonyum formate, LC-MS derecesiSigma-Aldrich55674
Autosampler Cam ŞişesiWell Rich Scientific2ML-9-V10022mL Şeffaf Cam 12*32mm Düz Taban 9-425 Vida Dişli Şişe Etiketli (YAZMA Pediyle BIRLIKTE)
Mavi 9-425 Açık Üstü Kaburga Vida Kapağı Well Rich Scientific9-SP10039mm ile Beyaz PTFE/Kırmızı Silikon Septa 1mm
Kloroform, HPLC derecesiDuksan Reagentleri1271
Eppendorf Güvenli Kilitli Tüpler, 1.5 mLEppendorf30120086
Formik Acid (FA),  LC-MS derecesiThermoFisher ScientificA117-50
Cam mikro-insertWell Rich Scientific2ML-N2002250 µ L insert, şeffaf cam, poliyaylı konik taban, boyut: 5.8*28.5mm
İzopropanol, LC-MS sınıfıRCI LabscanLM1162
LipidSearch YazılımıThermoFisher ScientificOPTON-30879Sürüm 5
Metanol,   LC-MS derecesiRCI LabscanLM1115
Fenol Kırmızı İplik  (PRT)Tianjin Jingming Yeni Teknoloji Geliştirme Şirketi, Ltd20192160086
Soğutmalı SantrifüjThermoFisher Scientific75007200
Soğutmalı CentriVap Santrifüj Konsantratör ve CentriVap Soğuk TuzaklarıLabconco16108335
Vida Kapağı Mikro TüplerThermoFisher Scientific3488
tert-Butil metil eter (MTBE), HPLC derecesiDuksan Reagentleri1070
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPLCThermoFisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Termo Bilimsel Orbitrap IQ-X Tribrid MSThermoFisher ScientificFSN05-10001
TermoMikser CEppendorf5382000015
Ultrasonik TemizleyiciCrest UltrasonikP500D-45
Vortex MikserKıyaslamaBV1003

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esam, S., Singh, S., Konda, N., Gandhi, R., Vemuganti, G. K. Tear film lipid layer thickness: Measurement techniques, normative values and alteration in ocular surface diseases. Curr Eye Res. , (2025).
  2. Ambaw, Y. A., et al. Profile of tear lipid mediator as a biomarker of inflammation for meibomian gland dysfunction and ocular surface diseases: Standard operating procedures. Ocul Surf. 26, 318-327 (2022).
  3. Sheppard, J. D., Nichols, K. K. Dry eye disease associated with meibomian gland dysfunction: Focus on tear film characteristics and the therapeutic landscape. Ophthalmol Ther. 12 (3), 1397-1418 (2023).
  4. Lam, S. M., et al. Lipidomic analysis of human tear fluid reveals structure-specific lipid alterations in dry eye syndrome. J Lipid Res. 55 (2), 299-306 (2014).
  5. Borchman, D., Ramakrishnan, V., Henry, C., Ramasubramanian, A. Differences in meibum and tear lipid composition and conformation. Cornea. 39 (1), 122-128 (2020).
  6. Miyamoto, M., Sassa, T., Sawai, M., Kihara, A. Lipid polarity gradient formed by ω-hydroxy lipids in tear film prevents dry eye disease. eLife. 9, 53582(2020).
  7. Zhao, H., et al. Lipidomics profiles revealed alterations in patients with meibomian gland dysfunction after exposure to intense pulsed light. Front Neurol. 13, 827544(2022).
  8. Bland, H. C., Moilanen, J. A., Ekholm, F. S., Paananen, R. O. Investigating the role of specific tear film lipids connected to dry eye syndrome: A study on o-acyl-ω-hydroxy fatty acids and diesters. Langmuir. 35 (9), 3545-3552 (2019).
  9. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  10. Winiarczyk, M., Biela, K., Michalak, K., Winiarczyk, D., Mackiewicz, J. Changes in tear proteomic profile in ocular diseases. Int J Environ Res Public Health. 19 (20), 13341(2022).
  11. Bertram, M., et al. Influence of Schirmer strip wetness on volume absorbed, volume recovered, and total protein content in canine tears. Vet Ophthalmol. 24 (4), 425-428 (2021).
  12. Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3p medicine. EPMA J. 12 (4), 449-475 (2021).
  13. Gijs, M., et al. Pre-analytical sample handling effects on tear fluid protein levels. Sci Rep. 13 (1), 1317(2023).
  14. Kecskeméti, G., Tóth-Molnár, E., Janáky, T., Szabó, Z. An extensive study of phenol red thread as a novel non-invasive tear sampling technique for proteomics studies: Comparison with two commonly used methods. Int J Mol Sci. 23 (15), 8647(2022).
  15. Barmada, A., Shippy, S. A. Quantifying sample collection and processing impacts on fiber-based tear fluid chemical analysis. Transl Vis Sci Technol. 9 (10), 23(2020).
  16. Hao, Y., et al. Validation of the phenol red thread test in a Chinese population. BMC Ophthalmol. 23 (1), 498(2023).
  17. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. J Lipid Res. 49 (5), 1137-1146 (2008).
  18. Ulmer, C. Z., Jones, C. M., Yost, R. A., Garrett, T. J., Bowden, J. A. Optimization of Folch, Bligh-Dyer, and Matyash sample-to-extraction solvent ratios for human plasma-based lipidomics studies. Anal Chim Acta. 1037, 351-357 (2018).
  19. Lam, S. M., et al. Extensive characterization of human tear fluid collected using different techniques unravels the presence of novel lipid amphiphiles. J Lipid Res. 55 (2), 289-298 (2014).
  20. Quah, J. H., Tong, L., Barbier, S. Patient acceptability of tear collection in the primary healthcare setting. Optom Vis Sci. 91 (4), 452-458 (2014).
  21. Saini, R. K., Prasad, P., Shang, X., Keum, Y. S. Advances in lipid extraction methods-a review. Int J Mol Sci. 22 (24), 13643(2021).
  22. Chen, J., Nichols, K. K., Wilson, L., Barnes, S., Nichols, J. J. Untargeted lipidomic analysis of human tears: A new approach for quantification of o-acyl-omega hydroxy fatty acids. Ocul Surf. 17 (2), 347-355 (2019).
  23. Köfeler, H. C., et al. Recommendations for good practice in MS-based lipidomics. J Lipid Res. 62, 100138(2021).
  24. Ulmer, C. Z., et al. A review of efforts to improve lipid stability during sample preparation and standardization efforts to ensure accuracy in the reporting of lipid measurements. Lipids. 56 (1), 3-16 (2021).
  25. Sens, A., et al. Pre-analytical sample handling standardization for reliable measurement of metabolites and lipids in LC-MS-based clinical research. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 28, 35-46 (2023).
  26. Salem, M., Bernach, M., Bajdzienko, K., Giavalisco, P. A simple fractionated extraction method for the comprehensive analysis of metabolites, lipids, and proteins from a single sample. J Vis Exp. (124), e55802(2017).
  27. Fong, P. Y., et al. Role of tear film biomarkers in the diagnosis and management of dry eye disease. Taiwan J Ophthalmol. 9 (3), 150-159 (2019).
  28. Sanroque-Muñoz, M., et al. Tear-derived extracellular vesicles as diagnostic biomarkers for ocular and neurodegenerative diseases: Opportunities and challenges. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 6 (3), 609-625 (2025).
  29. Vera-Montecinos, A., et al. High throughput tear proteomics with data independent acquisition enables biomarker discovery in allergic conditions. Sci Rep. 15 (1), 31181(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tear LipidomicsPhenol Red ThreadTear Fluid SamplingLipid BiomarkersOcular Surface HealthMethanol MTBE ExtractionLC MS Lipid AnalysisTear Film StabilityMinimally Invasive SamplingLipid Species Identification

Related Articles