Yöntem makalesi

İnsan termi plasenta dokularından HLA-G+ ekstravillous trofoblastların fenotipleme ve fonksiyonel analiz için arındırılması

545 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

Bu makalede

Özet

Bu protokol, insan termi plasentalarının decidua bazalis ve koriyonik membranından primer HLA-G+ ekstravillous trofoblastlarının (EVT) arındırılması, karakterizasyonu ve kültürünü sağlar. Birincil EVT kültürleri 96 saat boyunca canlılık korur; bu da örnek eşleştirilmiş anne bağışıklık hücreleriyle birlikte kültür yapılmasına ve ardından etkileşimlerinin akış sitometrik ve moleküler analizine olanak tanır.

Özet

İnsan anne-fetal arayüzü, anne bağışıklık hücreleri ile fetal ekstravillöz trofoblastların (EVT) doğrudan hücresel temas halinde olduğu benzersiz bir immünolojik ortamı temsil eder; bu da bağışıklık toleransını oluşturmak ve sürdürmek için geçerlidir. EVT, anne bağışıklık yanıtlarını modüle etmede kritik roller oynayan HLA-G, PD-L1 ve PD-L2 gibi tolerojenik moleküllerin ekspresyonuyla karakterize edilen belirgin bir immünofenotip sergiler. Ayrıca, insan EVT'si HLA-C'yi ifade eder; bu durum annenin NK ve T hücreleri tarafından doğrudan tanınabilir ve aktivasyonlarını destekler. Önemli olarak, araştırma için kullanılan hayvan modellerinde HLA-C veya HLA-G ortologları bulunmamakta ve fare trofoblastlarında MHC ekspresyonu yoktur. Bu nedenle, plasenta dokularından insan EVT'sinin fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında incelemek, preeklampsi, erken doğum, fetal büyüme kısıtlaması ve plasenta akretası ile ilişkili gebelik sürdürme ve patofizyolojisinin altında yatan mekanizmaların aydınlanması için gereklidir. Bu protokol, sağlıklı dönem plasenta dokusundan, erken doğum ve preeklampsi sonrası birincil insan EVT'sinin izolasyonu ve karakterizasyonu için kapsamlı bir metodoloji sunmaktadır. Şunları içerir: (1) plasenta ve koryonik zar dokularının diseksiyonu; (2) enzimatik sindirim ve tek hücreli süspansiyonların hazırlanması; (3) FACS türüyle EVT arıtma; (4) Yüksek boyutlu akış sitometrisiyle fenotipik karakterizasyon; ve (5) kısa süreli in vitro kültür ve anne bağışıklık hücreleriyle 96 saate kadar ortak kültür. Vurgu, immünolojik fonksiyonel testler, protein ve gen ifade analizi gibi sonraki uygulamalar için uygun, son derece saf ve uygulanabilir EVT elde etmeye odaklanmaktadır. Bu protokolün uygulanması, EVT ve anne bağışıklık hücresi etkileşimlerini ve bunun hem sağlıklı hem de karmaşık gebeliklerdeki etkilerini anlamak için sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sağlar.

Giriş

İnsan plasentası, dört geniş trofoblast tipi kategorisi içerir: trofoblast kök hücreleri, sinsitiotrofoblastlar, villous sitotrofoblastlar ve ekstravillous trofoblastlar (EVT) ve her biri farklı işlevlere ve fenotipik özelliklere sahiptir. Bunlar arasında EVT, HLA-G, PD-L1, PD-L2 ve B7 ailesine ait maddeler gibi immünosupresif moleküllerin yüksek ekspresyonunu ve polimorfik HLA-C 1,2,3,4,5,6 gibi benzersiz immünolojik özellikler sergiler. EVT, anne desidual dokusuna, spiral arterlere ve miyometriuma derinlemesine indis eder ve onları anne bağışıklık hücreleriyle doğrudan temashalindedir. EVT, hamilelik sırasında bağışıklık toleransını korumak için kontrol edilmesi gereken ana T ve NK hücreleriyle etkileşimlerin önemli aracı olan polimorfik HLA-C'nin belirgin şekilde ifade edilmesi ile karakterize edilir. EVT ile ifade edilen tek klasik MHC molekülü olan HLA-C, anne hafıza T hücrelerine antijen sunumunu sağlar ve bağışıklıkkorumasını destekler 8. Ancak, birçok çalışma EVT'nin düzenleyici CD4 T hücrelerini ve CD8 T hücrelerinin tolerojenik durumlarını doğrudan artırarak kendilerini sitotoksisite ve bağışıklıkreddedilmesinden koruma sağladığını göstermiştir 9,10,11,12,13. Ayrıca, bazı çalışmalar preeklampsi, erken doğum veya düşük sonrası elde edilen plasentaların anne bağışıklık hücrelerinde ve EVT'sinde sağlıklı kontrol gruplarına kıyasla immünolojik değişikliklerbildirmiştir 14,15,16,17,18,19,20,21 . Bu immünolojik değişikliklerin altında birkaç olasılık olabilir; bunlar arasında i) önceden var olan anne T hücresi anormalliği; ii) EVT'nin bağışıklık baskısı fonksiyonlarının bozulması; veya iii) iki hücre tipi arasındaki etkileşimlerin bozulması. Temel mekanik faktörleri netleştirmek için, anne bağışıklık hücreleri ve EVT etkileşimlerinin değerlendirilmesini sağlayan ex vivo deneysel modelleme sistemleri gereklidir.

Burada sunulan yöntem ve yaklaşımlar, klasik trofoblast hatları, trofoblast kök hücre modelleri veya organoidler kullanan mevcut yöntemlere göre birçok avantaja sahiptir. En önemlisi, klasik trofoblast hücre hatları ve trofoblast kök hücre modelleri, birincil EVT'nin temel özelliklerini, MHC ekspresyonprofilleri 3,5,22,23 dahil olmak üzere, yeniden yansıtmaz. İkinci olarak, insan trofoblast kök hücresinin (hTSC) ve birkaç moleküler inhibitörü içeren organoid kültürlerinin karmaşık ortam gereksinimleri, bağışıklık hücresi fonksiyonlarını ve fenotipini doğrudan etkiler ve EVT ile bağışıklık hücre etkileşimlerinin yeterli değerlendirilmesiniengeller 22,24,25,26,27 . Son olarak, hTSC kültürlerinin farklılaşmadan sonra hücresel çeşitliliği ve plasenta organoid yapılarının içten dışa doğru yapısı, inn vivo önemi olmayan trofoblast tipleriyle bağışıklık etkileşimlerine izin verir ve çalışmaların netliğiniazaltır 22,27.

Burada, insan termi plasenta dokularından primer HLA-G+ EVT'nin saflaştırılması yöntemlerini açıklıyoruz; bu yöntem, bağışıklık hücresi popülasyonlarının varlığı veya yokluğunda 96 saate kadar kültür yapılmasını sağlıyor. Bu ortam, EVT ve bağışıklık hücresi fonksiyonlarını etkilerken yaşamlılıklarını koruyan moleküler inhibitörlerden yoksundur. Bu yaklaşım, sağlıklı ve karmaşık gebeliklerde EVT ve bağışıklık hücresi etkileşimlerinin doğrudan ex vivo çalışmaları için değerli bir platform sağlar. Anne-fetal bağışıklık toleransının temel itici güçlerinin keşfedilmesine katkıda bulunması ve plasenta iltihabı çözmek için terapötik hedeflerin belirlenmesi beklenmektedir.

Protokol

Cincinnati Çocuk Hastanesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu, biyoetik değerlendirmeler, kişisel bilgilerin ele alınması, bulaşıcı patojenler ve ABD yasalarına uygun olarak bilgilendirilmiş onay prosedürleri için gereklilikleri karşılayan bu araştırma protokolünü (Onay #2021-0336) onaylamıştır. Her laboratuvar, deneye başlamadan önce ulusal araştırma yönergelerine uygun onay almalıdır.

Bu protokol, öncekiprotokolümüzü 2,28 geliştirerek ikincil fonksiyonel test için 96 saate kadar kullanılabilirliği koruyan birincil HLA-G+ EVT'nin kültürüne odaklanmaktadır. HLA-G+ EVT benzeri hücre hattını belirlemek için Hamilton ve ark.2'ye ve eşleşen anne desidual lenfositleri içeren Ikumi ve ark.28'e bakabilirsiniz.

1. Laboratuvarı kur (0. gün).

NOT: Numuneleri işlemek için sınıf II biyogüvenlik (BSL2) kabini kullanın.

  1. 39 °C ve 37 °C sıcaklıklarda iki su banyosu kurun. 37 °C'de nemlendirilmiş birCO2 kuluçka makinesi kurun.
  2. 1x PBS, Yıkama Orta A, Yıkama Orta B, EVT kültür Aracı A, B ve C (Tablo 1 ve Tablo 2) hazırlayın.
  3. 15 mL 10 mg/mL DNaz I çözeltisi (Tablo 1) ve 500 mL %0,25 Tripsin/EDTA su banyosunda 37 °C'de çözebilirsiniz.
  4. BSL2 dolabına sıvı atık toplamak için biyosidal/virüsidal çözelti (örneğin, %10 çamaşır suyu açıcı) dolu bir kap yerleştirin. BSL2 dolabında katı atık için biyolojik tehlike torbası olan bir atık konteyneri kurun.
  5. BSL2 kabininde emici pedler, steril diseksiyon aletleri (kavisli uçlu cımbız ve 6 1/2" makas), steril metal filtreler, tüp rafları ve steril 50 mL konik tüpler hazırlayın.
  6. Diseksiyon sırasında plasenta doku parçalarının toplanması için üç adet 50 mL konik tüp (ikiri 1x PBS ve biri Wash Medium A ile Wash Medium A) hazırlanın.

2. Örnek toplama (0. gün)

NOT: Gebeliğin 24 ila 42. haftaları arasında sezaryen ile alınan membranlı insan plasentaları kullanın. Vajinal yoluyla yapılan plasenta daha az EVT verebilir.

  1. Plasentayı hemen bir BSL2 dolabında, ideal olarak doğumdan 1-2 saat içinde işlemeye başlayın; böylece canlı hücrelerin verimini en üst düzeye çıkarın. Plasentayı her zaman oda sıcaklığında tutun.
  2. Plasentayı inceleyin ve gerekirse büyüklüğünü, ağırlığını ve kaba morfolojik görünümünü kaydedin.

3. Doku diseksiyonu (0. gün)

  1. Zar diseksiyon
    1. Plasentayı fetal tarafa doğru yukarıya doğru yerleştirin (kordon yerleştirme kısmı görünür). Amnionu, yani fetal tarafa en yakın membran tabakası, yan zardan göbek kordonunun yerleşme yerine manuel olarak soyarak çıkarır; Amniyonu kesip at.
    2. Koriyodecidual membranı, plasentanın tabanından yukarıya doğru başlayarak 2 inçlik şeritlere kesin, zar şeridi plasentaya bağlı bırakın.
    3. Koriodesidual membran şeridini, desidual tarafı yukarı bakan iki parmağın üzerine yerleştirin ve steril kavisli uçlu forsepsle anakart decidua parietalis'i koryondan nazikçe kazıyın.
      NOT: Verimli çalışın ve koryonik zarın kurumasına izin vermeyin.
    4. Koryonik zarı 20 mL Wash Medium A ile 50 mL konik bir tüpe halinde toplayın.
    5. 50 mL konik tüpte decidual lenfosit izolasyonu için decidua parietalis toplayın ve 20 mL PBS ile birlikte Ikumi ve ark. tarafından tanımlanan protokolü takipedin.
    6. Koryonik zarı 50 mL'lik tüpte makasla kesin, <2 mm2 küçük parçalara dönüşsün.
      NOT: Kesimden sonra yerleşmiş zarın toplam miktarı ideal olarak 30 mL'dir.
    7. Wash Medium A'yı atın ve üst yüzey şeffaf olana kadar PBS ile birkaç kez yıkayın.
  2. Plasenta diseksiyon
    1. Plasentayı anne tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve kan pıhtılarını çıkarın. Plasenta bazal plaka parçalarını (uzunluk 2 cm, genişlik 2 cm, derinlik 0,5 cm) steril makasla kesin, nekrotik, kalsifik veya iskemik kısımlardan kaçının.
    2. Decidua basalis parçasını, villuslara (fetal tarafa) yukarıya bakan parmaklara yerleştirin. Villileri makasla dikkatlice decidua bazalis'ten çıkararak 2-3 mm membran elde edin ve decidua bazalis'te sadece ince bir villus tabakası kalsın.
    3. 20 mL PBS ile 50 mL konik tüpe içine decidua bazalis dokusu toplayın. Decidua basalis'i küçük <2 mm2 parçalarına dönüşene kadar doğrayın.
      NOT: Kesildikten sonra yerleşmiş dokunun toplam miktarı ideal olarak 15 mL'dir.
    4. PBS'yi atın ve desidual bazalis'i birkaç kez PBS ile yıkayın, ta ki süpernatan görünür kansız berrak hale gelene kadar.
    5. 15 mL doku süspansiyonunu iki 50 mL konik tüplere (her tüpte 7,5 mL) bölünür.
      NOT: Decidua basalis'ten lenfosit izolasyonu protokolü bu protokolden farklıdır. Hamilton ve ark.2'de sağlanan protokole bakınız.

4. Doku sindirimi (0. gün)

  1. Bölüm 3'te koryonik membran ve decidua bazalis'in son yıkamasından sonra, tüm tüpleri 1x PBS ile doldurun, 200 × g'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı dökün.
  2. Doku Sindirimi Enzim Kokteylini Hazırlayın (Tablo 1). 300 mL'lik bir cam şişeye 150 mL sıcak Doku Sindirim Enzim Kokteyli ekleyin, ardından şişeye 30 mL koriyonik zar ekleyin.
  3. İki cam 300 mL şişeye 20 mL sıcak DMEM/F20 ve 80 mL sıcak Doku Sindirim Enzim Kokteyli ekleyin, ardından her şişeye 7,5 mL decidua bazalis ekleyin.
  4. Şişeyi 39 °C su banyosunda koriyonik membranla, 37 °C su banyosunda decidua bazalis ile iki şişe ise kuluçka yapın. 15 dakikalık kuluçka sırasında tüm şiberonları her 3-4 dakikada bir (ilk sindirimde) sallayın.
  5. Sindirimden sonra, sindirilen dokuyu metal elekler (ağ boyutu 40) üzerinden filtreleyin. Jelatinimsi maddeyi çözmek ve durulamak için mendillere Wash Medium B ekleyin.
  6. Hücre süspansiyonlarını, 100 μm filtre üzerinden doku tipi ve sindirim numarasıyla etiketlenmiş 50 mL'lik tüplere filtreleyin.
  7. İkinci sindirime devam edin; sindirilmemiş dokuyu 300 mL orta ölçülü şişelere geri aktarın, 4.2. adımda tarif edildiği gibi Doku Sindirim Enzim Kokteyli ekleyin ve 4.2-4.6. adımları tekrarlayın.
    NOT: Tüm decidua bazalis dokuları bir 300 mL'lik şişeye aktarılır. İlk sindirimden ve ikinci sindirimden sonra elde edilen hücreleri ayrı tutun.
  8. Hücre süspansiyonunu 650 × g ile 8 dakika boyunca döndürün ve üst süspansiyonu atın.
  9. Aynı doku tipi ve sindirim sayısına ait pelletleri (ama ilk sindirim ve ikinci sindirimi ayrı tutun) tek bir tüpte birleştirin. 25 mL'ye kadar Wash Medium B ile doldurun.

5. Ficoll yoğunluk gradyanı (0. gün)

  1. Doku tipi ve sindirim numarasıyla etiketlenmiş dört adet 50 mL'lik konik tüp hazırlayın. Tüplere 12 mL Ficoll dök.
  2. Hücre süspansiyonlarını dikkatlice Ficoll'a yükleyin. Tüpleri 800 × g sıcaklıkta, 20 dakika boyunca (oda sıcaklığında) frensiz santrifüjleyin.
  3. Ficoll-ortam arayüzündeki hücre tabakasını dikkatlice doku tipi ve sindirim numarasıyla etiketlenmiş temiz 50 mL konik tüplere aktarın.
    NOT: Katmanı dikkatlice toplayın, arayüzü bozmadan steril bir transfer pipeti kullanın.
  4. Tüpleri Wash Medium B ile doldurun ve 650 × g'de 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
  5. Üst bileşeni atın ve hücre pelletlerini kalan ortamla (yaklaşık 0,5 mL) yeniden askıya alın. Gerekirse, hücre askısının yaklaşık %10'unu fenotipleme için ayrı tutun ve hücre sıralaması için %90 kullanın. Hücre sayısını ve yaşamlılığı belirlemek için hücreleri sayın.

6. EVT'nin Sıralaması (0. gün)

  1. Yeniden askıya alınmış hücre pelletlerini, doku tipi ve sindirim numarasıyla etiketlenmiş steril FACS tüplerine yerleştirin. Anti-CD45-BV785 (1:100), anti-HLA-G-APC (1:125) ve anti-EGFR1-BV711(1:160) ekleyin (Tablo 3). Tüpleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
  2. 1 ml Wash Medium B ekleyin ve 650 × g ile 8 dakika boyunca santrifüjleyin.
  3. Süpernatantı atın ve hücre pelletlerini Wash Medium B ile yeniden süspansiyona yerleştirin; böylece yaklaşık 1 × 10adet 6 hücre / mL hücre süspansiyonu elde edilir.
  4. Hücreler, hücre sıralamasından hemen önce 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin ve CD45-HLA-G+EGFR+ EVT'yi, Şekil 1A'da açıklanan kapı stratejisine göre 1 mL EVT Kültür Ortamı A içeren tüplere ayırın.
    NOT: En uygun trofoblast kullanılabilirliği için, 100 μm nozul ile birlikte jet-in-air hücre ayırıcı (örneğin, Bigfoot veya MoFlo) kullanılmalıdır. Akışkanlık bazlı sortlayıcılar (örneğin DB S6 veya Sony Nano) trofoblast canlılığını azaltabilirken, manyetik hücre ayırma stratejileri (örneğin Easysep veya MACS) canlılığı koruyabilir ancak düşük saflığa sahip olabilir ve bu da kültürlerde stomal hücre aşırı büyümesine yol açar.
  5. FACS tüplerini sıralanmış hücrelerle santrifüjlen, süpernatantı atacak ve hücre pelletlerini EVT Kültür Medium B ile yeniden süspansiyona alın.
    NOT: Hücreleri ayırırken kültür plakalarını hazırlamak için sonraki bölüme geçin.

7. İkincil test için birincil HLA-G+ EVT kültürü (0 - 1. günler)

  1. Düz tabanlı 96 delikli hücre kültür plakalarının kuyularını oda sıcaklığında 50 μL 20 μg/mL fibronektin (Tablo 2) ile kaplayın (Tablo 2).
  2. Fibronektini çıkarın ve hücre süspansiyonunu EVT Kültür Medium B ile kuyulara ekleyin. 0.5 × 105 bazalis EVT hücresi/200 μL orta/iyi ve 1.0 ×10 adet 5 koryonik EVT hücresi/200 μL orta/iyi olmasını hedefleyin. Hücre kültür plakalarını nemlendirilmiş CO2 kuluçkada 37 °C'de (0. gün kuluçka) 12-18 saat boyunca kuluçka yapın.
  3. 1. günde, B ortamını çıkarın, hücreleri 1x PBS ile nazikçe yıkayın ve daha fazla (ko)kültür için T hücreleri olan veya olmayan EVT Kültür Medium C ekleyin (bkz. bölüm 8).

8. Birincil HLA-G+ EVT'nin aktive T hücreleriyle birlikte kültürlenmesi (0 - 4. günler)

  1. 3. taraf donörden CD8+T hücrelerinin uyarılması (0-1. günler)
    1. HLA-G+ EVT (0. gün) ayırma sırasında, örneğin eşleştirilmiş anne kanından veya akraba olmayan kan bağışçılarından periferik kan bağışıklık hücresi popülasyonları, referanslı insan CD8+ T Hücre zenginleştirme Kokteyli (bkz. Materyaller Tablosu) kullanılarak izole edilir, ardından Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjasyonu veya FACS çeşidi yapılır.
    2. T veya NK hücrelerini, istenildiği gibi Lenfosit Hücre Kültür Ortamında anti CD3/28 boncukları veya sitokinlerle (örneğin, IL2, IL15, IL12 veya IL18) önceden uyarın.
  2. Aktive T hücreleriyle birlikte kültür EVT (1-4. günler)
    1. Lenfosit sayısını sayın ve 0.5 × 106 / mL konsantrasyonda Lenfosit Hücre Kültür Ortamı ile hücre süspansiyonları yapın. Birincil EVT kuyularına 1×10-5 lenfosit ekleyin (EVT Kültür Ortamı C hacmi: Lenfosit Hücre Kültür Ortamı = 1:1). Plakaları nemlendirilmiş birCO2 kuluçka makinesinde, 37 °C'de 24-72 saat kuluçka yapın.
    2. Akış sitometrisi analizi için lenfositleri toplamak ve sitokin analizi için süpernatantları toplamak.
    3. EVT'yi tripsinizasyon kullanarak hasat edin ve 4. gün akış sitometrisi analizi için EVT'yi FACS tüplerine toplayın (bkz. bölüm 9).

9. Birincil HLA-G+ EVT'nin fenotiplenmesi

NOT: Akış sitometrik boyama işlemlerine hemen başlayın ve EVT ile gerekli tüm çözeltileri her zaman oda sıcaklığında tutun.

  1. FACS tüplerini birincil EVT ile 650 × g ile 7 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın.
  2. Kaspaz 3/7 boyama çözeltisini (Tablo 3) hücre peletlerine ekleyin ve nazikçe karıştırın.
  3. Hücreleri antikorlarla boyandırın (Tablo 3), nazikçe karıştırın ve ek 20 dakika (toplam 30 dakikalık kuluçka) kuluçka yapın.
  4. 1 mL EVT Kültür Ortamı C ekleyin, tüpleri 650 × g'de 7 dakika boyunca santrifüj edin ve üst maddeyi atın.
  5. Hücre pelletini 0,4 mL hücre EVT Kültür Ortamı C ile yeniden süzülün. 7-AAD boyama çözeltisi (5 μL/hücre süspansiyonu) tüplere ekleyin ve hemen akış sitometresinde analiz edin.

Sonuçlar

Beklenen hücre verimleri

15 mL decidua bazalis'ten beklenen HLA-G+ EVT, ilk sindirimden 106 hücre × 0,1-0,3 hücre ve ikinci sindirimden 0,1-0,6 × 106 hücre (toplamda 0,2-0,8 × 106 hücre) verir. 30 mL korionik zardan beklenen HLA-G+ EVT verimleri ilk sindirimden 106 hücre × 0,4-1,0 ve ikinci sindirimden 0,4-1,5 × 106 hücre (toplamda 0,8-2,5 × 106 hücre) olarak belirlenir. İzolatlarda kaspaz 3/7-7-AAD- canlı EVT oranının %90-95 olması beklenmektedir.

Birincil HLA-G+ EVT kültürü

Soy belirteçleri (HLA-G, HLA-C, EGFR) ve hücre ölüm belirteçlerinin akış sitometrisi analizi, bu protokolün 4. güne kadar (sıralanmış EVT kaplamasından 96 saat sonra) kadar geçerli birincil EVT kültürü sağladığını göstermiştir (Şekil 1B-D). Birincil koriyonik ve d.basalis HLA-G+ EVT'nin temsil ışık mikroskopisi görüntüleri, 24, 48 ve 72 saat kültür sonrası gösterilmiştir (Şekil 2A-F).

Primer HLA-G+ EVT'nin T hücreleriyle birlikte kültürlenmesi

Bu protokol, plasentadan izole edildikten sonra primer EVT'nin 96 saat uygulanabilirliğini artırdı; bu, öncekiraporumuz 1,2,10'a kıyasla bir iyileşme oldu. Bu nedenle, önceden uyarılmış lenfositlerle birlikte kültür sonrası EVT yanıtlarının analizini mümkün kılar; bu da anne-fetal arayüzdeki akut iltihabı taklit eder. EVT, hücredışı akış sitometrisi boyama ile belirlenen PD-L1, PD-L2, PVR (CD155 olarak da bilinir), B7H3 ve HLA-E gibi polimorfik HLA-C ile birlikte immüniterif ko-inhibitör molekülleri ifade eder (Şekil 3A,B). EVT, protokol bölümü 8'e göre (Şekil 4A,B) protokol bölümüne göre, aktif lenfositlerle 72 saat boyunca birlikte kültürlendiğinde PVR ve B7H3 ekspresyonunu artırmadı. Ayrıca, 7AAD ve kaspaz 3/7 boyama ile gösterildiği gibi EVT ölümünde artış gözlemlenmedi (Şekil 4C,D).

Şekil 1
Şekil 1. EVT hücre sıralaması için kapı stratejisi ve düzenlenmiş EVT kültürlendikten sonra akış sitometrisi grafikleri. (A) Decidua bazalis EVT ve korionik EVT'nin ayırılması için temsil edilen kapı stratejisi. R1, İleri-Yan Dağılma grafikindeki canlı hücre kapısıdır. R2, CD45+ lökositlerin dışlanması için kullanılan kapıdır. R3, HLA-G+EGFR+EVT kapısıdır. R4, 7-AAD-kaspaz3/7- canlı EVT'dir. R4 kapısı sıralama için mutlaka gerekli olmasa da, burada birincil EVT'nin uygulanabilirliğini göstermek için gösterilmiştir. (B) 96 saat in vitro kültür sonrasında sıralanmış HLA-G+EGFR+EVT'nin temsil akış sitometrisi grafikleri. (C,D) Kaspazın sıklıkları 3/7- 7-AAD- çevrim sırasında (0. gün) ve kültürün 96 saatinde (4. gün) canlı EVT. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2. In vitro kültür sırasında EVT'nin morfolojisi. (A) 24 saat, (B) 48 saat ve (C) 72 saat kültür ve decidua bazalis EVT'nin (D) 24 saat, (E) 48 saat ve (F) 72 saat kültür sonrası koryonik EVT'nin temsil ışık mikroskopisi görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3. Primer EVT'nin immünolojik fenotipleri. (A) Birincil EVT'de HLA'ların ve ko-inhibitör moleküllerin temsil akış grafikleri, hücre dışı akış sitometri boyama ile belirlenmiş (0. gün). (B) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, 0. günde IgG kontrolünün ham MFI'sini ve her işaretçiyi d. basalis EVT (mavi) ve koryonik EVT (yeşil) ile tam boyayı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4. Aktif lenfositli veya aktif lenfositsiz primer EVT'nin immünolojik fenotipleri (4. gün). (A) 72-saat kültüründen sonra (4. gün) aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan EVT'nin temsil akış grafikleri. (B) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan EVT'nin MFI'sini gösterir. Mavi grafikler decidua basalis EVT'yi, yeşil grafikler ise korionik EVT'yi temsil eder. (C) 4. günde aktif üçüncü taraf lenfositlerle veya olmadan kaspaz 3/7-7-AAD- canlı EVT için temsil akış sitometri grafikleri. (D) Eşleştirilmiş çizgi grafikleri, üçüncü taraf lenfositlerin aktif olup olmadığı kaspazlar 3/7-7-AAD- canlı EVT frekanslarını gösterir. Mavi grafikler decidua basalis EVT'yi, yeşil grafikler ise korionik EVT'yi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Doku diseksiyonu ve sindirim için önemli reaktiflerdir. Ayrıcabkz. 1,2,24. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2. EVT kültürü için anahtar reaktifler ve T hücreleriyle birlikte kültür yapılır. Ayrıcabkz. 1,2,24. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3. Sıralama ve akış sitometrisi analizi için anahtar antikorlar ve reaktifler. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokoldeki kritik adımlar

Uygulanabilir EVT elde etmek için, doğumdan hemen sonra plasentadan hücre izolasyonuna başlamak ve izolasyondan ayırmaya kadar tüm işlemlerin oda sıcaklığında yapılması çok önemlidir. EVT'ler lenfositlere göre daha büyük ve daha yapışkan olduğundan, tıkanmayı önlemek için sıralamada aşağıdaki önlemler alınmalıdır: i) hücre süspansiyonunu ayırmadan önce 40 μm hücre süzgecinden geçirmek, ii) hücre süspansiyonu için DNaz içeren bir ortam kullanmak, iii) hücre süspansiyonlarını aşırı yoğunlaştırmaktan kaçınmak (ideal olarak ~1 × 10⁶ hücre/mL) ve iv) en az 100 μm nozul boyutu kullanmak. Jet-in-Air ayırıcı (örneğin, Bigfoot, MoFlo), fluidik tabanlı hücre ayırıcılarına (örneğin, BD ayırıcıları, Sony Nano) kıyasla daha yüksek uygulanabilir bir EVT verimi sağlar.

Yöntemin değişiklikleri ve sorun gidermesi

Decidua basalis EVT'nin ilk sindiriminden sonra aşırı veya az sindirilmiş

Decidua bazalis dokusunun sindirim etkinliği plasentalar arasında değişiklik gösterir. Aşırı sindirilmiş dokular, metal elekten geçmesi zor olan büyük, yapışkan agregalar oluşturur. Genellikle, 10-30 mL Yıkama Ortamı B eklemek, filtreleme sırasında bu agregaların dağılmasına yardımcı olur. Eğer bu sorunu çözmezse, 1-2 ml DNazı doğrudan dokulara ekleyin. İlk sindirim aşırı sindirimle sonuçlanırsa, ikinci sindirimde Doku Sindirim Enzim Kokteyli konsantrasyonunu %80'den %70'e düşürün. İlk sindirimin süzülmesinden sonra, kalan doku hacmi yaklaşık yarıdan daha az indirgenmelidir. Kalan doku hacmi değişmezse, ikinci sindirim için Doku Sindirim Enzim Kokteyli konsantrasyonunu %80'den %90-100'e çıkarın. Koryonik zar dokuları, plasentalar arasında tutarlı şekilde sindirilir. Bu nedenle, Doku Sindirimi Enzimi kokteylinin konsantrasyonunu ayarlamak genellikle gereksizdir.

Yukarıda protokolde tanımlananlardan daha büyük doku hacimlerinin sindirimi için

30 mL'den fazla koriyonik zar veya 15 mL'den fazla decidua bazalis dokusunun sindirimi için, Tissue Digestion Enzim Kokteyli içeren ek şişeler kullanın. Tek bir şişede doku hacmini artırmak genellikle sindirim eksikliğine yol açar.

Yöntemin sınırlamaları

Vajinal yoluyla yapılan plasentalardan daha düşük EVT verimleri beklenmektedir. EVT, sıralamadan önce veya sonra kriyokonserve yapılamaz, çünkü donma-erime stresine hassastır ve bu da onların canlılığını ve işlevini önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, bu protokol herhangi bir durak noktası içermez.

Yöntemin mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında önemi

Daha önce, Term plasentalardan HLA-G+ EVT benzeri hücre hatlarının oluşturulması için doku kültürü Medium B ve kollajen kaplamalı plakalar kullanılarak protokolü rapor etmiştik. Ancak, ortamdaki birkaç inhibitör ve kolajen ko-kültür sistemindeki T hücresi fonksiyonunu etkileyebilir2. Önceki raporlarda Doku Kültürü Ortamı B kullanılmamış, T hücrelerinin birlikte kültürde değerlendirilmesine izin veriyordu, ancak hücredeğişkenliği 1,10 nedeniyle EVT değerlendirilmedi. Mevcut protokolün avantajı, kültür ortamının etkisini en aza indirirken uygulanabilir birincil EVT kültürünü mümkün kılmasıdır. Bu protokol, EVT'nin immünolojik fonksiyonunu ve çevredeki bağışıklık hücrelerine yanıt olarak fonksiyonel değişikliklerini incelemek için deneysel bir platform sağlar - bu alan henüz yeterince araştırılmamıştır.

Açıklamalar

Bu çalışmayla ilgili bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi Romatoloji Bölümü'ndeki Sherry Thornton ve Araştırma Akış Sitometrisi Merkezi'ne akış sitometrisi ve hücre ayırma konusundaki tüm yardımları için teşekkür etmek isteriz; Katılımcı hastanelerin tüm hemşireleri ve hekimleri, plasenta materyalleri toplama çabaları için; Tüm Tilburgs laboratuvar üyeleri ve CCHMC immünoloji öğretim üyeleri, faydalı tartışmaları için; Bu çalışma, NIH R01HD116852 (T.T.) tarafından desteklendi; Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı (T.T.); Burroughs Wellcome Fonu Yeni Nesil Gebelik Ödülü #NGP10115 (T.T.); ve March of Dimes Ohio işbirliği hibesi (T.T.). S.T., JSPS KAKENHI Hibe Numaraları 22KK0287 ve 25K12697 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Santrifüj tüpleriThermo Fisher14-955-238
-20 °C dondurucuherhangi bir tedarikçi
37 °C 5% CO2 İnkübasyonuherhangi bir tedarikçi
4 °C buzdolabıherhangi bir tedarikçi
50 mL Konik Santrifüj tüpleriThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MerkaptoetanolGibco21985-023
6 ½” makasherhangi bir tedarikçi
7-AAD Canlılık Boyama SolüsyonuBiolegend420403
-80 °C dondurucuherhangi bir tedarikçi
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, fare, IgG1 k İzotip KontrolüBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ İzotip KontrolüBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Hücre AnalizörüBD Biosciences
Bigfoot Spectral Hücre AyırıcıThermo Fisher
Boğa Serum Albumini (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biyogüvenlik kabiniherhangi bir tedarikçi
BV605 Fare IgG1, κ İzotip KontrolüBD Biosciences562652
BV750 Fare IgG1, κ izotip KontrolüBiolegend400105
BV785 Fare IgG1, κ İzotip KontrolüBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Hücre ayrıştırma elekMillipore Sigma CD1-1KT (örgü boyutu 60)
Hücre süzgeçleri 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent kaspaz-3/7 Yeşil Algılama ReaktifiinvitrogenC10423
Santrifüjherhangi bir tedarikçi
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Eğri uçlu penseherhangi bir tedarikçi
Dimetil Sülfoksit (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads İnsan T-Aktivatör CD3/CD28 T Hücre Genişlemesi ve Aktivasyonu içinThermo Fisher Scientific11131D
EGF, İnsan, Rekombinant, Hayvan İçeriği YokPeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA yazılımıBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo YazılımıFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
İnsan AB serumuCorning35060CI
İnsan koryonik gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
İnsan fibronektin (1mg/mL)Corning354008
İnsan rekombinant IL-2PeproTech200-02
Insülin-Transferrin-Selenyum, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Askorbik AsitSigma-AldrichA0278
mıknatıslı ayırıcıpromegaZ5342
Yeni Doğan Dana Serumu (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 fare, IgG1 k, İzotip KontrolüBiolegend400126
PE/Dazzle594 Fare IgG1, κ İzotip KontrolüBiolegend400176
Penisilin ve StreptomisinGibco15140-122
Fosfat Tamponlu Salin 10X ÇözeltisiThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Araştırma sınıfı FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep İnsan CD8+ T Hücresi Zenginleştirme KokteyliStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Salınımlı su banyosu 37 °Cherhangi bir tedarikçi
Tryple Express 1x Fenol KırmızısızThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X

Kaynaklar

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HLA G EkspresyonuPlasental DokuMaternal Fetal Aray zmm n ToleransAk SitometrisiFACS S ralamaFenotipik Karakterizasyonmm n H cre Etkile imiEnzimatik Sindirim

İlgili makaleler