Yöntem makalesi

Nekroptoz Sırasında Lizozomal Membran Geçirgenliğinin Canlı Hücre Görüntülemesi

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 Kasım 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, lizozomal membran bütünlüğü ve asitleşmedeki değişiklikleri tespit eden floresan problar kullanarak, nekroptoz sırasında lizozomal membran geçirgenliğini izlemek için bir canlı hücre görüntüleme yöntemini açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Düzenlenmiş bir nekroz şekli olan nekroptoz, hücre zarı yırtılmasıyla sonuçlanır. Laboratuvarımız ve diğerleri, lizozomal membran geçirgenliğinin (LMP) bu süreçte, membran rüptüründen önce erken ve çok önemli bir olay olduğunu keşfettiler. Hızlı LMP, güçlü lizozomal enzimleri, özellikle proteazları sitozole salarak hücre ölümünü aktif olarak teşvik eder. Canlı hücre görüntüleme, nekroptoz sırasında LMP'yi gerçek zamanlı olarak tespit etmek için paha biçilmez bir araç sağlar. Birkaç floresan boya oldukça etkilidir: (1) pH'a duyarlı LysoTracker boyaları, lizozomal pH'daki değişiklikleri izler. Floresan sinyalindeki bir azalma, LMP'nin öncüsü veya doğrudan sonucu olabilen lizozomal disfonksiyonun birincil belirtisi olan lizozomal pH gradyanının kaybını gösterir. (2) Floresein etiketli dekstran boncuklar içselleştirilir ve lizozomlarda birikir. Sitozole salınmaları, tam LMP ve kargo sızıntısına işaret eder. Burada, nekroptoz indüksiyonundan sonra sitozole yayılan Dekstran floresansı ile ilerleyici bir Lysotracker floresan kaybı gözlemledik. Böylece, canlı hücre görüntüleme metodolojisi, araştırmacıların lizozomal disfonksiyonun zamanlamasını ve kapsamını hassas bir şekilde izlemesine olanak tanıyarak nekroptoz mekanizmalarının daha kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunur ve potansiyel terapötik müdahaleleri aydınlatır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekroptoz, birçok enflamatuar hastalık, nörodejeneratif bozukluk, akciğer, hepatik ve kalp hastalıklarında rol oynayan kaspazdan bağımsız bir düzenlenmiş hücre ölümü şeklidir 1,2,3. Bu yola, homotipik RIP etkileşim motifi (RHIM) alanları4,5,6 aracılığıyla reseptör etkileşimli protein kinaz 3 (RIPK3) ile etkileşime giren reseptör etkileşimli protein kinaz 1'in (RIPK1) aktivasyonu ile sonuçlanan karmaşık bir reaksiyon dizisi aracılık eder. RIPK3, sırayla, nekrozom 7,8'i oluşturmak için karışık soy kinaz benzeri proteini (MLKL) işe alır. MLKL'nin RIPK3 tarafından fosforilasyonu, oligomerizasyonuna ve ardından polimerizasyonuna yol açar. MLKL polimerleri daha sonra hücresel zarlara yer değiştirir ve sonunda hücre zarı yırtılmasına ve hücre ölümüne yol açar 9,10,11. Bununla birlikte, MLKL polimerlerinin membran bölmelerine yer değiştirdiği ve membran bozulmasına neden olduğu mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır.

Lizozomlar, hücresel materyallerin bozulmasından ve geri dönüşümünden sorumlu organellerdir. Lümeninde, makromoleküllerin sindirilmesinden sorumlu olan ve böylece hücresel homeostazı koruyan proteazlar, lipazlar, nükleazlar ve hidrolazlar vardır12,13. Bu nedenle, lizozomal bütünlüğün ve uygun işlevin korunması, etkili hücresel klirens, strese adaptasyon ve genel hücre sağkalımı sağlamak için gereklidir 14,15,16. Son çalışmalar nekroptoz ve lizozomal membran geçirgenliği (LMP) arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir17,18,19.

Son gözlemlerimiz, LMP'nin hücre zarının19 son yırtılmasından önce, nekroptoz sürecinde erken ve önemli bir olay olduğunu göstermiştir. Spesifik olarak, lizozomal membran üzerindeki MLKL polimerizasyonu, güçlü lizozomal enzimleri, özellikle katepsin B dahil proteazları sitozole salmak için hızlı LMP'yi indükler. Bu proteazlar daha sonra hücre ölümünü teşvik etmek için hayati proteinleri parçalar. Daha da önemlisi, CTSB aktivitesinin inhibe edilmesi, hücre ölümüne karşı güçlü bir şekilde koruma sağlar19,20. Bu veriler, LMP'nin nekroptoz yolunun çok önemli bir modülatörü olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, nekroptoz sırasında LMP'nin zamanlamasının izlenmesi, moleküler mekanizmaların anlaşılması ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesi için gereklidir.

İmmün boyama, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) veya akış sitometrisi gibi birçok geleneksel LMP tespit yöntemi, sabit numuneler gerektirir veya başka bir şekilde yalnızca son nokta bilgisi 21,22,23 sağlarve özellikle hızlı nekroptoz ilerlemesi bağlamında lizozomal bozulmanın dinamik sürecini yakalayamaz. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme yöntemi, nekroptoz sırasında LMP'nin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Bu protokolde, gerçek zamanlı olarak lizozomal membran bütünlüğünü analiz etmek için HT-29 hücrelerinde iki tamamlayıcı lizozomal belirteci ve indüklenmiş nekroptozu birleştirdik19. Bu teknik, LMP'yi yalnızca nekroptozda değil, aynı zamanda özellikle hastalıklar veya lizozom hedefli terapötiklerin kullanımı bağlamında lizozomal bütünlüğün tehlikeye girdiği diğer hücre stresi formlarında da potansiyel olarak incelemek için sağlam ve uyarlanabilir bir platform sağlar 24,25,26.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü - 0. gün

  1. Steril cam tabanlı bir tabakta %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve %1 Penisilin ve Streptomisin (P/S) ile desteklenmiş 2 mL DMEM'e (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) 5.000 hücre koyun.
  2. Hücreleri 37 °C'de %5CO2 ile gece boyunca inkübe edin.

2. Dekstran boncuk yükleme - 1. gün

  1. 2.5 mg/mL stok çözeltisinin 20 μL eklenmesiyle %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş taze DMEM'de dekstran yeşil boncuklarını 25 μg/mL'ye seyreltin.
  2. Eski ortamı çıkarın ve %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 2 mL boncuk içeren DMEM ile değiştirin.
  3. Boncukların lizozomlara içselleştirilmesine izin vermek için hücreyi 37 °C'de %5CO2 ile 24 saat inkübe edin.

3. Lysotracker boyama - 2. gün (deney günü)

  1. 1 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 2 mL taze DMEM'e 2 μL 1 mM Lysotracker stok çözeltisi ekleyerek boyama ortamını hazırlayın. Eski ortamı bu boyama çözeltisiyle değiştirin.
  2. Yaşam Teknolojileri 27 tarafından Moleküler Problardan Kullanım Kılavuzlarında sağlanan önerilen inkübasyon süresini (30 dakika ila 2 saat) takiben37 °C'de %5CO2 ile 2 saat inkübe edin. Deneylerimizde, HT-29 hücrelerinde 2 saatlik inkübasyon, stabil boya floresansını gösteren, dekstran boncuklarla güçlü kolokalizasyon ile sağlam punkta boyaması ile sonuçlandı.
    NOT: Canlı hücre görüntülemeden 30 dakika önce konfokal mikroskobu açın.

4. Konfokal mikroskop kurulumu

  1. Konfokal sistem bileşenlerini aşağıdaki sırayla açın: PC mikroskobu; tarayıcı gücü; lazer gücü; lazer emisyonu; Leica gücü.
  2. Çevresel kontrolleri açın: Küp - sıcaklık kontrolörü; Tuğla - CO2 gaz karıştırıcı kontrolörü. CO2 ve O2 beslemesini açın.
  3. Gaz parametrelerini ayarlayın:
    1. Sıcaklık kontrol cihazını (küp) 37 °C'ye ayarlayın.
    2. Gaz ve nem kontrol cihazını (tuğla) %5CO2 ve %95 neme ayarlayın.
  4. Görüntüleme odasını Şekil 1'de gösterildiği gibi monte edin.
  5. Konfokal hedefi ayarlayın:
    1. 63x/1,40 NA yağa daldırma objektifi kullanın.
    2. Uyarma lazerlerini 488 nm (yeşil florofor) ve 555 nm'ye (kırmızı florofor) ayarlayın.
    3. 488 nm lazer için bir Hibrit (HyD) dedektör seçin ve 555 nm lazer için bir PMT dedektörü seçin.
      NOT: Floresan karışma, konfokal yazılımda önceden tanımlanmış kapılar kullanılarak en aza indirildi ve bu da kanallar arasında karışma olmadığını doğruladı.

5. Boyama sonrası hazırlık (LysoTracker inkübasyonundan sonra)

  1. Hücreleri 2 mL PBS ile üç kez dikkatlice yıkayın.
  2. %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 2 mL taze DMEM ekleyin.
  3. Görüntülemeden önce objektif merceğine bir damla daldırma yağı uygulayın.
  4. Çanağı mikroskop tablasına monte edin.
  5. Lazer yoğunluğunu ve arka planını ayarlayın.
    1. Lazer yoğunluğunu %3'e kadar, ancak %5'ten fazla olmayacak şekilde ayarlayın.
    2. Sinyali optimize etmek için mikroskop yazılımındaki dedektör kazancını ayarlayın.
    3. Arka planı simge durumuna küçültmek için kontrast çubuğunu ayarlayın.
  6. Kontrol koşulu olarak hizmet eden işlenmemiş hücrelerin (T/S/Z ilavesinden önce) temel görüntülerini elde edin.
  7. Plakayı laminer akış başlığına geri koyun ve 100 ng/mL TNF-α (T), 500 nM SMAC mimetik (S) ve 100 μM Z-VAD-FMK (Z) içeren %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 1 mL DMEM ekleyin.
  8. Konfokal mikroskopta görüntülemeye devam edin.
    NOT: T/S/Z kasıtlı olarak standart protokollerden daha yüksek konsantrasyonlarda eklenmiştir. Bu seçim, LMP'yi ve hücre ölümünü hızlandırmak ve erken olayların gerçek zamanlı görüntülemede daha güvenilir bir şekilde yakalanmasına olanak sağlamak için yapıldı.

6. Görüntü alma ayarları

  1. Edinme yazılımında parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: mod: xyt; biçim: 512 x 512; hız: 400; yakınlaştırma: 3; satır ortalaması: 1; hat birikimi: 3; çerçeve birikimi: 1; zaman aralığı: 3 dakika; süre: 8 saat; Otomatik odaklamayı etkinleştirin.
  2. Hızlandırılmış alıma başlamak için Başlat'a tıklayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde açıklanan prosedürler, LMP'yi gerçek zamanlı olarak izlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücre görüntülerinin elde edilmesini sağlar. Şekil 1 , hücre kaplamadan görüntü elde etmeye kadar deneysel protokolün şematik bir temsilini göstermektedir. 0. Günde, 5.000 HT-29 hücresi kaplandı ve 37 °C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edildi. 24 saat sonra (1. gün), hücreler aynı koşullar altında 24 saat daha floresein etiketli dekstran boncuklarla (25 μg/mL) inkübe edildi. Bu boncuklar endositoz ve lizozomlara trafik yoluyla içselleştirilir, burada birikir ve parlak punkta olarak görünürler. 2. Günde (Deney Günü), hücreler 37 °C'de 2 saat boyunca pH'a duyarlı LysoTracker boyası (1 μM) ve% 5 CO2 ile muamele edildi. LysoTracker, geç endozomlar ve lizozomlar gibi asidik bölmelerde konsantre olur ve güçlü floresan sergiler. Görüntülemeden otuz dakika önce, protokolün 4. adımında açıklandığı gibi sıcaklık, gaz ve nem kontrolörleri dahil olmak üzere konfokal mikroskop sistemi açıldı ve stabilize edildi. Görüntüleme odası, Şekil 2'de gösterildiği gibi monte edildi. 488 nm (yeşil) ve 555 nm (kırmızı) lazerler kullanıldı.

LysoTracker ile inkübasyondan sonra hücreler PBS ile üç kez dikkatlice yıkandı ve %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 2 mL taze DMEM eklendi. Plaka mikroskoba aktarıldı ve 63x/1.40 NA yağa daldırma objektifine bir damla daldırma yağı uygulandı. Lazer yoğunluğu ve arka plan seviyeleri daha sonra adım 5.5'te açıklandığı gibi görüntüleme koşullarını optimize etmek için ayarlandı. protokolün. İlk görüntülerimiz, Lysotracker'ın stabil punktalarının ve bozulmamış lizozomları gösteren floresan etiketli dekstranın varlığını doğruladı (Şekil 3). Başlangıç görüntüleri T/S/Z'den önce elde edildi ve kontrol olarak kullanıldı. Araç uygulanmadı.

İlk görüntüleme ve mikroskopi ayarları yapıldıktan sonra, plaka laminer akış başlığına geri döndürüldü ve 100 ng/mL TNF-α (T), 500 nM SMAC mimetik (S) ve 100 μM Z-VAD-FMK (Z) içeren %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 1 mL DMEM eklendi. Görüntüleme, protokolün 6. adımında özetlenen görüntüleme toplama parametresi kullanılarak konfokal mikroskopta devam etti. Şekil 3, Ek film S1 ve Ek film S2'de gösterildiği gibi, T/S/Z ile tedavi edilen hücrelerde LysoTracker floresansındaki ilerleyici azalma, lizozomal değişimin erken bir göstergesi olarak hizmet etti. Bu kaybı, lizozomlardan sitozole (noktasaldan diffüze kayma) floresein etiketli dekstranın akışı izledi ve bazen aynı anda meydana geldi, bu da LMP'yi gösteriyordu. 8 saatte, neredeyse tüm Lysotracker sinyali kayboldu, ancak birçok hücre hala sitozolik yeşil sinyalli yeşil punktaları korudu, bu da lizozomal pH gradyan kaybının tam LMP ve kargo salınımından önce geldiğini düşündürdü.

Şekil 1
Şekil 1: Deney protokolünün şematik gösterimi. (BioRender.com'de oluşturuldu) Başlangıçta, 5.000 hücre kaplandı (0 saat) ve 24 saat inkübe edildi; bundan sonra Dekstran boncukları (25 μg/mL) eklendi ve 24 saat daha inkübe edildi. 48 saatte LysoTracker (1 μM) eklendi ve 2 saat inkübe edildi. Hücreler PBS ile üç kez yıkandı (adım 1), ardından %10 FBS ve %1 P/S ile desteklenmiş 2 mL taze DMEM eklendi (adım 2). Mikroskopi ayarları yapıldı (adım 3) ve hücreler, canlı hücre görüntüsü elde edilmeden önce (adım 5) TNF-α (T), SMAC mimetik (S) ve pan-kaspaz inhibitörü Z-VAD-FMZ (Z) (adım 4) ile tedavi edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Görüntüleme odası kurulumunun şeması. (A) Numune tutucu, (B) gaz inkübasyon odası ve (C) üst kapak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: T/S/Z tedavisinden önce ve sonra HT29 hücrelerinin temsili görüntüleri. Hücreler Lysotracker kırmızısı ve Dekstran yeşili boncuklarla boyandı ve TNF-α (T), SMAC mimetik (S) ve pan-kaspaz inhibitörü Z-VAD-FMZ (Z) ile muamele edildi. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film S1: Dekstran yeşil boncuklarla inkübe edilen ve T/S/Z ile muamele edilen HT29 hücrelerinin hızlandırılmış çekimi. Hücreler, hücresel yanıtı değerlendirmek için 6 saatten fazla izlendi. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Film S2: LysoTracker kırmızısı ile inkübe edilen ve T/S/Z ile tedavi edilen HT29 hücrelerinin hızlandırılmış çekimi. Hücreler, hücresel yanıtı değerlendirmek için 6 saatten fazla izlendi. Bu Filmi indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hem LysoTracker hem de floresein etiketli dekstran boncuklarının kombinasyonunun, lizozomal pH ve kargo salınımının gerçek zamanlı olarak eşzamanlı olarak izlenmesini sağladığını göstermiştir. Temsili sonuçlar (Şekil 3, Ek film S1 ve Ek film S2), tedavi edilmemiş hücrelerin her iki belirteç için de stabil bir puncta sinyali sağladığını doğrulamaktadır. Buna karşılık, T/S/Z tedavisi, LMP ile tutarlı olarak, Lysotracker yoğunluğunun ilerleyici bir kaybını ve dekstranın punktadan yaygın sitozolik dağılıma kaymasını gösterir.

Bu protokoldeki kritik bir ilk adım, görüntü elde etmek için hücrelerin seçilmesidir. Önceki verilerimiz, T/S/Z tedavisinin 24 saat içinde HT-29 hücrelerinin yaklaşık %80'inin ölümüne neden olduğunu ve kalan %20'sinin hayatta kaldığını göstermektedir19. Deneyin başlangıcında LMP mevcut olmadığından, hücreler başlangıçta morfolojiye ve hem LysoTracker hem de Dextran boncukları için ikili pozitif sinyallerine göre seçilir. Bu yöntem, hangi spesifik hücrelerin LMP'ye maruz kalacağını tahmin edemese de, izlenen popülasyonun yaklaşık %60'ının 8 saatlik görüntüleme süresi boyunca sonunda LMP sergilediğini tutarlı bir şekilde gözlemledik. Diğer bir zorluk ise sıralı görüntülemenin doğasında olan doğadan kaynaklanmaktadır. Her 3 dakikada bir görüntü alımı sırasında meydana gelen hücrenin Z konumundaki hafif bir kayma, tüm deney boyunca aynı puncta sinyalinin sürekli izlenmesini engeller. Ek olarak, hücreler göç eder ve T/S/Z-tedavisine yanıt olarak morfolojik değişikliklere uğrar28. Sonuç olarak, görüntüleme süresi boyunca tek tek lizozomların dinamiklerini takip etmek imkansızdır. Uzun süreli canlı hücre görüntülemede, hücre ölümünün bir aracısı olarak fototoksisitenin potansiyel katkısı önemli bir husustur. Uzun seanslar sırasında sürekli uyarım, reaktif oksijen türleri üretebilir ve hücre canlılığını29 bozabilir ve potansiyel olarak gerçek nekroptotik tepkiye müdahale edebilir. Bu etkiyi en aza indirmek için düşük lazer gücü ve kısa pozlama süreleri uyguladık. Ek olarak, hücre ölümü sürecini hızlandırmak için beş kez T/S/Z konsantrasyonu uygulandı. Bununla birlikte, ışığın neden olduğu stresin gözlenen lizozomal değişikliklere katkısını tamamen dışlayamayız.

Bu canlı hücre görüntüleme protokolünün önemli bir avantajı, lizozomal pH değişimini ve LMP'yi gerçek zamanlı olarak izleme, TEM, akış sitometrisi ve immün boyama gibi son nokta analizleri tarafından gözden kaçırılan dinamik olayları yakalama yeteneğidir. TEM, yüksek çözünürlüklü yapısal içgörü sunarken, LMP'nin zamansal ilerlemesini yakalayamaz. Akridin portakal yer değiştirme testleri30 veya galektin-punkta oluşumu31 gibi alternatif canlı hücre yöntemleri de lizozomal bütünlüğü izlemek için değerli araçlardır, ancak her birinin tek başına kullanıldığında sınırlamaları vardır. Akridin portakal tahlili, boyanın asidik organellerden sitozole yeniden dağılımını bildirir, bu da hem lizozomal pH değişikliklerinden hem de membran geçirgenliğinden etkilenir ve bu nedenle kargo salınımı ile doğrudan ilişkili değildir. Benzer şekilde, galektin-punkta oluşumu, lümen glikanlarının sitozole maruz kalmasını yansıtır ve bu nedenle lizozomal membran hasarını31,32 işaretler, ancak kısmi geçirgenlik ile tam lizozomal rüptür arasında ayrım yapmaz.

Bu protokolün temel gücü, lizozomal asitlenme ve kargo sızıntısının eş zamanlı araştırılmasına olanak tanıyan LysoTracker ve dekstran boncuklarının birleştirilmesinde yatmaktadır. Bu, hem lizozomal işlevsellik hem de yapısal bütünlük hakkında benzersiz, ikili bir okuma sağlar. LysoTracker solması, lizozomal pH'daki bir değişikliğin göstergesi olarak işlev görürken, dekstran salınımı doğrudan lizozomal içeriğin fiziksel sızıntısını bildirir. Bu iki belirteci birlikte kullanarak, hem kısmi hem de tam LMP'nin tespitini önemli ölçüde geliştiriyoruz. Bu nedenle, bu canlı hücre görüntüleme stratejisi geniş çapta uygulanabilir. Araştırmacılar, farmakolojik veya genetik bozulmalar da dahil olmak üzere çeşitli deneysel koşullar altında lizozomal bütünlüğü incelemek için bunu diğer hücre tipleri ve farklı floresan problarla kullanılmak üzere uyarlayabilirler. Bu yetenek, nekroptoz mekanizmalarına ilişkin anlayışımızı ilerletmenin ve potansiyel terapötik müdahaleleri belirlemenin anahtarıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Zhigao Wang'ın laboratuvarındaki araştırmalar, NIH hibeleri R35GM158455 ve R01GM147474 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HT-29 hücreleriATCCHTB-38Kolon Kanseri Hücreleri
35 mm cam tabanlı çanakMatTek ŞirketiP35G-1.5-14-C-GRD
CO2 Kuluçka MakinesiPHCBIMCO-170AICUVL
Konfokal MikroskopLeicaSP8WLL
Dextran yeşil boncuklarıThermoFisherD1820Dekstran, floressein, 10.000 MW, anyonik, lizin sabitlenebilir
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Aracı (DMEM)Corning 10-013-CV
Fetal Sığır Serumu (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker Red DND-99InvitrogenL7528
Yağ Daldırma Tipi HFElektron Mikroskopi Bilimleri16915-01
Penisilin ve Streptomisin (P/S) Sigma-AldrichP4333
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Corning21-040-CV
Smac mimetiği (S)BV6, ApexBio, KatalogB4653Son yoğunlaşma, 1 mM
The Brick Yaşam görüntüleme hizmetleri13685Gaz Mikseri CO2 Kontrolörü
KüpYaşam görüntüleme hizmetleriCBO2ASıcaklık kontrolü Oda mikroskopları
Tümör Nekroz Faktörü alfa (TNF-&alfa; - T)Peprotech30001A100UGSon konsantrasyon, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Son konsantrasyon, 20 mM

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Necroptosis MechanismsLysosomal DysfunctionFluorescent ProbesLysoTracker DyesDextran BeadsConfocal MicroscopyTime Lapse ImagingCell Death Induction

İlgili makaleler