Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Glial Fibriller Asitli Protein ve Hastalıkla İlgili Varyantlarının Biyokimyasal Analizi İçin Deneysel Yaklaşımlar

1.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

28 Kasım 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, GFAP ve hastalık neden olan mutasyonlarını biyokimyasal olarak karakterize etmek için filament montajı, toplama ve translasyon sonrası modifikasyona odaklanan deneysel yöntemleri ortaya koymaktadır. Yüksek saflıkta GFAP proteinleri analiz edildi ve Alexander hastalığı mekanizmalarına dair bilgiler ortaya çıkarıldı; bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek ve GFAP mutasyonları ile ilgili bozuklukları anlamak için bir çerçeve sağlayabilecektir.

Özet

Glial Fibriller Asit Protein (GFAP), astrositlerin merkezi sinir sistemindeki yapısal bütünlüğünü ve işlevini korumak için kritik öneme sahip önemli bir ara filament proteinidir. GFAP'taki mutasyonlar, GFAP seviyelerinin yükselmesi ve GFAP'nin Rosenthal lifleri şeklinde birikmesiyle karakterize edilen, nadir ve çoğu zaman ölümcül bir nörodejeneratif hastalık olan Alexander hastalığının (AxD) temel nedenidir. Burada, GFAP ve hastalık neden olan varyantlarının biyokimyasal karakterizasyonu için kapsamlı bir deneysel yaklaşımlar setini özetliyoruz. Optimize edilmiş ifade ve gelişmiş arıtma teknikleri kullanarak, hem vahşi tip hem de mutant GFAP proteinlerinin yüksek verimi ve saflığı elde ettik. Biyokimyasal testler, patojenik mutasyonların filament montajı, çözünürlüğü ve agregasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanıldı. Ayrıca, GFAP agregasyonundaki anormal posttranslasyonel modifikasyonların rolünü ve filament özellikleri üzerindeki etkisini araştırdık. Bu çalışma, GFAP'ın AxD'deki rolünü anlamamızı ilerletiyor ve GFAP disfonksiyonunu hedefleyen terapötik stratejiler geliştirmek için temel atar. Ayrıca, burada sunulan metodolojiler, GFAP mutasyonlarının biyokimyasal sonuçlarını araştırmak ve GFAP ile ilişkili bozukluklar için müdahaleleri ilerletmek için değerli araçlar olarak hizmet vermektedir.

Giriş

Alexander hastalığı (AxD), glial fibriller asidik protein (GFAP)1 için kodlayan gende baskın mutasyonlardan kaynaklanan genetik bir bozukluktur; bu protein, ağırlıklı olarak olgun astrositlerde bulunan bir ara filament (IF) proteinidir. AxD, GFAP yukarıregülasyonu 2, reaktifastroglioz 3 ve Rosenthal liflerinin birikimiyle karakterize edilir; bunlar çoğunlukla GFAP'den oluşan protein inklüzyonları ile birlikte αB-kristalin4 ve ubiquitin5 gibi proteinlerden oluşur. GFAP genindeki mutasyonlar, normal filamentmontajını 6 bozarak anormal bir agregasyona, hücresel stresyanıtlarının indüklenmesine ve fosforilasyon8, oksidasyon9 ve ubiquitination10 gibi anormal post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) yoluyla daha fazla istikrarsızlığa yol açar.

GFAP'ın AxD patolojisindeki merkezi rolüne rağmen, mutant GFAP'ın filament montajını bozması, agregasyonu teşvik etmesi ve hücresel stresi neden olduğu moleküler mekanizmalar hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Bu bilgi açığı, GFAP toplanması ve toksisitesini ele almak için hedefli tedavilerin geliştirilmesini engellemektedir. GFAP ve AxD ile ilişkili varyantlarının biyokimyasal özelliklerini incelemek, hastalık ilerlemesinin altında yatan moleküler mekanizmaların ortaya çıkarılması için çok önemlidir. Ancak, GFAP'nin agregasyona meyilli özelliği ve hastalıkla ilişkili varyantlarda değişen montaj davranışı, deneysel analiz için benzersiz zorluklar sunmaktadır. Kontrollü biyokimyasal çalışmalar, AxD mutasyonlarının filament montajı, toplama ve patolojik modifikasyonlar üzerindeki etkilerini incelemek için hayvan modellerinden veya rekombinant ekspresyon yoluyla elde edilen saflaştırılmış GFAP gerektirir.

Bu çalışmada sunulan deneysel yaklaşımlar, alternatif tekniklere kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, hücre tabanlı modeller11 ve immünohistokimyasalçalışmalar 12 GFAP ifadesi ve lokalizasyonu hakkında değerli bilgiler sunarken, hücresel ortamların karmaşıklığı nedeniyle filament montajı ve toplanması gibi kesin biyokimyasal mekanizmaları genellikle yakalayamıyorlar. Buna karşılık, burada tanımlanan yöntemler, örneğin in vitro filament montaj testleri, sedimentasyon analizleri ve PTM karakterizasyonu, GFAP ve hastalıkla ilişkili varyantlarının içsel biyokimyasal özelliklerinin kontrollü şekilde incelenmesini mümkün kılar. Bu yaklaşımlar, araştırmacıların filament montajı ve toplama davranışını basitleştirilmiş bir sistemde incelemesine olanak tanır ve GFAP işlev bozukluğunun altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır. Önceki çalışmalar, desmin13 ve keratin14 dahil olmak üzere IF proteinlerini analiz etmek için bu tür biyokimyasal tekniklerin faydasını göstermiş ve bu da bunların GFAP araştırmalarına uygulanabilirliğini vurgulamıştır.

Ayrıca, bu makale okuyucuların tarif edilen yöntemlerin kendi özel uygulamaları için uygun olup olmadığını belirlemelerine yardımcı olacak bilgiler sunar. GFAP'in biyokimyasal özelliklerini, toplanma davranışını veya PTM'leri incelemekle ilgilenen araştırmacılar, bu tekniklerin hastalıkla ilişkili varyantları ve patolojik etkilerini araştırmak için özellikle faydalı olduğunu bulacaklardır. Bu biyokimyasal yaklaşımları, hücre tabanlı çalışmalar veya hayvan modelleri gibi diğer deneysel sistemlerle entegre ederek, araştırmacılar AxD ve diğer ilgili astrositopatide GFAP disfonksiyonunu daha kapsamlı bir şekilde anlayabilirler.

Bu yöntemin genel amacı, GFAP ve AxD ile ilişkili varyantlarının biyokimyasal analizi için deneysel yaklaşımlar sunmaktır; bunlar arasında protein arıtma teknikleri, in vitro filament montaj testleri, sedimentasyon analizleri ve PTM karakterizasyonu bulunmaktadır. Bu yöntemler, AxD'de GFAP disfonksiyonunun moleküler temeline kritik bakış açısı sunar ve terapötik gelişimin yolunu açar. Ayrıca, bu deneysel tekniklerin uygulanması, AxD'de GFAP biyokimyasını anlamamızı ilerletecek ve IF araştırmalarının daha geniş alanına katkıda bulunacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, R237H knock-inmutasyonu 11'e sahip AxD model fareleridir. Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Tsing Hua Üniversitesi Yaşam Bilimleri ve Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından (NTHU IACUC Onay No. 109088 ve 111060) ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Tarım Rehberi'nin yönergelerine uygun olarak onaylanmıştır.

1. Rekombinant GFAP'nin bakterilerden arındırılması (Şekil 1)

  1. E. coli BL21(DE3) pLysS suşunu WT veya mutant GFAP'ın cDNA'sını içeren pET 23b vektörü ile dönüştürün.
  2. 1 L Luria-Bertani ortamında kültür bakterileri, 100 μg/mL ampisilin ve 34 μg/mL kloroamfenikol ile 37 °C'de %600 ile ~0.2 oranında OD600 ile takviye edilmiştir.
  3. İzopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid (IPTG, 0,5 M) nihai konsantrasyona 0,5 mM ekleyin; böylece 37 °C'de 4 saat boyunca GFAP ekspresyonunu indüke edin.
  4. Bakterileri santrifüjle 6.371 xg sıcaklığında 30 dakika boyunca 4 °C'de topla.
  5. 50 mL TEN tamponunda (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) liz bakterisi, Dounce homojenizatöründe homojenizasyon yoluyla 0,2 mM fnenilmetansulfonil florür (PMSF) ile takviye edilir.
  6. Santrifüj bakterisi 22.045 xg ile 20 dakika boyunca 4 °C'de lizat edilir ve ardından pelleti Triton X-100 tamponunda (TEN ile %1 (v/v) Triton X-100 alır).
  7. Aynı koşullarda santrifüjlemeden sonra, ortaya çıkan peleti yüksek tuzlu tampon içinde (TEN ile %1 (v/v) Triton X-100 ve 1,5 M KCl ile çıkarın.
  8. Aynı koşullarda santrifüjden sonra pelleti TEN tampon ile yıkayın.
  9. Son pellet, oda sıcaklığında 3 saat karıştırarak 10 mL üre tamponunda (8 M ürea, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA ve 0.2 mM PMSF) çözülür.
  10. Santrifüj üresi, masa üstü ultrasantrifüjde 4 °C'de 20 dakika boyunca 80.000 xg hassasiyette ekstrakt edilir.
  11. Üret çözünürlüğü fraksiyonuna %0,06 (v/v) nihai konsantrasyona kadar polietilenimin (%1 (v/v)) ekleyin ve 5 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
  12. 80.000x g 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın ve ardından süpernatan fraksiyonunu tampon A'ya (6 M üüra, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-merkaptoetanol) karşı diyaliz yapın.
  13. Diyalizatları, NGC Kromatografi Sisteminde tampon A'da önceden dengelenmiş bir CM-Sefaroz iyon değişim kolonuna yükleyin.
  14. Proteinleri 1 saat boyunca tampon A'da 0-0,5 M NaCl doğrusal gradyantı ile 1 mL/dakika akış hızında elüte edin.
  15. GFAP içeren fraksiyonları biriktirin ve tampon B'ye karşı diyaliz yapın (6 M ürea, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM EDTA).
  16. Diyalizatları tampon B'de önceden dengelenmiş bir anion değişim kolonuna yükleyin. Tampon B'de 0-0,5 M NaCl doğrusal gradyana sahip proteinleri 1 mL/dakika akış hızında 1 mL/dakika akış hızıyla elüte edin.
  17. SDS-PAGE ve Coomassie mavi boyama ile sütun fraksiyonlarını analiz edin. Arıtılmış GFAP içerenleri toplayın ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Bakteriyel lizi, birkaç donma ve çözülme döngüsiyle kolaylaştırılabilir. Polietileniminin nihai konsantrasyonu %0,06'yı (v/v) geçmemelidir; bu konsantrasyonun üzerinde proteinler de çöker. PMSF ve β-merkaptoetanol gibi tehlikeli maddelerle çalışırken, tehlikeli atık bertarafı için net güvenlik rehberleri ve talimatların dahil edilmesi kritik öneme sahiptir. PMSF son derece toksiktir ve cilt, göz ve solunum yollarında tahriş olabilir. PMSF çözümlerini taze bir buhar davlatında hazırlayın ve doğrudan temastan kaçının. β-merkaptoetanol iyi havalandırılan bir alanda kullanın çünkü güçlü ve toksik dumanlar çıkarır.

2. In vitro montaj ve sedimentasyon testi (Şekil 2)

  1. Saflaştırılmış WT veya mutant GFAP'ı düşük tuzlu tamponda 6 M ürede 0,3 mg/mL'ye seyreldin (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA ve 14,4 mM β-merkapetanol).
  2. Numuneleri, 4 M ve ardından 2 M üre içeren düşük tuzlu tampon ile oda sıcaklığında 4 saat diyalize yapın.
  3. Numuneleri düşük tuzlu tampon ile üresiz gece boyunca 4 °C'de diyaalize edin.
  4. Numuneleri oda sıcaklığında 10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl ve 14,4 mM β-merkapetanol) ile dialize et.
  5. Montaj karışımlarını, montaj tamponunda 0,2 mL 0,85 M sukroz içeren bir sakroz yastığının üstüne aktarın.
  6. Yüksek hızlı sedimentasyon testinde, karışımları 80.000 xg hassasiyetinde, 20 dakika boyunca 20 °C sıcaklıkta masa üstü mikro-ultrasantrifüj kullanılarak santrifüj edilir.
  7. Monte edilmemiş GFAP'ı metanol/kloroform çökeltmesi uygulayarak üst fraksiyondayoğunlaştırın 15. 0,2 mL Laemmli örnek tamponunda (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), %1 (w/v) sodyum dodesil sülfat (SDS), %12,5 (v/v) gliserol, %0,01 (w/v) bromofenol mavisi ve 355 mM β-merkaptoetanol) yeniden çökeltmeler.
  8. Toplu GFAP'ı Laemmli örnek tamponunda pellet fraksiyonunda yeniden askıya alın.
  9. Hem süpernatan hem de pellet fraksiyonlarını %10 (w/v) SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jeli üzerinde çalıştırın ve 10 mL Coomassie mavisi ile boyanın.
  10. Düşük hızlı sedimentasyon testinde, santrifüj montajı 3.000 xg sıcaklıkta, 5 dakika boyunca 20 °C'de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak karıştırılır.
  11. Üst fraksiyondaki agregasyona uğramamış GFAP formlarına 0.2 mL Laemmli örnek tamponu ekleyin.
  12. Toplu GFAP'yi doğrudan Laemmli örnek tamponunda toplanmış fraksiyona süpernatant fraksiyonuna orantılı bir hacimde yeniden askıya alın.
  13. Hem üst hem de pellet fraksiyonlarını %10 (w/v) SDS-PAGE jeli ile analiz edin, ardından Coomassie mavisi boyama yapıldı.
    NOT: Metanol ve kloroform toksik çözücülerdir ve ciddi sağlık etkilerine yol açabilir. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Dökülmeleri önlemek için buharlı bir davlumbaz içinde dikkatlice kullanın.

3. Negatif boyama ve elektron mikroskopisi (Şekil 2)

  1. Formvar/karbon kaplamalı bakır ızgaraları 45 saniye boyunca 20 mA'da Parlayan Deşarj Temizleme sisteminde boşaltma.
  2. Montaj karışımlarını parlayan tahşal ızgarasına gönderin ve örneklerin destek filmine 60 saniye bağlanmasına izin verin.
  3. Fazla sıvıyı ızgaranın kenarını bir parça blotlama kağıdıyla emerek çıkarın.
  4. Izgaraları damıtılmış suyla yıkayın, ardından 20 μL %1 (w/v) uranyl asetat ile 60 saniye boyan.
  5. Fazla leke çözeltisi çıkarın ve ızgarayı 30 saniye hava kurutmasına izin verin.
  6. Şebekeleri, 100 kV hızlandırma voltajında yüksek çözünürlüklü modda H-7600 geçirim elektron mikroskobu (TEM) altında inceleyin.
    NOT: Protein örneğini eklemeden önce ızgaraları vakum evaporatörde parlatarak boşaltmak, numunenin ızgaraya adsorpsiyonunu artırır. Uranil asetat, elektron mikroskopisinde negatif boyama için yaygın olarak kullanılan radyoaktif ve son derece toksik bir kimyasaldır. Personel ve çevre üzerindeki maruziyet risklerini en aza indirmek için güvenlik protokollerine ve tehlikeli atık bertaraf talimatlarına sıkı şekilde uyulmayı gerektirir. Uranyl asetat çözeltilerini sadece bir duman başlığında hazırlayın; böylece havadaki partiküllerin veya buharların solulmasını önleyin.

4. Oksidatif modifikasyon (Şekil 3)

  1. GFAP'ı düşük tuzlu tamponda (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA ve 14,4 mM β-merkapetanol) oda sıcaklığında 0,3 mg/mL'ye kadar seyreltin (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA ve 14,4 mM -merkapetanol).
  2. Oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca 4 M üre içeren düşük tuzlu tampona karşı diyaaliz yapın. Dengeli dağılımın korunması ve konsantrasyon gradyanlarının önlenmesi için manyetik karıştırıcı kullanarak tamponu nazikçe karıştırın.
  3. 2,5 saat sonra, diyaliz zarını 2 M üre içeren düşük tuzlu tampona oda sıcaklığında 2,5 saat daha aktarın; süreç boyunca nazik karıştırma sağlanır.
  4. Düşük tuzlu tampon ile üresiz 4 °C'de 18 saat boyunca diyaaliz yapın.
  5. Diyalizlenmiş örnekleri 10 mMH 2O2 ile 15 dakika boyunca tedavi edin, ardından oda sıcaklığında ek 15 dakika boyunca 10 veya 100 mM ditiothreitol (DTT) ile işlem yapın.
  6. Protein örneklerini standart %10 (w/v) SDS-PAGE ile β-merkapetanol olmadan analiz edin ve 10 mL Coomassie blue ile boyanın.
    NOT: H2O2 kullanırken, güçlü bir oksitleyici madde olduğu ve yanıklara neden olabileceği için dikkatli kullanın. Cilt ve gözlerle temas etmemek için kişisel koruyucu ekipman giyin. DTT, cilt, göz ve solunum sisteminde tahriş oluşmasına neden olabilir. DTT ve H2O2 ile çalışırken, riskleri en aza indirmek için doğru güvenlik protokollerine uymak çok önemlidir.

5. AxD farelerinin beyninden GFAP'nin arındırılması (Şekil 4A,B)

  1. Beyin dokularını Douce homojenizatörü kullanarak 10 mL TEN tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl ve 5 mM EDTA) ile çıkarın.
  2. Beyin santrifüjlenerek 76.000x g sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca homojenlenir ve ardından ortaya çıkan pelleti 10 mL Triton X-100 tamponu ile (TEN tamponunda %1 (v/v) Triton X-100) çıkarır.
  3. 76.000x g sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın ve ardından ortaya çıkan pelleti 10 mL sakaroz tamponuyla (0,85 M sukroz ve %0,5 (v/v) Triton X-100 TEN tamponunda çıkarın).
  4. 76.000 xg sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın ve ardından ortaya çıkan pelleti 10 mL yüksek tuzlu tampon ile (1,5 M KCl ve %0,5 (v/v) Triton X-100 TEN tamponunda) çıkarın.
  5. 76.000x g sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın ve ardından son pelleti 10 mL urea tamponu (8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 ve 5 mM EDTA) ile çıkarın.
  6. Üst fraksiyonu toplayın ve Q sütun tamponuna karşı diyaliz yapın (6 M ürea, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA ve 14,4 mM β-merkaptoetanol).
  7. Diyalizatları NGC Kromatografi Sisteminde bir anion değişim kolonuna yükleyin.
  8. Bağlı proteini 0-0,5 M NaCl doğrusal gradyanla Q tamponunda 1 mL/dakika akış hızında elüasyon yapın.
  9. GFAP içeren fraksiyonu biriktirin ve S sütun tamponuna (6 M ürea, 20 mM MES, pH 6 ve 14,4 mM β-merkaptoetanol) karşı diyalize yapın.
  10. Diyalizatları bir katyon değişim kolonuna uygulayın ve ardından bağlı proteinleri S tamponunda 0-1 M NaCl doğrusal gradyanı ile 1 mL/dakika akış hızında üütleyin.
  11. SDS-PAGE ve Coomassie mavi boyama ile elütlenmiş fraksiyonları analiz edin ve arıtılmış GFAP içerenleri toplayın.

6. Bağışıklık oblottasyonu ile GFAP ubiquitinasyonunun analizi (Şekil 4C)

  1. Temizlenmiş GFAP'ı %10 (v/siv) SDS-PAGE jeliyle çalıştırın.
  2. Jelden proteinleri nitroselüloz membranına aktarın.
  3. Zarı, 10 mL %3 (w/v) sığır serum albümini ile Tris tamponlu tuzlu suyumda (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) inkubka ederek oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0,1 (v/v) Tween 20 (TBST) içerir.
  4. Zarı, gece boyunca 4 °C'de 5 mL TBST ile seyreltilmiş 5 μL anti-GFAP ve 5 μL anti-ubiquitin birincil antikorlarıyla inkübe edin. Zarı TBST ile üç kez yıkayın.
  5. Zarı, 5 mL TBST ile incelenmiş 5 μL ikincil antikorlarla inkubasyon yapın; 5 mL TBST ile seyreltirilmiş ve oda sıcaklığında en az 1 saat uygulanır. Zarı TBST ile üç kez yıkayın.
  6. Flüoresan görüntü algılama sistemi kullanarak görüntü alın.
  7. Yerel GFAP'nin TEM ve sedimentasyon testleri ile in vitro montajını, 2.1'den 2.13'e ve 3.1'den 3.6'ya kadar olan adımlarda açıklanan aynı prosedürle analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AxD neden olan mutasyonların GFAP montaj özelliklerini nasıl etkilediğini araştırmak için, PET tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bakterilerde rekombinant proteinler ürettik. GFAP'ın ifade edilmesi ve arındırılması için protokolleri, örneğin WT GFAP'ı detaylandırıyoruz. IPTG indüksiyonundan sonra (Şekil 1A, şerit 2), GFAP dahil edici gövde hazırlığı (Şekil 1B) ve iyon değişim kromatografisi, CM sütunu (Şekil 1C, şerit 1) ve Q...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, GFAP ve hastalıkla ilişkili mutantlarının biyokimyasal karakterizasyonu için kapsamlı bir deneysel çerçeve oluşturur. Güvenilir ve standartlaştırılmış bir yaklaşım sunarak, bu yöntem GFAP'in biyolojik rollerini ve özellikle AxD bağlamında patolojik sonuçlarını anlamamızı geliştiren değerli bir kaynaktır. Bu bölümde, protokolün bazı kritik yönlerini tartışıyoruz; bunlar arasında olası modifikasyonlar ve sorun giderme stratejileri, yöntemin sınırlamaları, mevcut yaklaşımlara k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

R237H knock-in farelerini sağladığı için Dr. Tracy Hagemann'a (Waisman Center, Wisconsin-Madison Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışmaya yönelik Prof. Albee Messing'in (Waisman Center, Wisconsin-Madison Üniversitesi) önerisi ve desteği büyük takdir edilmektedir. Bu çalışma, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (111-2320-B-007-008 ve 112-2320-B-007-006 numaraları, N.-H. L. ve M.-D.P.'ye) hibelerle desteklenmiştir. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan ekipman için Ulusal Tsing Hua Üniversitesi'ndeki BioTEM'e (MOST-104-2731-M-007-002) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%30 Akrilamid/Bis çözeltisi 37.5:1Biorad1610158
Amonyum Persülfat (APS)Biorad1610700
AmpisilinUSB11259
anti-GFAP antikoruHücre Sinyal Teknolojisi12389
Anti-ubiquitin antikorMilliporeST 1200Klon FK2
Avanti J-26S XP SantrifüjBeckman
KloroamfenikolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Coomassie mavi boyasıUSB32826
Bakır ızgaraTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugeHitachiNA
Dounce homojenizatörüWheaton
DTTURDTT
E. coli BL21(DE3) pLysS suşuÇevik
EasiGlowTed Pella
ECL reaktifiPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
HiRes S SütunuCytiva2927 5877
HiTrap Q sütunuCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB orta (LB Agar)USB75851
LB orta (LB Sçorbası)BD Difco244620
merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
NGC kromatografi sistemiBioRad
Optima XE-90 UltrasantrifüjBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
polyehtyleneimineSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S RotorHitachi
S80AT3 RotorHitachi
SDSUSB75819
SDS-SAYFABiorad
StarBright Blue 520 keçi fare karşıtı IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 keçi anti-tavşan IgG BioRad12004161
SucroseSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Geçirim elektron mikroskobu H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Uranyl asetatElektron Mikroskop Bilimleri 22400
ÜreHoneywell15604H

Kaynaklar

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

GFAP MutasyonlarAlexander HastalAstrosit DisfonksiyonuFilament MontajProtein AgregasyonuPosttranslasyonel ModifikasyonlarTransmisyon Elektron MikroskopisiProtein Safla t rmaSDS PAGE
Glial Fibriller Asitli Protein ve Hastalıkla İlgili Varyantlarının Biyokimyasal Analizi İçin Deneysel Yaklaşımlar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.