Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

LC-MS/MS ile birincil ALL hücrelerinde vinkristinin hücre içi nicelendirilmesi için ex vivo mikroyönteminin geliştirilmesi ve standartlaştırılması

463 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69535

⸱

23 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

Bu makalede

Özet

Bu protokol, birincil pediatrik ALL hücrelerinde vinkristin birikiminin göreceli nicelendirilmesi için bir LC-MS/MS yöntemi oluşturmayı ve optimize etmeyi amaçladı.

Özet

Birincil pediatrik akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinde hücre içi vinkristin (VCR) niceliklendirilmesi, ilaç alımındaki örneklere özgü farklılıkları anlamak ve az hasta materyali kullanılarak yapılan deneysel çalışmaları desteklemek için gereklidir. Burada, hasta kaynaklı ksenograftlar (PDX) yoluyla elde edilen birincil TÜM hücreler için özel olarak optimize edilmiş sadeleştirilmiş bir LC-MS/MS mikro yöntemi sunuyoruz; sınırlı hücre kullanılabilirliği, küçük hücre boyutu ve birden fazla yıkama aşamasından sonra tekrarlanabilir iyileşme ihtiyacı gibi temel zorlukları ele alıyoruz. 1 ila 5 saat arasında değişen zaman analizleri, 3 saatlik kuluçka döneminin en yüksek ve en tutarlı hücre içi VCR seviyelerini, çoğaltmalar arasında daha düşük değişkenlik ile sağladığını göstermiştir. Yöntem optimizasyonu ayrıca, her koşulda 2,5 × 10-6 hücre kullanmanın, tekrar edilen deneylerde daha fazla dağılım gösteren 1 × 106 hücreye kıyasla analitik dayanıklılığı artırdığını ortaya koymuştur. Ek kritik iyileştirmeler arasında, protein çökeltme verimliliğini artırmak için soğuk metanolün kullanılması ve prosedürel değişimi izlemek ve en aza indirmek için iç bir standardın dahil edilmesi yer aldı. Yöntem, ilgili konsantrasyon aralıklarında hücre içi VCR'ın hassas ve hassas bir şekilde nicelendirilmesini sağlar, ancak test edilen en düşük doz (0,01 μM) 3 saatlik kuluçkadan sonra ölçülemezdi. Genel olarak, bu mikro yöntem, birincil ALL örneklerinde hücre içi VCR'ı ölçmek için pratik, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar. Tasarımı, karşılaştırmalı analizleri, ex vivo modellerin doğrulanmasını ve hücre içi ilaç niceliklendirmesini daha geniş farmakolojik değerlendirmelere entegre etmeye yönelik gelecekteki metodolojik uygulamaları desteklemektedir.

Giriş

Akut lenfoblastik lösemi (ALL), tüm çocukluk kanserlerinin yaklaşık %25'ini oluşturur ve en yaygın pediatrikmalignite 1,2 olarak kalmaktadır. Tedavideki ilerlemeler, ALL'nin biyolojik karmaşıklığının %90'ını aşan sağkalım oranlarını belirgin şekilde artırmış olmasına rağmen, hastalığı hücresel düzeyde daha iyi karakterize eden araçların geliştirilmesiçabalarını sürdürmektedir.

Vinca alkaloidleri, özellikle VCR, TÜM tedavi protokollerinin temelbileşenleridir 4. VCR, hücre içi sitotoksik etkilerini uyguladığı için, lökemik hücrelerde alımını ve birikimi kavramı, ex vivo sistemlerde ilaç yanıtı, farmakodinamik ve hücresel davranışı içeren çalışmalar için temel öneme sahiptir. Ancak, hücre içi ilaç seviyelerini değerlendirmek için mevcut yaklaşımların çoğu, dolaylı ölçümlere veya yarı nicel yöntemlere dayanır; bu da tekrarlanabilirlik ve duyarlılığı sınırlar. 5,6,7.

Paralel olarak, birçok araştırma hâlâ hasta kaynaklı birincil hücrelerin biyolojik heterojenliği ve klinik öneminden yoksun olan lösemi hücre hatlarına büyük ölçüde dayanmaktadır. Birincil örnekler genellikle sınırlı hücre sayıları, değişken örnek kalitesi ve düşük bolluklu hücre içi bileşikleri tespit edebilen yüksek hassasiyetli analitik tekniklere ihtiyaç gibi zorluklargetirir 8.

Sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS), KEMOTERAPÎ AJANLARıNıN HASSAS NICELIĞI için gerekli özgüllük ve hassasiyeti sağlarken, primer lökemik hücrelerde hücre içi VCR'ı doğrudan ölçmek için standart protokoller hâlâ nadirdir. Sınırlı hasta materyaliyle uyumlu sağlam mikro yöntemler oluşturmak, farmakolojik profilleme, ilaç-hücre etkileşimlerinin değerlendirilmesi ve hastalık alt tipleri veya terapötik koşullar arasında karşılaştırmalı çalışmalar dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesini kolaylaştırabilir.

Bu protokolde, birincil lökemik hücrelerde hücre içi VCR'ın ex vivo niceliklendirilmesi için LC-MS/MS kullanılarak geliştirilme ve optimize edilmesini anlatıyoruz. Yöntem geliştirme için yeterli materyal elde etmek amacıyla, hasta örnekleri immün eksikliği olan NSG farelerine nakledildi ve PDX modellerioluşturuldu 9. In vivo genişlemeden sonra, insan lökemik hücreleri izole edilipkriyokonserve edilmiştir 10. Sonrasında donatıldı, VCR ile kuluçka edildi, yıkandı, lizleştirildi ve LC-MS/MS ile hücre içi ilaç seviyeleri belirlenmek için analiz edildi.

Bu yöntem birkaç avantaj sunar: az sayıda hücre gerektirir (2,5 milyon), hassas ve hızlıdır ve klinik açıdan önemli birincil örneklerle uyumludur. Doğrudan hücre içi ilaç içeriğini ölçtüğü için, ilaç alımı, kemoterapiye hücresel yanıtlar veya hematolojik kanserlerde diğer farmakolojik soruları araştıran araştırmacılar için güvenilir bir nicel araç sağlar.

Genel olarak, bu protokol pediatrik ALL'in incelenmesi için mevcut analitik araç setini genişletir ve diğer ilaçlar veya örnek türleri için kolayca uyarlanabilir; böylece lösemi biyolojisi, ilaç davranışı ve hassas farmakoloji üzerine gelecekteki araştırmaları destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan lösemi örnekleri, Centro Infantil Boldrini'de tedavi edilen hastaların biyo-bankalı şişelerinden alınmıştır; bu kişiler hücrelerinin bilgilendirilmiş bir onay formu aracılığıyla kullanılmasına izin vermiştir. Proje, Kurumsal Etik Komitesi (CAAE 34601120.7.0000.5376) tarafından onaylandı. Hayvanlarda PDX üretimi protokolleri, Centro Infantil Boldrini'nin (CEUA/Boldrini 0011-2020) Hayvan Etik Komitesi'nin (Comissão de Ética no Uso de Animais) yönetmelikleri ve etik yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Numune hazırlama ve ilaç kuluçka (1. Gün)

  1. Stok ve çalışma çözeltilerinin hazırlanması
    1. 2,5 mg Vinkristin sülfat (molekül ağırlığı: 923 g/mol) tartın ve 2,0 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2,0 mL mikrotüpte çözerek 1,354 mM stok çözeltisi hazırlanır. Vortex tamamen çözülene kadar.
      DIKKAT: DMSO bir tahriş edicidir; Eldiven giyin ve kimyasal bir buhar davlumbonunda kullanın.
    2. 100 μM çalışma çözeltisini, 147,71 μL VCR stok çözeltisi ile 1.852,28 μL DMSO ile 2,0 mL mikrotüpte karıştırarak hazırlayın. Vortex'i iyice kontrol edin.
    3. 500 μL çalışan çözeltiyi dört adet 0,6 mL mikrotüpe dağıtın ve -20 °C'de birkaç aya kadar saklanın. Aliquotları üç kereden fazla eritmekten kaçının.
    4. 1.81 μL 1.1 mM stok çözeltisi (Vinblastin sülfat 1 mg/mL, moleküler ağırlık: 909.07 g/mol) ile 1.818.19 μL steril ultrasaf su karışımıyla 2.0 mL mikrotüpte 100 μM vinblastin (VINB) çalışma çözeltisi hazırlayın. Girdabı homojen olana kadar.
    5. VINB çalışan çözümünü VCR için yapılan şekilde Aliquot edin.
    6. Metanol + 0,1 μM VINB çözeltisi, 49,95 mL metanol ile 50 μL VINB çalışma çözeltisi 50 mL bir tüpte karıştırarak hazırlanır. Girdabı homojen olana kadar. Sıcaklığı -20 °C'de 3 aya kadar sakla.
      DIKKAT: Metanol zehirli ve yanıcıdır; uygun PPE'yi bir buharlı davlatmada kullanın.
    7. 49,95 mL ultrasaf su ile 50 μL formik asit karıştırarak su + %0,1 formik asit çözeltisi hazırlayın; bu çözelti 50 mL bir tüpte karıştırılır. Vortex iyi. Oda sıcaklığında (RT) sakla.
      DIKKAT: Formik asit aşındırıcıdır; Eldiven ve göz koruyucu ile tutun.
  2. Birincil hücrelerin eritilmesi ve yıkanması
    1. Kriyokonserif hücre örneklerini, şişeyi 15 mL 37 °C damıtılmış su içeren bir bedekte nazikçe dönerek eriterek tamamen eritilin.
      NOT: Hücre toplama ve dondurma protokolleriyle ilgili bilgiler önceki yayınlardabulunabilir 9,10.
    2. Şişenin içeriğini, steril tek kullanımlık bir Pasteur pipeti ile 10-15 mL steril 1x PBS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 300 × g'de RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Tüpü ters çevirerek süpernatantı at.
    4. Pellet, tek kullanımlık Pasteur pipeti ile 10 mL AIM V ortamında yeniden süzülür. Canlı hücreleri sayın ve otomatik sayaç kullanarak ortalama hücre boyutunu ölçün.
      NOT: Toplanan hücre sayısına göre en az %80 canlılık gösteren hücrelerin kullanılması önerilir.
    5. Ölçülen konsantrasyona dayalı basit bir oran kullanarak 2,5 × 106 canlı hücre toplamak için gereken hacmi, hesaplayın. Örneğin, konsantrasyon 5 × 106 hücre/mL ise, gerekli hacmi 0,5 mL'dir.
      NOT: Veri tekrarlanabilirliği için her tedaviyi üçlü olarak gerçekleştirin. Otomatik hücre sayacında sağlanan hücrelerin orta boyutunu saklayın; Hücrelerin hacmini hesaplamak için kullanın.
  3. Uyuşturucu tedavi kurulumu
    1. Toplam 2,0 mL hacimde 1 μM nihai konsantrasyona ulaşmak için gereken VCR çalışma çözeltisi hacmini hesaplayın. Pipetlemeden önce stok çözeltiyi vortex ile geçirin.
    2. AIM V ortamı, ardından 2.5 × 106 hücre ve son olarak VCR çözeltisi 2.0 mL mikrotübe eklenin. Kısa bir girdap yapın ve hafifçe aşağı doğru dönerek (5 saniye) boru kapağından sıvı toplayın.
    3. Açık tüpleri 37 °C, %5CO2 sıcaklığında 3 saat kuluçka edin.
    4. İnkubasyondan sonra kapakları kapatın ve örnekleri RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüjle yapın.
    5. Süpernatantı pipet ile dikkatlice at, sonra RT seviyesinde tüpe 1 mL PBS ekleyin.
    6. Santrifüjasyonu 300 × g boyunca RT'de 5 dakika tekrarlayın, süpernatant çıkarımı ve PBS yıkamasını iki kez daha yapın, toplamda üç yıkama elde edilir.
    7. Tüm üst yüzeyleri pipet ile dikkatlice çıkarın, pelleti 100 μL PBS ile tekrar askıya alın ve pellet tamamen yeniden askıya alınana kadar girdabla yapın.
    8. Tüp duvarlarıyla temas kurarak doğrudan numuneye 400 μL soğuk metanol + 0.1 μM vinblastin (-20 °C) ekleyin.
    9. Örnekleri gece boyunca -80 °C'de saklayın.
      NOT: Örnekler birkaç hafta boyunca -80 °C'de saklanabilir (güvenli bir nokta).

2. LC-MS/MS için Örnek İşlemi (2. Gün)

  1. Örnek çıkarma
    1. Santrifüjü önceden 4 °C'ye soğutmadan sonra -80 °C dondurucudan örnekler alın.
    2. Örnekler dondurucudan alındıktan hemen sonra, 13.000 × g ile 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    3. 300 μL süpernatan 1.5 mL mikrotübe aktarın.
    4. Örnekleri 40-45 °C sıcaklıkta vakum konsansantörü ile 1 saat ve 40 dakika boyunca tamamen kurutun.
      NOT: Kurutulmuş peletler -20 °C'de birkaç hafta saklanabilir (güvenli bir nokta).
    5. Her peleti 400 μL suda + %0,1 formik asit (önceden hazırlanmış) tekrar askıya alın. Pellet tamamen çözünene kadar nazikçe girdabla hareket ettirin.
    6. Numuneleri tekrar 13.000 × g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    7. 300 μL süpernatantı LC-MS/MS analizi için 2.0 mL vidalı bir şişeye aktarın.

3. LC-MS/MS kurulumu ve veri toplama

  1. Mobil faz hazırlığı ve kolon koşullandırması
    1. Solvent A'yı ultrasaf suyu %0,1 formik asit ile karıştırarak hazırlayın.
    2. Solvent B'yi asetonitrile %0,1 formik asit karıştırarak hazırlayın.
      DIKKAT: Asetonitril zehirlidir ve yanıcıdır; kimyasal bir buhar davlumbazında tutun.
    3. Her çözücüyü ultrasonik banyoda 5 dakika boyunca soniklendirin. Şişeleri pompa modülüne bağlayın ve sistemi yüksek akışta temizleyerek kirleticileri temizleyin.
    4. Ters faz BEH C18 kolonu (1.7 μm, 2.1 mm × 50 mm) takın.
      NOT: Analizi gerçekleştirmek için, bu çalışmada Xevo TQS-Micro üçlü kuadrupol kütle spektrometresine bağlı Acquity H-Sınıfı kromatografik sistem kullanıldı.
    5. Daha önce hazırlanmış A ve B Çözücülerinden oluşan ikili gradyan kullanın.
    6. İlk 2 dakika boyunca kromatografik gradyanı Solvent B'nin %5'inden %95'ine kadar çalıştırın, ardından kolon yıkama ve yeniden dengeleme için 2 dakika Solvent A'yı uygulayın.
    7. 4 dakikalık koşu boyunca akış hızını 0.2 mL/da'ya ayarlayın. Kolon sıcaklığını 40 °C'de tutun ve her örnekten 10 μL enjekte edin.
  2. LC-MS/MS yöntem kurulumu
    1. LC-MS/MS yazılımını açın. Yeni bir yöntem başlatmak için Yeni > MS Yöntemi > Dosya'ya tıklayın.
    2. Fonksiyon sekmesine gidin ve fonksiyon türünü çoklu reaksiyon izleme (MRM) olarak ayarlayın. VCR ve VINB (iç standart) için Tablo 1'de listelenen iyon geçişleri ve parametreleri girin.
    3. Satın alma süresini 4 dakikaya ayarlayın. Kaydetmek için Başvur'a tıklayın.
      NOT: Enjeksiyonlar arasında kolonun yeniden dengelenmesini sağlamak için 4 dakikayı geçmeyin.
    4. UHPLC parametrelerini Giriş Yöntemi > LC Yöntemini Düzenle ve .mth dosyası olarak kaydedin (Tablo 2).
    5. Kaynak parametrelerini Tune sekmesinin altında Tablo 3'e göre ayarlayın. .tun dosyası olarak kaydet.
    6. Tam yöntemi kaydet: File > Save As ve Export as .mth dosyası.
  3. Örnek listesi oluşturmak ve koşunu başlatmak
    1. Yazılımın ana ekranında Örnek Listesi'ni açın ve örnek isimlerini, enjeksiyon hacimlerini, şişe konumlarını ve kullanılacak yöntemi içeren bir liste oluşturun.
    2. Ultra saf su dolu bir şişeni otomatik numune tepsisine yerleştirin ve onu boş olarak belirleyin. Her üçlü enjeksiyon seti arasında boşluk koyarak aktarma riskini önleyin.
      NOT: Çalışmaya başlamadan önce, kolon basıncının (ΔP) sabit ve 10 psi'den az olduğundan emin olun.
    3. Örnek Listesi'nde istenen satırları seçin ve veri toplamaya başlamak için Çalıştır > OK tuşuna tıklayın.

4. Veri analizi

  1. Veri görselleştirme ve dışa aktarma
    1. Çalışma tamamlandıktan sonra, bir örnek seçip üst menü çubuğundaki Chromatogram'a tıklayarak kromatografileri görüntüleyin.
    2. Ana ekranda TargetLynx'e tıklayın, az önce çalışan dosyaları seçin ve Process > Vincristine yöntemini OK > seçin, çıktı tabloları oluşturun.
    3. Rapor > Dışa Aktarma Tablosu'na tıklayın ve işlenen verileri .csv veya .xlsx dosyası olarak kaydedin.
      NOT: Hem analiz hem de iç standart için ham zirve alanlarını ihraç edin.
  2. Veri organizasyonu ve oran hesaplaması
    1. Dışa aktarılan dosyayı açın ve aşağıdaki sütunları oluşturun:
      1. Örnek: Numune veya şişe adını ekleyin.
      2. Çalıştır: Değerin hangi kopyaya karşılık geldiğini belirt.
      3. VCR Alanı: Vincristine için zirvenin altındaki alanı girin.
      4. VINB Alanı: Vinblastin için zirvenin altındaki alanı girin.
      5. VCR/VINB Oranı: Her VCR değerini karşılık gelen VINB değerine bölerek normalleştirin.
    2. Her üçlü set için VCR alanı, VINB alanı ve VCR/VINB oranının standart sapma değerleri için sütunlar ekleyin.
      NOT: İç standart kullanılarak normalleştirme, ekstraksiyon veya enjeksiyon hacmindeki değişimlerin düzeltilmesine olanak tanır.
  3. Çizim sonuçları
    1. Tercih edilen grafik yazılımını açın ve Gruplanmış Tablo formatını seçin.
    2. Gir veya veri yeni bir tabloya aktar seçeneğini seçin ve Seçenekler altında, yan yana alt sütunlarda 3 kopyalama değeri girin.
    3. Her örnek için yalnızca normalize edilmiş VCR/VINB oranlarını çizin, ham alan değerlerini çıkarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

VCR ve VINB ile inkubasyon edilen primer ALL PDX hücreleri kullanılarak hücre içi birikme testlerinden elde edilen temsil kromatografik sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Örnekler, her koşul başına 2,5 × 106 hücre kullanılarak hazırlandı. Anlatılan kromatografik koşullarda, VCR 2,85 dakika boyunca tutarlı şekilde minimum matris etkisiyle korundu ve zirve şekli simetrik ve iyi çözüldü. Bu profiller, protokol doğru şekilde yürütüldüğünde VCR ve VINB'nin beklenen kromatografik davra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Birincil lökemik hücrelerde hücre içi ilaç seviyelerinin doğru değerlendirilmesi, hücresel düzeyde ilaç kullanımını anlamak ve moleküler profillemeyi tamamlayan fonksiyonel testlerin geliştirilmesini desteklemek için gereklidir. Mevcut analitik yaklaşımlar genellikle çok sayıda hücre gerektirir, uzun işleme adımları gerektirir veya kemoterapi ajanlarının gerçek hücre içi kullanılabilirliğini yansıtmayan dolaylıokumalara dayanır 5,6

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Centro Infantil Boldrini'ye ve çalışma için örneklerini bağışlayan tüm hastalara teşekkür ederiz. Adrielli C. Soares, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) ve São Paulo Araştırma Vakfı'ndan (FAPESP, 2023/18389-3) burs aldı. José A. Yunes, Ulusal Teknolojik ve Bilimsel Kalkınma Danışmanlığı'ndan (CNPq, 308399/2021-8) verimlilik bursu aldı. Bu çalışma, Brezilya Sağlık Bakanlığı'nın PRONON programı (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45) tarafından desteklenen araştırma finansmanıyla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2.0 mL vidalı kapaklı şişeAkış Kaynağı8-2400Aynı şirketten yaylı (5 x 29 mm) cam eklerle (Cat. 5-29015) kullanılmıştır
2.0 mL vidalı kapaklı şişeAkış Kaynağı8-2400Aynı şirketten yaylı (5 x 29 mm) cam eklerle (Cat. 5-29015) kullanılmıştır
AsetonitrilMerck (Sigma-Aldrich)100030
AsetonitrilMerck (Sigma-Aldrich)24010152
AIM VThermo Fisher Scientific12055091
Kromatografik sistem Acquity UPLC H-SınıfıWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Countess 3 FLThermo Fisher ScientificA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Formik asitMerck (Sigma-Aldrich)F0507
Cam şişeMerck (Sigma-Aldrich)41121800
Kuluçka makinesiPHCBIMCO-50M-PE
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)34860
Mikrotüp 1.5 mLEppendorf41121702
Mikrotüp 2.0 mLEppendorf30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
Veri toplama yazılımıWaters Co.MassLynx
Üçlü dörtlü kütle spektrometresi Xevo TQ-S mikroWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
Ultrasonik SonikatorQuimisQ335D
Vinblastin 1 mg/mLLibbshttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/Vinblastin sülfat
VincristineCayman Chemicals11764

Kaynaklar

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
  2. Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).
  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cre i Vinkristinla KantifikasyonuHasta Kaynakl KsenogreftlerProtein PresipitasyonuStandartPediyatrik L semiZaman Serisi Analizi
LC-MS/MS ile birincil ALL hücrelerinde vinkristinin hücre içi nicelendirilmesi için ex vivo mikroyönteminin geliştirilmesi ve standartlaştırılması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.