Hayvan çalışması protokolü, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Hazırlık
- 300-320 g ağırlığında 216 spetsifik patojensiz (SPF) erkek Sprague-Dawley (SD) faresi alın.
- Deneyden önce fareleri barınma ortamına 1 hafta alıştırın.
- Konut koşullarını 23 ± 3 °C, %45 ± %5 nem ve 12 saat ışık/karanlık döngü (ışıklar sabah 8:00'de yanık, akşam 8:00'de kapanıyor) tutun.
- Her kafeste beş fare bulundurulabilir ve steril standart yiyecek ve suya imkansız erişim sağlanır.
NOT: Nazik müdahale ve optimize edilmiş prosedürlerle (örneğin, solunum baskısını önlemek için ayarlanabilir kısıtlamalar) kullanılarak kullanılan hayvan sayısını en aza indirin ve acıyı azaltın.
2. Orta beyin arter tıkanması (MCAO) ameliyatı
NOT: Bu adım, Bederson ve ark.6'dan modifiye edilmiş MCAO/reperfüzyon (MCAO/R) modelinin kurulmasını tanımlar.
- Fareleri ameliyata hazırla.
- Fareleri ameliyattan önce gece boyunca (12 saat) oruç tutun (su kısıtlaması yok).
- Fareleri % 1 sodyum pentobarbital (50 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonla anestezi edin.
NOT: Ek ağrı aljezikleri uygulanmadı, çünkü sodyum pentobarbital yalnızca anestezik olarak kullanıldı.
DIKKAT: Sodyum pentobarbital kontrollü anesteziktir. Bir duman kaputu içinde tutun, eldiven ve gözlük takın, kurumsal düzenlemelere göre kilitli bir dolapta saklayın.
- Ameliyat bölgesini güvence altına alın ve hazırlayın.
- Anestezi altındaki fareleri sırtüstü pozisyona yerleştirin ve uzuvlarını düzeltin.
- Boyun tüylerini tıraş edin ve cildi uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edin (örneğin, %75 etanol).
- Boyun damarlarını açığa çıkar ve hazırlayın.
- Boyun derisinde 2-3 cm orta çizgi kesi yapın, ardından deri altı bezleri ve fasyaları kesin ve kesin. CCA'nın dalları tarafından oluşturulan ortak karotis arter (CCA), iç karotis arter (ICA) ve dış karotis arter (ECA) ayrılır.
- CCA'yı bulun, altına iki dikiş yerleştirin, birini kalp ucuna yakın bağlayın ve CCA'nın diğeriyle bifurkasyonuna yakın canlı bir düğüm bağlayın.
- CCA'nın bifurkasyona yakın distal ucunu kapatmak için arteriyal kelepçe kullanın.
- ECA'yı bulup dikişle bağlayın.
- MCA'yı kapatmak için dikişi yerleştirin.
- CCA'nın proksimal ucundaki ligasyon bölgesi ile arter klipsinin sıkıştırma bölgesi arasında duvarda dikkatlice bir kesi kesin, ardından bu kesiye özel bir diş tıkası (monofilament dikiş) yerleştirin.
- Arteriyal klipsi açın ve çataldan iplik tıkasını ICA'ya takın, hafif direnç hissedilene kadar sonra durdurun (Şekil 1).
NOT: Dikiş uzunluğu (18 mm ± 2 mm) tutarlı MCA tıkanması için kritiktir; Fare ağırlığına göre biraz ayarlama yapın (300-320 g).
- Iskemi ve reperfüzyonu indük edin.
- Iskemiyi 2 saat boyunca koruyun (tam zamanlı olarak kronometre ile ölçülür).
- 2 saat sonra, MCA kan akışını yeniden sağlamak için dikişi nazikçe çıkarın, fazla dikişi kestin ve arterial klipsi çıkarın.
- Ameliyat bölgesini kapatın ve iyileşmeyi izleyin.
- Kesiyi steril salinle sula, ardından deri altı doku ve deri dik.
- Fareleri bilinçlerine gelene kadar 25 ± 1 °C sıcaklıkta tutulan bir kurtarma kafesine yerleştirin; 24 saat boyunca kanamayı veya sıkıntıyı takip edin.
- Sahte operasyon grubunu kur.
- 2.1-2.3. adımlardaki boyun diseksiyon ve damar maruziyetini aynı şekilde yapın.
- Dikişi CCA'ya sadece 5 mm sokuyor, sonra hemen çıkarın; Kesiyi MCA tıkanıklığı olmadan dikin.
3. Hayvanların gruplanması
- Nörolojik puanlama için fareleri rastgele altı gruba ayırın (başlangıçta grup başına n = 36).
- İnme grubu: Sadece MCAO, davranışsal kısıtlama veya ilaç tedavisi yok.
- PSD grubu: MCAO + davranışsal kısıtlama + izolasyon konutması, ilaç tedavisi yok.
- FXT grubu: MCAO + davranışsal kısıtlama + izolasyon yuvası + fluoksetin hidroklorür garajı.
- YNJYP grubu: MCAO + davranışsal kısıtlama + izolasyon konut + Yi-nao-jie-yu reçeteli (YNJYP) garajı.
- Boş grup: Hiçbir işlem yapılmadı.
- Sahte operasyon grubu: Orta beyin arterinde tıkanıklık yok.
- 0 veya 4 puanı olan veya ameliyat sonrası ölen fareleri hariç tutun.
- MCAO'dan 24 saat sonra Longa7 nörolojik skorlama yapın ve nitelikli fareleri seçin.
- 5 puanlı Longa ölçeğini kullanın: 0 = açığı yok; 1 = kuyruk tarafından kaldırıldığında ön uzuv fleksiyonu; 2 = paretik tarafa doğru dairesel yürümek; 3 = paretik tarafa doğru düşmek; 4 = bilinçsizlik veya yürüyememe.
4. Fluoksetin hidroklorürit (FXT) ve YNJYP uygulaması
- YNJYP ve FXT hazırlayın.
NOT: YNJYP altı Çin tıbbi maddesi içerir: Ciwujia (Acanthopanax senticosus kökleri) 30 g, Yujin (Curcuma longa rhizomes) 10 g, Wuweizi (Schisandra chinensis meyveleri) 15 g, Zhizi (Gardenia jasminoides meyveleri) 10 g, Danshen (Salvia miltiorrhiza kökleri) 15 g ve Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong ) köksaplar) 15 g (Pekin Çin Tıp Üniversitesi Üçüncü Bağlı Hastanesi Eczacılık Bölümü tarafından sağlanmıştır). Öncekiçalışmalara dayanarak 8, intragastrik uygulama dozu 9,92 g/(kg·d) olarak belirlendi.
- Fluoksetin hidroklorür kapsüllerini damıtılmış suda çözerek kullanıldığında 0.233 g/L konsantrasyon elde edilir. Yetişkin dozunun yedi ile çarpılmasına göre, fareler için dozu 2.33 mg/(kg·d) olarak ayarlayın.
- Uyuşturucuları gavaj yoluyla verin.
- Gavaj uygulamasına MCAO sonrası 1. günde başlayın ve deneyin sonuna kadar devam edin; işlem sabah tüm gruplarda tutarlı şekilde uygulanır.
- FXT grubuna 2,33 mg/(kg·d) FXT, YNJYP grubuna 9,92 g/(kg·d) ve inme ile PSD gruplarına %0,9 normal salin (10 mL/kg) verin.
NOT: 1 mL gavaj iğne kullanın; İğnenin mideye (trakeaya değil) yerleştirildiğinden emin olun, aspirasyon önlenmesi için.
5. Kronik hafif stres (davranışsal kısıtlama) ve izolasyon konut birleşimi
- MCAO sonrası 7. günde davranışsal kısıtlama ve izolasyon konutlarına başlayın (akut felç evresinden kaçınmak için).
- Özel T şeklindeki emniyet platformunu hazırlayın.
- Platform, bir tabandan (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) ve bir tutma alanından (22 cm × 6,6 cm) oluşur.
- Emniyet alanı, sıçanın başı ve uzuvlarını sabitlemek için yuvalar ve farklı fare boyutlarına uyacak üç ayarlanabilir kayış içerir (Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4).
NOT: Platform, Chen3 ve Tian4'ten modifiye edilmiş olup, inme hastalarının paretik duruşunu simüle etmek için ek ön uzuv yuvaları eklenmiştir.
- Günlük kontrolünü yapın.
- Sirkadiyen yanlılığı önlemek için her gün rastgele bir 2 saatlik pencere seçin (örneğin, 9:00-11:00 veya 14:00-16:00).
- Her fareyi yuvalar ve kayışlarla platforma sabitleyin; Sıkılığı ayarlayarak zorlanmayı önleyin ama solunum baskısını engellemeyin.
- 7 gün ardı ardı 2 saat boyunca sürekli olarak kısıtlı kalın.
- Ev fareleri izole içinde.
- PSD, FXT ve YNJYP gruplarındaki fareleri grup konut (kafes başına beş fare) davranışsal kısıtlama başlangıcında tek kafeslere aktarmak.
- Davranışsal kısıtlama tamamlanana kadar tek konut tutun (MCAO sonrası 14. gün).
6. Sukroz tüketim testi (SCT)
NOT: MCAO'dan 2, 4 ve 8 hafta sonra her gruptan rastgele altı fare seçin. Tüm fareleri SCT, OFT ve FST sırasına göre test edin.
- Sıçanları teste hazırlayın.
- Sınavdan önce 24 saat boyunca oruç tutun ve fareleri sudan mahrum bırakın.
- Test odası sıcaklığının (23 ± 2 °C) ve aydınlatmanın konut ortamına uygun olduğundan emin olun.
- Testi yap.
- Her kafese iki şişe (her biri 150 mL) yerleştirin: biri musluk suyu, diğeri %1 sakaroz çözeltisi içeriyor.
- 1 saat serbest içtikten sonra, tüketilen sukroz çözeltisi ve su miktarlarını kaydedin.
- Sükroz tercihini hesaplayın.
- Şu formülü kullanın: Sukroz tercihi (%) = (Tüketilen sukroz çözeltisi hacmi / Toplam tüketilen hacim) × %100.
- İçme süresinin ortasında iki şişenin pozisyonlarını değiştirerek pozisyon yanlılığını ortadan kaldırın.
7. Açık alan testi (OFT)
NOT: FST için kullanılan her gruptan 2, 4 ve 8 haftalık fare partisini seçin. Sıçanları testten önce 24 saat boyunca oruç tutun ve tutarlı fizyolojik koşulları korumak için sudan mahrum bırakın.
- Açık alan cihazını hazırlayın.
- Zemini 25 eşit ızgaraya bölmüş siyah kare bir kutu kullanın.
- Test odasını sessiz ve loş aydınlat.
- Testi yap.
- Her fareyi kutunun orta ızgarasına yerleştirin ve 5 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın.
- Yatay aktiviteyi (yeni bir ızgarada pençelerin dörtte üçü ile ızgara geçiş sayısı) ve dikey aktiviteyi (el sayacı kullanarak manuel gözlemle patilerin dörtte ikisi yerden kalkarak arka taraf sayısı) kaydedin.
- Merkezi ızgaralarda geçirilen zamanı ve bakım sıklığını kaydedin (ek davranışsal içgörüler için isteğe bağlı).
8. Zorunlu yüzme testi (FST)
NOT: FST için kullanılan her gruptan 2, 4 ve 8 haftalık fare partisini seçin. Sıçanları testten önce 24 saat boyunca oruç tutun ve tutarlı fizyolojik koşulları korumak için sudan mahrum bırakın.
- Test cihazını hazırlayın.
- Bir cam silindiri uygun miktarda suyla doldurun, böylece su seviyesi sıçanının ayaklarıyla tabana dokunarak kendini destekleyemeyeceği kadar yüksek olsun.
- Su sıcaklığını 25 ± 1 °C'ye ayarlayın.
- Testi yap.
- Her fareyi silindire yerleştirin ve 5 dakika yüzmesine izin verin.
- 5 dakika boyunca toplam hareketsizlik süresini kaydedin.
- 'Hareketsizlik'i pasif yüzmek (burnu suyun üzerinde tutmak için sadece minimal hareketler) ve 'aktivite'yi uzuv kürek çekmek veya duvar tırmalamak olarak tanımlayın.
- Sıçanlara sınav sonrası bakım yapın.
- 5 dakika sonra fareyi silindirden çıkarın, havluyla kurutun ve hipotermiyi önlemek için 30 dakika boyunca bir ısıtma lambasının (30 ± 2 °C) altına koyun (Şekil 5).
9. İstatistiksel analiz
- Verileri ortalama ± standart sapma (ortalama SD ±) olarak düzenleyin.
- SPSS sürüm 20.0 yazılımı kullanılarak verileri analiz edin.
- Parametrik testler yapmadan önce, verileri normallik (Shapiro-Wilk testi kullanarak) ve varyansların homojenliği (Levene testi kullanılarak) açısından test edin. Her grubun verileri normal bir dağılıma uygundur ve varyans homojenliğini sağlar.
- Gruplar arasındaki örnek ortalamaların karşılaştırılması için tek yönlü varyans analizi (tek yönlü ANOVA) kullanın; en az anlamlı fark (LSD) ve Student-Newman-Keuls (SNK) testleriyle birleştirin. Varyanslar eşit değilse Welch testini kullanın.
- İstitiksel anlamlılığı p < 0.05'e ayarlayın.