Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aynı Özofagus Kanseri Hastasından Tümör Organoidlerinin, Karsinomla İlgili Fibroblastların ve Karşıt Fibroblastların Oluşturulması

532 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, özofageal skuamoz hücreli karsinomlu (ESCC) hastadan kanser organoidlerini, karsinomla ilişkili fibroblastları (CAF'ler) ve tümör ilişkisiz fibroblastları (CF) aynı anda izole etme yöntemini tanımlar. Bu hasta eşleştirilmiş materyallerin kullanımı, hastalar arası değişkenlikten kaynaklanan sorunları önleyebilir ve ESCC araştırmaları için uygun bir deneysel platform sağlayabilir.

Özet

Özofagus skuamöz hücreli karsinomda (ESCC), tedavi direncinin kazanımı ve tümör neksesi büyük klinik zorluklar olarak kalır. Karsinomla ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), tümör mikroçevresinin temel bileşenleri olarak, ESCC ilerlemesini ve terapötik yanıtı etkilediği bilinmektedir. Ancak, CAF'lerin tümör mövündeki rolünün birçok yönü, muhtemelen ESCC hastalarındaki hastalar arası değişkenlikten kaynaklandığı bilinmemektedir. Araştırma için mevcut olan çeşitli insan ESCC hücre hatlarının, insan karsinomunun doğasını kısmen taklit ettiği düşünülmektedir. Ayrıca yıllarca ve on yıllarca Petri kabında in vitro çoğaltılır ve bu da kültür koşullarına uyum sağlar. Ayrıca, insan ESCC hücre hatları, orijinal hastalar arasında farklı genetik ve epigenetik değişiklikler barındırır ve bu da hastalar arası değişkenliğe yol açar. Buna rağmen, hasta uyumsuz CAF'larla yapılan denemeler için önceki çoğu çalışmada uzun vadeli kültürlenmiş kanser hücre hatları kullanılmıştır. Her kanser hücre hattı içinde ve kanser hücreleri ile CAF'lar arasındaki hastalar arası değişkenlik, sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini azaltabilir. Hastalararası değişkenliği ortadan kaldırmak için, aynı hastadan üç farklı hücre tipi izole edildi: cerrahi olarak disseksiye edilen bir ESCC bölgesinden kanser organoidleri ve CAF'lar, ve bitişik tümör olmayan bölgeden olan karşıt fibroblastlar (CF) hasta spesifik CAF'lar için hasta spesifik kontroller olarak kullanıldı. Kanser organoidlerinin, CAF'lerin ve CF'lerin eşzamanlı izolasyonunu sağlayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Kanser organoidleri üç boyutlu koşullarda iyi büyümüştür. CAF ve CF'ler, fibroblast belirteçlerinden biri olan vimentin için pozitif boyanmış, bu da bu hücrelerin fibroblastik soylarda zenginleşmesini desteklemiştir. Tarif edilen protokol, ESCC organoidlerini ve hasta uyumlu fibroblastları belirlememizi sağlar; bu da tümör-stromal etkileşimleri incelemede hastalar arası değişkenliği hariç tutan değerli bir deneysel platform sağlar.

Giriş

Yemek borusu kanseri, dünya genelinde yüksek insidans ve ölüm oranlarıylailişkilidir 1. Genel olarak iki ana histolojik alt tipe ayrılır: özofagus skuamöz hücreli karsinom (ESCC) ve özofagus adenokarsinom (EAC)2. ESCC, EAC'den daha yaygındır; özellikle Doğu Asya ve Afrika 3'te daha yüksek bir sıklık görülür. ESCC için tedavi stratejileri nispeten iyikurulmuştur 4,5. Mukoza tabakasında sınırlı erken evre lezyonlar için, endoskopik rezeksiyon iyileştirici ve minimal invaziv bir seçenek olarak önerilir. Yerel olarak ilerlemiş ancak rezek edilebilir hastalığı olan hastalarda, neoadjuvan kemoradyoterapi ve özofagektomi kombinasyonu klinik etkinliği göstermiştir. Rezeksiyon yapılamayan veya metastatik vakalarda sistemik kemoterapi tedavinin temel dayanağı olarak kalır. Buna rağmen, terapötik direnç ve hastalık tekrarı büyük klinik zorluklar teşkil etmeye devam etmektedir.

Tümörler sadece kanser hücrelerinden değil, aynı zamanda çeşitli stromal hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir tümör mikro ortamından da oluşur. Bunlar arasında, tümör mikroçevresinin ana hücresel bileşenleri olan karsinomla ilişkili fibroblastlar (CAF'ler) tümör ilerlemesi ve terapötik yanıt vermede kritik rolleroynadığı gösterilmiştir 6,7,8,9. ESCC'de, CAF'lerin tümör malignitesi ve tedavi direncindeki rolü, giderek daha fazlabildirilmiştir 10,11,12. Ancak, ESCC malignitesinin altında yatan CAF'ların kesin moleküler mekanizmaları büyük ölçüde belirsizdir.

Önceki çoğu çalışmada, CAF'lerin kanser hücreleri üzerindeki etkileri, Petri kaplarında yıllar, hatta on yıllar boyunca çoğaltılan çeşitli ESCC hücre hatları kullanılarak değerlendirildi. Bu tür hücre hatları kültür koşullarına uyum sağlar ve orijinal tümörlere çok az benzemez13. Ayrıca, ESCC hücre hatları farklı hastalardan türetilir ve ilgili ESCC hücrelerinde açıkça görülen çeşitli genetik ve epigenetik değişiklikler içerir; bu değişiklikler hastalar arası değişkenlik olarak hizmet verir. Bir kanser hücre hattından alınan deneysel sonuçlar genellikle başka bir kanser hücre hattındakilerle tutarsız olabilir. Bu nedenle, farklı ESCC hücre hatları ve hasta uyumsuz CAF'ler kullanılarak yapılan deneyler, bu hücrelerin etkileşimlerini tekrarlanabilir ve güvenilir şekilde hassas şekilde ele almakta zorluk yaratabilir.

Bu sınırlamaları gidermek için, aynı ESCC cerrahi örneğinden hasta uyumlu tümör organoidlerini, CAF'ları ve tümör dışı karşılık fibroblastlarını (CF) aynı anda izole eden bir protokol geliştirilmiştir. Hasta kaynaklı organoidler genellikle birincil tümörlerin temel mimari ve fenotipik özelliklerini tekrarlarken moleküler heterojenliği korur. Yerleşik organoidler, üç boyutlu (3D) kültür koşullarında küreler oluşturmuş ve stabil çoğalma kapasitesi sergilemiştir. Hem CAF hem de CF'lerin, fibroblast belirteji olan vimentin için pozitif fibroblastik hücre popülasyonları için zenginleştirildiği doğrulandı.

Bu protokol, doku işleme, enzimatik ayrışma, organoid tohumlama, CAF/CF izolasyonu, geçiş ve kriyokonserasyon için ayrıntılı ve tekrarlanabilir adımlar sağlar. Araştırmacıların uygulamadan önce uygulanabilirliği değerlendirmesine yardımcı olmak için pratik bilgiler dahil edilmiştir: organoidler genellikle 3–5 gün içinde oluşur, 7–10 gün içinde geçiş hazırlığına ulaşır ve ondan fazla süreyle istikrarlı şekilde genişletilebilir. CAF ve CF'ler en az sekiz nesil boyunca geçiş yapılabilir. Organoidler ve fibroblastlar yaklaşık 20 gün içinde kriyokonserve edilebilir. Organoidler için kuruluş başarı oranları yaklaşık %70, CAF ve CF'ler için ise %80'e ulaşmaktadır. Ayrıca, CAF veya CF ile koşullandırılmış ortam kullanılarak doğrulanmış bir koşullu ortam testi dahil edilmiştir; bu da stromal hücrelerin tümör organoid davranışı üzerindeki parakrin etkilerini değerlendirmek için sağlam bir yaklaşım sunar. Topluca, bu eşleşen tümör organoid–stromal platform, ESCC tümör–stromal etkileşimlerini araştırmak ve hassas tedavi stratejilerinin geliştirilmesini desteklemek için deneysel olarak erişilebilir ve biyolojik olarak ilgili bir model sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan dokusuyla ilgili tüm işlemler, uygun kurumsal biyogüvenlik onayları altında ve sertifikalı biyolojik güvenlik kabinesinde yapılmalıdır. Hasta yazılı bilgilendirilmiş onay verdi ve proje Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı. Protokol 2'den 6'ya kadar olan prosedürün genel bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir. ESCC organoid ortamındaki (Eso_v1) her bileşenin bileşimi ve konsantrasyonları, Kijima ve ark.14 ve diğerçalışmalar 15,16,17 temelinde yalnızca küçük değişikliklerle belirlenmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Reaktifler ve doku hazırlığı

  1. Reaktifler ve ekipmanlar hazırlayın.
    1. İşleme başlamadan önce makas, forseps ve pipetler dahil tüm aletleri sterilize edin.
    2. 15 mL'lik bir tüpte 10 mL fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) hazırlayın.
    3. Düşük yapışkanlı 15 mL tüpler hazırlayın ve örnek kökenine göre etiketleyin (örneğin, Tümör Yıkama Tüpü (A), Tümör Sindirim Tüpü (B), Tümör Olmayan Yıkama Tüpü (C), Tümör Olmayan Sindirim Tüpü (D)).
    4. İşlem sırasında hücre yapışmasını azaltmak için fetal sığır serumunu (FBS) 2–3 kez aspire edip dağıtarak pipetleri kaplamak.
      NOT: FBS kaplama, mekanik ayrışma sırasında doku parçalarının plastik yüzeylere yapışmasını engeller.
  2. Enzim çözeltileri hazırlayın
    1. Tümör sindirimi için Enzim Çözeltisi I'i , 2,7 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) %10 FBS ve 1x penisilin–streptomisin (PS) (bundan sonra DMEM/%10 FBS), 0,3 mL 10 mg/mL kollagenaz, 0,15 mL 10000 PU/mL dispaz ve 0,03 mL 2,5 μg/mL Amfoterisin B. 37 °C'ye kadar ısınarak karıştırın.
    2. Tümör dışı sindirim için 2.7 mL DMEM/%10 FBS, 0.3 mL 1 mg/mL kollagenaz ve 0.03 mL 2.5 μg/mL Amfoterisin B karıştırarak Enzim Çözeltisi II'yi hazırlayın. 37 °C'ye kadar ısıtın.
      NOT: Kollajenaz ve dispas, tümör dokusunun ayrılmasını kolaylaştırır.
  3. Organoid kültür ortamı hazırlayın
    1. %60 organoid bazal ortam, %40 L-WRN koşulluortam 18 (bkz. adım 1.4), 50 ng/mL EGF (büyüme faktörü), 1 mM N-asetil-L-sistein (antioksidan), 5 mM nikotinamid (suda çözünür vitamin), 500 nM A83-01 (TGF-βR inhibitörü (fibroblastların büyümesini önler)), 1x B-27 (serumsuz kültür takviyesi), 1x N-2 (Serumsuz kültür takviyesi) ve 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü) içeren ortam Eso_v1 hazırla.
    2. Ortamı kullanmadan önce 37 °C'ye dengeleyin.
      NOT: L-WRN koşullu ortam (L-WRN hücrelerinden süpernatant), organoid başlatma için gerekli olan WNT, R-spondin ve Noggin sinyallerini sağlar. Y27632, kültür dönemi boyunca bu ortamda yer alır.
  4. L-WRN ile koşullandırılmış ortamı hazırlayın
    1. Bir şişe L-WRN hücresi eritin ve bunları 10 mL DMEM/%10 FBS ile 100 mm ölçüsünde bir kaba tohumlanarak 1–2 gün kültürlendirin.
    2. Ortamı, G418 (son 500 μg/mL) ve Hygromycin B (son 500 μg/mL) içeren 10 mL DMEM/%10 FBS ile değiştirin ve hücreler %80 birleşime ulaşana kadar kültürleyin.
    3. Hücreleri, 10 mL DMEM/%10 FBS (G418 ve Hygromisin B ile) içeren iki 100 mm tabağa geçirin ve hücreler %100 birleşime ulaşana kadar kültürlendirin.
    4. Hücreleri, her tabak başına 20 mL DMEM/%10 FBS (antibiyotiksiz) içeren beş adet 150 mm tabağa geçirin ve %100 birleşime kadar kültür yapın.
    5. Her 150 mm tabaktan ortamı aspire edin ve atın.
    6. Toplama ortamına (organoid bazal ortam, %5 FBS takviyesi olarak) her tabak başına 25 mL ekleyin.
    7. 24 saat kuluçka yapın.
    8. Beş tabaktan (25 mL × 5 = 125 mL) ortamı steril bir cam şişeye toplayın.
    9. 1.4.6–1.4.8 adımlarını tekrarlayın ve toplamda 8 koleksiyon elde edin (hedef havuzlu hacim: ~1.000 mL).
    10. Havuzlanmış CM'yi şişe kapağı filtre ile steril filtreleyin.
    11. Aliquot 40 mL 25 steril 50 mL tüplere koyun.
    12. Aliquotları −80 °C'de sakla.
  5. Fibroblast kültür ortamı hazırlayın
    1. Fibroblast medium-1 hazırlayın.
    2. Ortamı kullanmadan önce 37 °C'ye dengeleyin.
  6. Doku işleme tabakları hazırla
    1. P1000 ucu ile birkaç (üç-beş damla) FBS damlasını iki 100 mm tabağa dağıtarak bir kaplama oluşturun (Tökör dokusu için T çanak, tümör olmayan doku için N Çanak).
      NOT: FBS kaplama, mekanik doğramayı daha düzgün destekler ve küçük doku parçalarının kabak yüzeyine yapışmasını engeller.
  7. Doku işleme ve örnek tanımlama
    1. Tümör ve tümör dışı örneklerin buz üzerinde taşındığını doğrulayın.
    2. Mendilleri az miktarda DMEM/%10 FBS içeren 60 mm'lik bir kabın üzerine koyun ve kullanılana kadar buzda saklayın. Cerrahi rezeksiyondan sonra 16 saat içinde işleme başlayın, böylece canlılığı korumak sağlanır.
    3. Tümör dokusunu sağlam dokusu ve düzensiz yüzey morfolojisi ile tanımlayın; bunlar tümör olmayan dokudan farklıdır.

2. Doku işleme, yıkama ve enzimatik sindirim

NOT: Bu adım, kıyma tümörü ve tümör dışı doku kesitlerini farklı enzim çözeltileriyle sindirmek için yapılır.

  1. Tümör ve tümör olmayan dokuları doğrayın
    1. Her doku örneğini (yaklaşık 5 mm × 5 mm) ilgili FBS kaplı kabına (tümör dokusu için T tenek , tümör olmayan doku için N Çanak N) aktarın.
    2. Her dokuyu steril bir skalpel kullanarak ~0,5 mm ölçüsünde parçalara doğran.
      NOT: Daha küçük parçalar enzimatik erişimi artırır ve sindirim verimliliğini artırır.
  2. Kıyılmış mendiliyi yıkayın.
    1. 10 mL pipetini doku yapışmasını önlemek için FBS ile kaplayın.
    2. FBS kaplı pipetle her tabağa 5 mL PBS ekleyin ve kıyma dokusunu nazikçe tekrar askıya alın.
    3. Askıyı ilgili Tümör Yıkama Tüpü (Tüp A) veya Tümör Dışı Yıkama Tüpü (Tüp C) aktarın.
    4. 2.2.2 ve 2.2.3 adımlarını tekrarlayın (toplam hacim: 10 mL).
    5. Tüplerin oda sıcaklığında 2 dakika beklemesine izin verin; üst yüzeyi çıkarırken, alt kısımda yaklaşık 0,5–1 mL PBS ve doku bırakılır.
    6. Yeni bir pipetle 10 mL taze PBS ekleyin; Pipeti FBS ile kapladıktan sonra, süspansiyonu güçlü bir şekilde pipetleyin ve baloncuk oluşumunu önleyin.
      NOT: Kuvvetli pipetleme, mekanik ayrışmaya ve kan ile mukusun çıkarılmasına yardımcı olur. Baloncuklardan kaçınmak, kesme kaynaklı hücre lizisini önler. Tüm yıkama adımları kalıntıları temizlemek için tasarlanmıştır.
    7. Tüplerin oda sıcaklığında 2 dakika beklemesine izin verin; üst yüzeyi çıkarırken, alt kısımda yaklaşık 0,5–1 mL PBS ve doku bırakılır.
    8. Yıkama prosedürünü (2.2.6 ve 2.2.7. adımlar) iki kez tekrarlayın, toplamda üç yıkama olur.
  3. Dokuları sindirim tüplerine aktarın.
    1. Yeni bir pipetle 10 mL taze PBS ekleyin; Pipeti FBS ile kapladıktan sonra, tümör dokusunu Tümör Sindirim Tüpü'ne (Tüp B) ve tümör olmayan dokuyu Tümör Olmayan Sindirim Tüpü'ne (Tüp D) aktarın.
    2. Tüplerin oda sıcaklığında 2 dakika beklemesine izin verin, üst yüzeyi çıkarın ve tabanda yaklaşık 0,5 mL PBS ve doku bırakın.
  4. Enzimatik sindirim yapın.
    1. Tümör dokusu sindirimi
      1. Enzim Çözüm I (kollajenaz + dispase) hacminin tamamını Tümör Sindirim Tüpü'ne (Tüp B) ekleyin.
      2. 37 °C'de 2 saat boyunca hafif dönüşle kuluçka yapın.
    2. Tümör olmayan doku sindirimi
    3. Enzim Çözeltisi II'nin (sadece kollajenaz) tüm hacmini tümör olmayan Sindirim Tüpü'ne (Tube D) ekleyin.
      1. 37 °C'de 4 saat boyunca hafif bir dönüşle kuluçka yapın.
    4. Örnek kökenine bağlı olarak 3. aşamaya (Tümör örneği işleme) veya 6. aşamaya (Karşılıklı fibroblast tohumlama) devam edin.
      NOT: Tümör ve tümör dışı dokuları sindirmek için kullanılan enzim türleri ile işlem süreleri, önceki deneysel optimizasyonlara dayanarak belirlenmiştir. Tümör dokuları genellikle yoğun ekstrasellüler matriks içerir; Dispase, kollajenaz ile birlikte sindirim kapasitesini artırır.

3. Organoid ve CAF izolasyonu için tümör örneği işleme

NOT: Bu adım, aynı sindirilmiş tümör örneklerinden epitel tümör hücrelerinin organoid oluşumu ve stromal fibroblastlar (CAF) için izole edilmesi için gerçekleştirilir.

  1. Tümörden kaynaklanan hücreleri filtreleyin ve toplayın.
    1. 100 μm hücre süzgecini 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirin.
    2. Süzgeç 3 mL DMEM/%10 FBS geçirerek önceden ıslatın.
      NOT: Ön ıslatma, kuru ağ liflerine yapışmayı engelleyerek hücre kaybını azaltır.
    3. Tümör Sindirim Tüpünün (Tüp B) tüm içeriğini FBS kaplı bir P1000 ucu kullanarak süzgeçe aktararak sindirilmemiş doku parçalarını çıkarın.
    4. Süzgeçten kalan kümeleri durulamak için ek olarak 6 mL DMEM/%10 FBS ekleyin.
    5. Süzgeci çıkarın ve filtratı B tüpü'ne geri döndürün (yeni düşük bağlantılı 15 mL tüp de kullanılabilir).
  2. Filtratı yıkayın ve konsantre edin.
    1. Tüpü 300 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    2. Üst yüzeyi tek kullanımlık pipet ile çıkarın.
    3. 10 mL DMEM/%10 FBS ekleyin, nazikçe ters çevirerek karıştırın ve 300 × g ile 5 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı dikkatlice aspire ederek peleti koruyun.
    5. Kalan hacmi P200 pipeti kullanarak 40 μL'ye indirin.
  3. Organoid ve CAF kültürü için hücreleri tahsis edin.
    1. Organoid tohumlama için 30 μL tahsis edin.
    2. CAF tohumlaması için 10 μL tahsis edin.
      NOT: Bu oran, paralel genişleme için yeterli epitel ve fibroblast popülasyonlarını ampirik olarak sağlar.

4. Organoid tohumlama (3D kültür)

NOT: Bu adım, tümör kaynaklı hücre süspansiyonundan ESCC organoidlerini oluşturmak için gerçekleştirilir.

  1. Taban membran matris kubbeleri hazırlanın.
    1. Standart 24 kuyu tayağını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
      NOT: Plakanın önceden ısıtılması, Basement Membrane Matrix kubbelerinin katılaşmasını hızlandırır.
    2. 30 μL tümör kaynaklı süspansiyon ile 90 μL buz gibi soğuk Basement Membrane Matrix (1:3 oranı) karıştırın.
    3. Dört kuyuya kubbe başına 30 μL uygulayın.
    4. Kubbelerin CO₂ kuluçka atısında 15 dakika boyunca katılaşmasına izin verin.
  2. Organoid kültür ortamı ekleyin
    1. Organoid ortamı önceden karıştırılmış takviyelerle (FGF10, SB202190 ve 1× Amfoterisin B ve 100 μg/mL Primosin gibi antibiyotiklerle hazırlayın; eğer kullanılıyorsa).
      NOT: Güzel 1: Eso_v1; Kuyu 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Well 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Kuyu 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (nihai konsantrasyonlar).
    2. Duvar boyunca her kuyuya nazikçe 1 mL orta madde ekleyin.
    3. Standart CO₂ kültür koşullarında kuluçka yapın.
    4. Her 3–5 günde bir malzemeyi değiştirin.
      NOT: Takviyelerin önceden karıştırılması, küçük hacimleri doğrudan kırılgan Taban Membranı Matris kubbelerine pipetleme ihtiyacını önler. Antibiyotikler organoid yerleşmesinden sonraki ilk 6 gün içinde eklenir. Kültür koşulları (FGF10 +/-, SB202190 +/-) büyüme hızı ve morfolojiye (tercihen küresel) göre belirlenir.
  3. Organoid oluşumunu izleyin.
    1. Kubbeleri her gün ters mikroskopla gözlemleyin.
      NOT: Beklenen morfoloji: 3–5. gün → görünür küreler; 7–10. → yoğun küreler geçiş için hazır.
    2. Organoidler yaklaşık 100–200 μm boyutlarına ulaştığında veya kubbe kalabalıklığı %90 veya daha fazla olduğunda geçiş yapın.

5. CAF tohumlanması

NOT: Bu adım, tümörden kaynaklanan hücre süspansiyonundan CAF'ları belirlemek için yapılır.

  1. CAF'ları kollajen kaplı bir tabağa tohumlayın.
    1. 1,5 mL fibroblast medium-1 içeren 60 mm kolajen kaplı bir tabak hazırlayın.
    2. CAF tohumlaması için ayrılan tümör filtratından 10 μL ekleyin.
    3. 1× Amfoterisin B ve 100 μg/mL Primosin gibi antibiyotikler ekleyin.
    4. Standart CO₂ kültür koşullarında kuluçka yapın.
    5. Her 3–5 günde bir malzemeyi değiştirin.
      NOT: Ampirik olarak, fibroblast medyum-1, CAF ve CF'lerin ilk oluşumu ve büyümesi için diğer ortamlara göre genellikle daha uygundur. Antibiyotikler ancak ilk 6 gün içinde eklenir.
  2. CAF büyümesini izleyin
    1. Fibroblast benzeri iğren morfolojisinin 3–5. günler civarında ortaya çıkışını takip edin.
    2. Geçiş fibroblastları %90–%100 birleşimde.
      NOT: Epitel hücre kontaminasyonu gerçekleşirse, fibroblastlar tripsinasyon süresi ayarlanarak seçici olarak izole edilebilir; çünkü fibroblastlar geçiş sırasında epitel hücrelere göre daha hızlı ayrılır.

6. CF tohumlandırma

NOT: Bu adım, bitişik tümör olmayan dokudan hasta eşleştirilmiş CF elde etmek için yapılır.

  1. Tümör olmayan sindirimi yıkayıp hazırlayın.
    1. Tümör olmayan sindirim tüpünü (D tüpü) 300 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    2. Üst yüzeyi tek kullanımlık pipet ile çıkarın.
    3. 10 mL DMEM/%10 FBS ekleyin, nazikçe ters çevirerek karıştırın ve 300 × g ile 5 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
    4. Süpernatantı dikkatlice aspire edin, pelleti koruyun.
    5. 6.1.3 ve 6.1.4 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
  2. Tohum CF'leri kollajen kaplı bir tabağa
    1. Tüm süspansiyon, 1,5 mL fibroblast medium-1 içeren kolajen kaplı 60 mm bir çanak üzerine aktarın.
    2. 1× Amfoterisin B ve 100 μg/mL Primosin gibi antibiyotikler ekleyin.
    3. Standart CO₂ kültür koşullarında kuluçka yapın.
    4. Her 3–5 günde bir malzemeyi değiştirin.
      NOT: Antibiyotikler sadece ilk 6 gün boyunca eklenir.
  3. CF büyümesini takip edin.
    1. 3–5 gün içinde başlayan fibroblast benzeri iğne morfolojisini gözlemleyin.
    2. Geçiş fibroblastları %90–%100 birleşimde.

7. Organoid geçişi ve kriyokonserasyon

  1. Organoid geçiş.
    NOT: Bu adımın amacı, organoidler uygun yoğunluğa ulaştıklarında genişlemektir.
    1. Eski ortamı aspire edin ve her birini 1 mL PBS ile iyice yıkayın.
    2. Her kuyuyuya organoid için 0,5 ml önceden ısıtılmış tripsin ekleyin.
    3. P1000 ucu ile pipet yapın, ucu Basement Membrane Matrix kubbesini bozmak için ucun kenarını kullanın.
      NOT: Mekanik kesme, yoğun Bazal Zar Matrisini parçalamaya yardımcı olur ve enzimatik erişimi iyileştirir.
    4. Tüm jel kümeleri çözülene kadar CO₂ kuluçka içinde 10–15 dakika kuluçka yapın. Organoidleri 20–50 hücre kümelerine ayırın.
      NOT: Tam tek hücreli ayrışmadan kaçının, çünkü bu canlılığı azaltır.
    5. Süspansiyonu düşük bağlantılı 15 mL bir tüpe toplayın.
    6. Kuyunu dört kez 0.5 mL DMEM/%10 FBS ile durulayın ve tüm duralamaları aynı düşük tutucu tüpe aktarın.
    7. Tüpü 300 × g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    8. Süpernatantı çıkarın ve pelleti minimum DMEM/%10 FBS ile yeniden askıya alın; süspansiyon hacmini 80 μL'ye ayarlayın.
    9. 80 μL organoid süspansiyonu 240 μL buz gibi soğuk Basement Membrane Matrix (1:3 oranı) ile karıştırın.
    10. Karışımı, her kuyu başına 4–6 kubbe olan önceden ısıtılmış 6 kuyu (37 °C) bir plakaya yerleştirin.
    11. Kubelerin 15 dakika katılaşmasına izin verin, ardından her kuyu başına 3 mL Eso_v1 ortam (4.2. adımda başlangıç kültüründe optimal olan bileşim) ekleyin.
    12. Her 3–5 günde bir malzemeyi değiştirin.
      NOT: Organoidler, yaklaşık 100–200 μm çapa ulaştıklarında veya kubbe kalabalıklığı %90'ı geçtiğinde geçiş yapar. Hücre sayımı yapılmaz. Rutin alt kültürler için organoidler 1:4 ile 1:10 oranında bölünür. Sferoidlerin hızlı bir şekilde yeniden oluşması 48–72 saat içinde beklenmektedir.
  2. Organoid kriyokonserasyon
    1. Her kiyi 3 mL PBS ile yıkayın.
    2. Her kuyuya organoid için 1,5 mL tripsin ekleyin, güçlü bir şekilde pipet yapın ve 10 dakika kuluçka yapın.
    3. Tüm süspansiyonu düşük bağlantılı 15 mL bir tüpte topla ve kuyuyu dört kez durulayın.
    4. Tüpü 300 × g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın.
    5. Pelleti 2 mL %90 FBS/%10 DMSO ile yeniden askıya alın.
    6. Her kriyoviale 0.5 mL al.
    7. Şişeleri dondurucu bir kaba koyun ve gece boyunca −80 °C'de saklayın.
    8. Şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azota aktarın.
      NOT: Organoidler yaklaşık 100–200 μm çapına ulaştıklarında veya kubbe kalabalıklığı %90'ı aştığında stoklanır.
  3. Donmuş organoidlerin geri kazanılması
    1. Kriyovial'ı 37 °C'lik su banyosunda hızla eritin.
    2. İçeriği 15 mL bir tüpte 5 mL DMEM/%10 FBS'ye aktarın.
    3. Tüpü 300 × g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    4. Üst sıvıyı çıkarın ve pelleti 40–60 μL DMEM/%10 FBS ile yeniden süspansiyona bırakın.
    5. Süspansiyonu buz gibi soğuk Basement Membrane Matrix ile 1:3 oranında karıştırın.
    6. Karışımı, önceden ısıtılmış 6 kuyu (37 °C) bir levhaya her kuyu başına 4–6 kubbe olarak yerleştirin.
    7. Kubelerin 15 dakika katılaşmasına izin verin, ardından her kuyu başına 3 mL Eso_v1 ortam (4.2. adımda başlangıç kültüründe optimal olan bileşim) ekleyin.

8. Fibroblast geçişi ve kriyokonserasyon

  1. Geçiş CAF'ler ve CF'ler
    NOT: Bu adımın amacı, fibroblastlar uygun yoğunluğa ulaştıklarında genişlemektir.
    1. Tabağı 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. 0,4 mL %0,25 tripsin ekleyin.
    3. CO₂ kuluçka makinesinde 5 dakika kuluçka yapın, ayrılmayı mikroskop altında izleyin.
    4. Tripsini DMEM/%10 FBS ile nötralize edin ve tüm hücre süspansiyonunu 10 mL medyum içeren 100 mm'lik bir tabağa aktarın.
      NOT: Fibroblastlar %90–%100 birleşmeye ulaştıklarında geçiş yapar. Rutin alt kültürler için ise 1:3 oranında bölünürler. Ampirik olarak, hücre yoğunluğu düşük olduğunda fibroblast çoğalması yavaşlar veya durur.
  2. Fibroblast kriyokonserve
    1. Hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın.
    2. 1 mL %0,25 tripsin ekleyin, ardından CO₂ kuluçka makinesinde 5 dakika kuluçka yapın.
    3. Tripsini DMEM/%10 FBS ile nötralize edin ve tüm hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    4. Santrifüj 300 × g'de 5 dakika boyunca kullanın.
    5. Hücre pelletini 2 mL %90 FBS/%10 DMSO ile yeniden askıya alın.
    6. Her kriyoviale 0.5 mL al.
    7. Şişeleri dondurucu bir kaba koyup gece boyunca −80 °C'de sakla.
    8. Şişeleri uzun süreli depolama için sıvı azota aktarın.

9. Koşullu orta test

NOT: Bu adımın amacı, fibroblastların ESCC tümör organoidleri üzerindeki parakrin etkilerini koşullu ortam (CM) kullanarak değerlendirmektir. Bu test, doğrudan birlikte kültür henüz optimize edilmediğinde tekrarlanabilir bir stromal–tümör etkileşim modeli sağlar.

  1. CAF/CF koşullu ortamın hazırlanması
    1. Aynı sayıda CAF veya CF, 3 mL DMEM/%10 FBS ile 60 mm tabak üzerinde %80–%90 birleşime kadar kültürlenin.
    2. Hücreleri bir kez 2 mL PBS ile yıkayın.
    3. 3 ml DMEM/%2 FBS ekleyin.
    4. CO₂ kuluçka makinesinde 48 saat kuluçka yapın.
    5. Süpernatantı 15 mL'lik bir tüpe toplayın.
    6. Hücresel kalıntıları çıkarmak için 2000 × g sıcaklığında 5 dakika santrifüj yapın.
    7. 2.5 mL süpernatantı yeni bir 15 mL tüpe toplayın.
    8. Şartlı ortamı 100–500 μL porsiyonlara ayırın ve -80 °C'de depolayın.
  2. Organoid analiz ortamının hazırlanması
    1. ESCC organoid ortamını 1.3. adımda tarif edildiği gibi hazırlayın.
    2. Organoid ortam ile koşullu ortamı 1:1 oranında (%50 v/v) karıştırın.
  3. Organoid analiz ortamı kullanılarak kanser organoidlerinin kültürü.
    1. 7. adımda açıklandığı gibi organoid geçişi takip ederek, tohum organoidleri her kuyu başına önceden ısıtılmış 48 kuyu (37 °C) üzerinde tek bir 20 μL Taban Zarı Matris kubbesine yerleştirir.
    2. Kubbe katılaşmasından sonra, her kuyuya 0.3 mL organoid test ortamı ekleyin.
    3. Organoid test ortamını her 3–7 günde bir değiştirin.
    4. Kanser organoidlerinin morfolojisini ve boyutunu değerlendirin.
      NOT: Tüm insan kaynaklı materyaller potansiyel olarak bulaşıcı olarak değerlendirilir. Eldiven, maske ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlar her zaman giyilir. Kollajenaz, dispaz ve dimetil sülfoksit (DMSO) cilt, göz ve solunum yolu tahrişine neden olabilir; bu nedenle doğrudan temas ve soluma kaçınılır. İnsan dokularını içeren tüm enzimatik işlemler kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilir. İnsan dokusu içeren sıvı atıklar, kapalı biyolojik tehlike kaplarında toplanır ve bertaraf edilmeden önce otoklavlanır. DMSO ve enzim çözeltileri dahil kimyasal atıklar, kurumsal tehlikeli atık yönergelerine uygun olarak bertaraf edilir. Tüm yeniden kullanılabilir aletler %70 etanol ile durulanır ve tekrar kullanılmadan önce otoklavlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tümör bölgesinden ve tümörden 3 cm uzaklıkta bulunan bitişik tümör olmayan bölgeden doku örnekleri alındı; bu bölge, neoadjuvan kemoterapi almamış ESCC hastasından cerrahi olarak çıkarıldı. Kanser organoidleri ve CAF'lar tümör bölgesinden izole edilirken, CF'ler tümör olmayan bölgeden izole edildi. Cerrahi dokular yaklaşık 0,5 mm boyutunda parçalara bölündü (Şekil 2A), ardından enzimatik olarak tedavi edildi; ardından kanser organoidleri ve fibroblastlar ayr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki raporlar, insan kolon, meme, pankreas ve baş ve boyun kanserlerinde CAF'ların çoğalma ve ilaç direncindeki rolünü araştırmak için kanser organoidleri ve hasta eşleştirilmiş CAF'larıkullanmıştır 20,21,22,23,24. Bu çalışmalar, CAF'ların çoğalma ve ilaç direncini etkilediğini göstermiştir. Öte yandan, mevcut bildiğim kadar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, P. Z.'ye verilen Juntendo Üniversitesi Genç Araştırmacı Ödülü (2024 ve 2025) ve Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan Bilimsel Araştırma için Yardım Hibeleri (23K07362, 21K08693) tarafından desteklenmiştir. Patoloji ve Onkoloji bölümleri ile Özofagus ve Gastroenterolojik Cerrahi bölümlerinin tüm üyelerine teşekkür etmek isteriz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100 mm çanTPP93100
100x Penisillin-Streptomisin (PS)Nacalai26253-84
15 ml tüpFastGeneFG2001
24-kuyu hücre kültür plakasıTPP92024
48 delikli hücre kültür plakasıTPP92448
50 ml tüpFastGeneFG2004
60 mm çanakTPP93060
6-kuyu hücre kültür plakasıTPP92006
A83-01Cayman9001799
İleri DMEM/F12 Gibco12634010Organoid bazal ortam = İleri DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-fare IgGInvitrogenA11029
Amfoterisin BThermoFisher15290018
Anti-Vimentin antikoru (V9)Santa CruzSC-6260Kullanım için 1/500 seyreltme
B-27ThermoFisher17504044
Şişe kapağı filtreSartorius180F15
Hücre süzülce, 100 ve mikro; M gözenekBD Falcon352360
Kollagenaz, Tip ISIGMAC0130
Kolajen kaplı 60 mm disheIWAKI4010-010
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Wako043-07216
Dispase IGODO SHUSEI386-02271
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Aracı (DMEM)Nacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Fetal Sığır Serumu (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Fibroblast Büyüme Ortamı 2PromoCellC-23020Fibroblast ortam-1 = Fibroblast Büyüme Ortamı 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblast ortam-2 = HFDM-1 + %1 FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HigromisinInvivogenANT-HG-1
IncuCyte sistemiEssen BioScience
L-WRN hücreleriATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Bazal Zar Matrisi = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-asetil-L-SisteinWako017-05131
NikotinamidTCIN0078
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenant-PM-05
Rekombinant insan EGF'siPEPROTECHAF-100-15
Rekombinant insan FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Skalpel, No 11Tüy8-3086-02
STEMFULLSumitomo bakalitMS-90150Düşük bağlantılı 15 mL tüp = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Organoid için tripsin = TrypLE Express
TripsinNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Kaynaklar

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

ESCC OrganoidleriTümör MikroçevresiFibroblast BelirteçleriHasta ile Eşleştirilmiş FibroblastlarÜç Boyutlu KültürTümör-Stroma Etkileşimleri
Aynı Özofagus Kanseri Hastasından Tümör Organoidlerinin, Karsinomla İlgili Fibroblastların ve Karşıt Fibroblastların Oluşturulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.