Yöntem makalesi

Mikrodiyaliz probun yerleştirilmesiyle fare femoral arteriovenöz adventisyen interstisiyel sıvısının gerçek zamanlı örnekleme alınması

437 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, anestezi altındaki sıçanlarda adventisyal interstisyel sıvının (AISF) gerçek zamanlı, anatomik olarak hassas örneklemesini kolaylaştıran, belirgin metabolik varyasyonları ortaya çıkaran ve benzersiz fizyolojik önemini doğrulayan bir mikrodiyaliz tekniği tanıtmaktadır. Mevcut ara akışkan (ISF) örnekleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım gelişmiş moleküler çözünürlük ve örnekleme kararlılığı sağlar.

Özet

Interstisyel sıvı (ISF), hücre dışı mikroçevrenin hayati bir unsurudur ve metabolik değişimi ve hücreler arası iletişimi kolaylaştırır. Buna rağmen, anatomik derinlik ve damar yapılarına yakınlığı, adventisyen ISF'yi (AISF) özellikle kontaminasyon veya doku bozulması olmadan örneklemeyi zorlaştırır. Bu çalışmada, anestezi altındaki sıçanlarda mikrodiyaliz kullanılarak AISF toplama için gerçek zamanlı, minimal invaziv bir yöntem tanıtıyoruz. İki adet 20 kDa'lık kesim probları, sırasıyla femoral arteriovenöz adventitia ve juguler ven bölgelerine cerrahi olarak yerleştirilerek ISF ve kan sürekli örneklemesini sağladı. Yapay ekstrasellüler sıvı ile perfüzyon, düşük moleküler ağırlıklı metabolitlerin seçici difüzyonu mümkün kıldı. Ana bileşen analizi (PCA) ve ortogonal kısmi en küçük kare ayırt analizi (OPLS-DA) sayesinde, AISF ile kan arasında belirgin bir metabolik ayrışma gözlemlendi ve 146 anlamlı farklı metabolit tespit edildi. Laktat ve serotoninin zenginleştirme desenleri, yöntemin anatomik özgüllüğünü ve işlevsel güvenilirliğini doğruladı. Önemli olarak, AISF plazmada olmayan yerel olarak sentezlenmiş metabolitlerle zenginleştirilmiş ve bu da onun benzersiz fizyolojik önemini ortaya koymuştur. Mikroiğneler, emici kabarcıklar ve ters iyotoforez gibi mevcut interstisiyel sıvı (ISF) örnekleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mikrodiyaliz gelişmiş moleküler çözünürlük, daha yüksek örnekleme kararlılığı ve azaltılmış invazivlik sağlar. Bu teknik, interstisiel sıvıda (AISF) analitlerin in vivo analizi için güvenilir bir platform oluşturur ve biyobelirteç keşfi ile damar patofizyolojisi araştırmalarında önemli bir potansiyel gösterir.

Giriş

Doku sıvısı veya interstisyel sıvı (ISF), hücresel mikroçevrenin hayati bir unsurunu oluşturur ve akademik araştırmalar 19. yüzyılın sonlarına kadar uzanır. 1896'da Starling, ISF'yi plazma ultrafiltrasyonu yoluyla üretilen homojen bir sıvı olarak ilk olarak tanımlayan kapiler filtrasyon-yeniden emilim teorisini tanıttı; bu teori besin taşıması ve metabolik atık uzaklaştırılmasında hayati roloynadı. Son yirmi yılda, mikroskobik görüntüleme teknolojisi ve moleküler biyolojideki gelişmeler, araştırmacıların ISF2'nin anatomik dağılımı, bileşimi ve işlevindeki önemli çeşitliliği anlamalarını artırmıştır.

Farklı anatomik alanlarda interstisyel sıvı (ISF) üzerine yapılan araştırmalar, farklı dokularda onun farklı işlevlerini ortaya koymuştur. Örneğin, beyin dokusunda ISF, uyku sırasında β-amiloid gibi nörotoksik metabolitlerin glimfatik sistem3 aracılığıyla temizlenmesini kolaylaştırır. Buna karşılık, tümör interstisyel sıvısı (TIF), laktik asit birikimi yoluyla asidik bir mikroortamı teşvik ederek tümör istilası ve bağışıklıkkaçışına katkıda bulunur 4. Bu bulgular, ISF'nin sadece metabolik değişimin aracısı olmakla kalmayıp, aynı zamanda dokuya özgü patofizyolojik süreçlerin aktif bir düzenleyicisi olarak da işlev gördüğünü göstermektedir. Bu bağlamda, Adventisyen Interstisial Fluid (AISF), özgün anatomik lokalizasyonu ve fonksiyonel karmaşıklığı nedeniyle benzersiz bir araştırma zorluğu sunar. AISF, adventitia ile çevresindekidokular arasındaki noktada yer alır ve damar duvarı ile sinir ve bağışıklık sistemleri arasındaki etkileşimde kritik bir rol oynar. Ancak, derin anatomik konumu ve kan ile lenfatik sıvılara yakınlığı, yerinde örnekleme ve bileşimsel analiz için önemli teknik zorluklar yaratmıştır.

ISF örnekleme için geleneksel teknikler, fitil yöntemi ve cerrahi drenaj dahil, kan kontaminasyonu ve doku hasarı riski nedeniyle yüksek saflıkta AISF örnekleri elde etmekte önemli zorluklarla karşılaşmaktadır. Örneğin, damar epitelinin cerrahi olarak alınması, periferik sinirlere veya lenfatik damarlara zarar verebilir ve bu da hedef dışı biyomoleküllerinkarışmasına yol açabilir 6. Ayrıca, bu yöntemler düşük örnekleme oranları, istikrarsızlık, parazite yatkınlık ve kötü tekrarlanabilirlik nedeniyle sınırlıdır; genellikle deri altı fitilyerleştirme 7 ile oluşan iltihaplanma ve kas implantasyonu sırasında hücresel hasara bağlanır. Mikrodiyalizin geliştirilmesi, ISF çalışmaları için daha etkili bir yaklaşım sunar. Bu teknik, yarı geçirgen bir membran probu kullanılarak damar yapısını bozmadan ISF içinde metabolitler ve sitokinler gibi küçük moleküllerin yerinde ve dinamik olarak yakalanmasına olanak tanır. Prob, damar epitelyal boşluğunda hassas bir şekilde konumlandırılabilir, böylece kan veya lenfatik sıvılardan kaynaklanan kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, çeşitli koşullarda ISF metabolizmasındaki dinamik değişikliklerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan sürekli örnekleme imkanı sağlar. Deney sırasında bu metabolik süreçlerin sürekli ve istikrarlı izlenmesini sağlamak.

Protokol

Hayvan deneyleri, Pekin Birliği Tıp Fakültesi Hayvan Etik Komitesi'nin onayı üzerine gerçekleştirildi. Tüm prosedürler yerleşik protokollere sıkı sıkıya uyuldu. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Deneysel hazırlık

  1. Mikrodiyaliz örnekleme sistemi ve ilgili cerrahi aletleri Şekil 1'de gösterildiği gibi gösterin.
  2. 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl ve 1,25 mM glukoz içeren yapay ekstraselüler sıvı (aECF) hazırlanır ve pH 7,4'e ayarlanır.
  3. İki adet 20-kDa mD probu hazırlayın ve bunları Prob 1 (doku sıvısı probu) ve Prob 2 (kan probu) olarak adlandırın. Prob 1'i steril filtrelenmiş deyonize suya (dH₂O) ve Prob 2'yi %1 sodyum heparine yerleştirin; böylece prob uçları sürekli nemli kalsın.
  4. "Giriş" ve "çıkış" için iki yol çifti (Yollar 1 ve 2) oluşturun. PE50 boru kullanarak iki 1 m FEP boru segmentini bağlayın, böylece ölü alanı en aza indirin. Her bir giriş borusunu 1 mL Exmire şırıngasına bağlayın: Şırınge 1'i dH₂O ile, Şıringe 2'yi ise %1 sodyum heparin ile doldurun. Mikro şırıngaları problara bağlayın ve probları juguler ven içine yerleştirdikten sonra aECF infüzyonuna hazırlanın.
  5. mD pompasını aktive edin ve akış hızını çıkış tüpünden sıvı çıkana kadar 1,5 μL/da'ya ayarlayın. Çıkış borusunu örnek toplama hattına bağlayın.
  6. İki mikroşırıngayı filtrelenmiş aECF ile doldurun ve 1 μL/dakika hızında pompalamayı başlatın.

2. Hayvan hazırlığı

  1. 280 ± 20 g (n = 6) ağırlığında seçilmiş yetişkin Sprague-Dawley fareleri.
  2. Anestezi %3 isofluran ile indük edin ve hava/oksijen karışımında 1,8%-2,2% isofluran ile kalpin aktivitesini izlerken (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak) devam edin. Derin anestezi, ağrı yanıtının yokluğunu değerlendirerek ve kalp atış hızının azaldığını (340-390 bpm) belirterek doğrulayın. Fareyi termostatik bir battaniyeyin üzerine koyun ve uzuvları hareketsiz hale getirin.
  3. Saç alma kremini boynuza ve sol arka ayağa, sol alt karına kadar sür. Depilasyon yapılan bölgeleri iki kez iyodofor ile dezenfekte edin ve kalan iyotu %75 tıbbi alkol ile çıkarın.

3. Çift bölgeli prob yerleştirme (femoral adventitis ve juguler vein)

  1. Şekil 2A'da gösterildiği gibi 10 mm aktif diyaliz penceresine sahip bir prob kullanın (CMA-20, 20 kDa kesme kapalı, 0,5 mm mil çapı).
  2. Kılavuz iğnesini ve sökülme tüpünü hazırlayın (Şekil 2B).
  3. Farenin arka ayağını, diz eklemini ve inguinal kırışıklığın orta noktasını birbirinden ayıran çizginin vücudun boyuna eksenine dik olacak şekilde uzatın. Cerrahi işaret alanını belirlemek için kamuk bölgesinin derisi boyunca arka ayakta 2 cm uzunluğunda bir segment ölçün (Şekil 2C). Bu inguinal bölgenin orta noktasını mikropencere konumlandırma noktası olarak belirleyin. Delik noktasını bu konumlandırma noktasına 2 cm yan olarak işaretleyin (Şekil 2D).
  4. Hayvanı stereomikroskop altına alın.
  5. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak ve probun perivasküler membran içinde doğru konumlanmasını sağlamak için inguinal kıvrımın ortasında 0,5-0,8 cm uzunluğunda bir kesi yapın. Subkutan dokuyu keserek femoral arter ve ven, safen ven ve yüzeysel karın duvarı venini ortaya çıkarın (Şekil 2E).
  6. Delik iğnesinin dış tabakasını yırtılabilir bir tüple kaplayarak kılavuz iğne oluşturun.
  7. Delikleme noktasında derinin altında herhangi bir kan damarı olmadığını doğrulayın. İğneyi dikey olarak deriden geçirin, ardından açıyı 45°'ye ayarlayarak safen venin çevresindeki doku boşluğuna girin.
  8. İğneyi büyük safen ven içindeki kan akışına doğru ilerletin ve işlem boyunca damar duvarıyla yakın temas halinde kalın. İğne pozisyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek ve damar yaralanması veya kan kontaminasyonunu önlemek için stereomikroskop kullanın. Daha sonra iğneyi femoral venin adventitiosuna yönlendirin (Şekil 2F).
  9. Delik iğnesini çekip koparılabilir tüpü doku içinde yerinde bırakın (Şekil 2G).
  10. Doku sıvısı probunu yırtılabilir katetere yerleştirin ve kateteri dikkatlice açın, örnekleme bölgesini açığa çıkarın ve doku örneğini alın (Şekil 2H). Probun femoral arter ve venin adventitis'i içinde tam olarak konumlandırıldığından emin olun (Şekil 2I). Dikiş öncesi probu deriye sabitleyin (Şekil 2J). Tüm işlemleri katı aseptik koşullarda gerçekleştirin; damar adventisinin bozulmamasına ve doku sıvısının toplanmasını engelleyebilecek doku iltihabı veya yabancı cisim reaksiyonlarını önlemeye özen gösterin.
  11. Sondanın konumunu sabit probla birlikte cerrahi bir cetvel fotoğraflayarak poz uzunluğunu belgeleyin ve bu görüntüyü Şekil 2I'de gösterildiği gibi sunun.
  12. Boynun orta hattına yaklaşık 0,5 cm yan tarafta 2 cm uzunluğunda bir deri kesisi yapın, bu kesik sternal çentikten 1 cm yukarıda başlar.
  13. Sternokleidomastoid kas boyunca kesik keserek karotis arterinin yan tarafında bulunan ve koyu mavi renkiyle tanımlanan juguler ven ortaya çıkarılır. Fasyanı nazikçe ayırmak için nemli pamuklu bir çubuk kullanın, vagus siniriyle temas etmemeye özen gösterin.
  14. Mikroskobik forseps kullanarak, juguler venin dış zarını nazikçe yükseltin ve çevresindeki bağ dokusunu dikkatlice çıkararak en az 1 cm serbest damar uzunluğu elde edin. 4-0 ipek dikişi yedek ligatür olarak hizmet etmek için proksimal olarak yerleştirin (Şekil 2K).
  15. Venöz ponksiyon için, damar çapının yaklaşık üçte biri olan 45° açıda eğik bir kesi yapılabilir. Kesiyi nazikçe açmak ve prob yerleştirmek için bir giriş oluşturmak için mikroforseps kullanın.
  16. Prob ucunu dikkatlice damara sokup yavaşça 3,5-4,0 cm derinliğe kadar ilerletin ve ucunun sağ atriumun girişine ulaştığından emin olun (Şekil 2L).
  17. Probu çift düğümle proksimal ipek bağlayıcıyı sıkılaştırarak sabitleyin. Kas katmanını 4-0 Vicryl dikişleriyle kapatın, ardından deriyi kesintili dikişlerle dikin. Probun dış kısmını cilt yüzeyine sabitleyin, böylece yer değiştirmeyi önleyin.

4. Örnek toplama ve sonda geri kazanma

  1. Örnek toplama: Doku diyalizi ile numune transferi arasındaki ilişkiyi değerlendirin. Prob ile kollektör arasında toplam 20 μL hacmi tutulur.
    1. Numunenin prob ve boru içinden geçip 1 μL/dakika akış hızıyla toplanması için borunun sonuna ulaşması için 20 dakikalık bir süre bekleyin. Test için gerekli konsantrasyonu elde etmek için yeterli hacim toplayın. Her toplama tüpü için 30 μL diyalizatat toplayın.
  2. Numune depolama: 0,5 mL polipropilen toplama tüplerini 4 °C'ye kadar önceden soğutma. Toplamanın hemen ardından tüpleri kapatın, sıvı azotta 30 saniye dondurun ve 2 dakika içinde -80 °C dondurucuya aktarın.
  3. Temel örnek: Örnek toplamaya başlamadan önce tam örnek dengesi. Anestezi altında her sıçan için üç örnek toplayarak istikrarlı bir ölçüm temeli oluşturulur.
  4. Prob çıkarma: Numune toplama tamamlandıktan sonra probu hayvanın başından çıkarın ve %1 sodyum heparin içeren bir depo şişesine yerleştirin. Hayvanı fazla izofluran soluyarak ötenazi yapın.
  5. Prob koruma: Probu tuzlu su ile iyice durulayın ve tuzlu bir çözelti içeren şişede saklayın. Mikrob büyümesini önlemek için tüpleri bir şırıngayla tuzlu su ile yıkayın. Prob yalnızca yeterli akışı koruyorsa ve zar sağlam kalırsa tekrar kullanılabilir.

5. Veri analizi

  1. Ana Bileşen Analizi (PCA), Ortogonal Kısmi En Küçük Kare Ayırt Edici Analizi (OPLS-DA) ve MetaboAnalyst 6.0 kullanarak ek istatistiksel analizler gerçekleştirin. OPLS-DA'yı özellikle Projeksiyonda Değişken Önemi (VIP) belirlemek için kullanın.
  2. Diferansiyel metabolitleri incelemek için P-değer değerlendirmeleri ve katlama değişimi analizi gibi parametrik olmayan testler uygulanır. Diferansiyel metabolitleri taramak için kritik eşikleri VIP > 1, FC ≥ 2 veya FC ≤ 0.5 ve P < 0.05 olarak belirleyin.
  3. Tanımlanan metabolitleri KEGG Bileşik Veritabanı kullanarak nota edin.

6. HPLC - MS/MS

  1. Pozitif iyon modunda çalışan elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağına sahip AB Sciex 6500+ üçlü quadrupol kütle spektrometresi kullanılarak metabolit nicelik ölçer.
  2. Cihaz parametrelerini şu şekilde ayarlayın: perde gazı, 40 psi; çarpışma gazı, 10 psi; iyon kaynaklı gaz 1 (GS1), 50 psi; iyon kaynaklı gaz 2 (GS2), 55 psi; iyon püskürtme voltajı, 4500 V; ve kaynak sıcaklığı 550 °C.
  3. Sistemi çoklu reaksiyon izleme (MRM) modunda çalıştırın. Her metabolit için MRM geçişlerini, kümelenme potansiyellerini ve çarpışma enerjilerini ayrı ayrı optimize edin. Analist 1.7.1 yazılımı ile veri toplama ve MultiQuant 3.0.3 ile nicel analiz gerçekleştirin.
  4. Kromatografik ayrım için, 45 °C'de tutulan bir C18 kolonu (2.1 × 100 mm, 1.7 μm) kullanabilirsiniz. Hareketli fazlar (A) suda %0,1 formik asit ve asetonitrile %0,1 formik asit olarak hazırlanır. Akış hızını 0,35 mL/dakika, enjeksiyon hacmini ise 6 μL olarak ayarlayın. Analizden önce otomatik numune alma makinesi sıcaklığını 4 °C'de tutun.
    NOT: Bu çalışmada her koşu toplamda yaklaşık 25 dakika sürdü.

Sonuçlar

Veri seti, toplam ve logaritmik dönüşümler uygulanarak normalleştirildi ve ardından kapsamlı bir istatistiksel analiz seti geçirildi. Ana Bileşen Analizi (PCA) yapıldı (Şekil 3A), belirgin ayrımlar ortaya çıktı ve metabolik farklılıklar ortaya çıktı. Sonrasında, Ortogonal Kısmi En Küçük Kareler Ayırt Edici Analiz (OPLS-DA) modeli geliştirildi ve ortaya çıkan puanlar Şekil 3B'de gösterilerek modelin ayırt edici etkinliğini gösterdi. 618 metabolitin değerlendirilmesinde, AISF ile kan örneklerini karşılaştıran volkan grafikleri 146 farklı metabolit tespit etmiş ve doku sıvısı hem aşağı regülasyona hem de yukarıya regülasyona sahip metabolitler sergilemiştir (Şekil 3C). Ayrıca, en iyi 50 diferansiyel metabolitin karşılaştırmalı bir genel bakışını sağlamak için bir ısı haritası oluşturuldu (Şekil 3D).

Örnekleme yönteminin güvenilirliğini değerlendirmek için, serotonin ve laktik asit sırasıyla doku sıvısı bileşenleri ve kan içeren pozitif kontrol olarak kullanıldı. Sonuçlar, Şekil 4'te gösterildiği gibi, bu bileşenlerin çeşitli vücut sıvıları üzerindeki belirlenmiş dağılımlarıyla uyumludur. Ek Şekil 1 , -80 °C'de depolanan mikrodiyalizat aliquotlarında laktat ve serotonin stabilitesini göstermektedir.

146 diferansiyel metabolit sistematik olarak birkaç kategoriye ayrıldı: nukleozidler, nükleotidler ve bunların analogları; yağ asitleri ve türevleri; amino asitler, peptitler ve bunların analogları; karbonhidrat ve karbonhidrat konjugatları; organik asitler ve onların türevleri; biyojenik aminler; pürinler ve pirimidinler; vitaminler ve steroidler; ve diğer bileşiklerin yanı sıra (Şekil 5A). Ek Tablo 1, kanda tespit edilen diferansiyel metabolitleri göstermektedir. Isı haritası analizleri, biyojenik aminlerin ve amino asitlerin, peptitlerin ve benzerlerinin çeşitli vücut sıvıları üzerindeki zenginleşme desenlerini daha da netleştirir (Şekil 5B,C). Diferansiyel metabolit zenginleştirme analizi Şekil 6'da sunulmaktadır. Ek Tablo 2, ardışık üç perivasküler doku-sıvı örneğinde rastgele seçilmiş on beş metabolit için varyasyon katsayısını (CV) listeler.

Şekil 1
Şekil 1: Deneysel cihazın görüntüleri. (A) Soğutmalı fraksiyon toplayıcı. (B) Şırınga pompası. (C) Mikro şırıngalar. (D) Damar makas ve cımbız gibi cerrahi aletler. (E) Anestezi makinesi. (F) Mikrodiyaliz probları. (G) Mikrodiyaliz probları, doku kılavuz iğne ve yırtılabilir bir tüp. (H) Doku kılavuz iğne montajları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Çalışmadaki temel adımlar. (A) Cerrahi bölgenin konumunu ve probun yönelimini gösteren bir diyagramı gösteren şematik bir temsil. (B) Prob yerleştirme noktalarının hassas gözlemini sağlamak için kritik damar bağlantılarının tanımlanması. (C) Deriye nüfuz eden ve doku boşluğuna ilerleyen rehber iğnenin yerleştirilmesi. (D) Kılavuz pin iğnelerinin geri çekilmesi çekilir ve yırtılabilir tüp doku içinde kalır. (E) Mikrodiyaliz probu, kurulan kanal üzerinden dokuya aktarılır. (F) Yırtılabilir tüpün nazikçe geri çekilmesi. Yırtılabilir tüp, prob sabitlendikten sonra nazikçe geri çekilir. (G) Femoral, arterial ve venöz damarların epitelinde konumlanmış probların görselleştirilmesi. (H) Juguler venden dokunun ayrılması. (I) Probun juguler damara yerleştirilmesi. (J) Mikrodiyaliz probu cilt yüzeyine sabitlenir. (K) juguller venin izolasyonu. (L) Probun juguler ven içine yerleştirilmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: Interstisial sıvı (ISF) ve kanın çok değişkenli istatistiksel analizi. (A) Veriler, önemli ayrımları vurgulamak için küçültülmüş ve ISF ile kan bileşenleri arasındaki belirgin farklılıkları göstermiştir. (B) Ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analiz (OPLS-DA) model puanları sırasıyla 0.925 ve 0.811 olan R2Y ve Q2 değerlerini gösterir. (C) Volkan grafiki 146 diferansiyel metaboliti gösterir; ISF'de 85 metabolit aşağı, 61 ise yukarı regülasyonludur. (D) Buna karşılık, ISF ve kandaki en iyi 30 metaboliti karşılaştıran ısı haritaları, iki bileşen seti arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: Bir dizi kutu grafikinin sunumu, ISF ve kandaki laktat ve serotonin zenginleştirme seviyelerini açıkladı. Tüm veri noktaları ortalama ± SEM'i temsil eder; Tüm nicel paneller için hata çubukları gösterilmiştir. Panel (A), ISF örneklerinin kan örneklerine kıyasla laktat açısından önemli ölçüde daha fazla zenginleşme gösterdiğini göstermektedir. Buna karşılık, panel (B) serotoninin kan örneklerinde daha zenginleştiğini ve aynı anda daha düşük laktat seviyelerini gösterdiğini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5
Şekil 5: Diferansiyel metabolitlerin sınıflandırma halkası tablosu ve amino asitlerin, peptiptlerin ve analogların ısı haritası ile biyojenik aminler gösterilmiştir. (A) Her renk bloğu, belirli bir metabolit sınıfına karşılık gelir. Amino asitler, peptitler ve analoglar en büyük kategoriyi oluşturur ve toplamın %19,29'unu oluşturur; onları nükleozidler, nükleotidler ve analoglar (%15), yağ asitleri ve türevleri (%12,86), karbonhidratlar ve karbonhidrat konjugatları (%7,86), organik asitler ve türevler (%10), biyojenik aminler (%7,14), pürinler/pirimidinler (%5,71), vitaminler ve steroidler (%8,57) ve indollar, azepinler, piridinler ve benzenler gibi diğer bileşikler (%13,57) gelir. (B) Interstisyel sıvıda (ISF), biyojenik aminler kategorisindeki Deoksikarnitin ve Spermidin gibi bileşiklerin zenginleştirme seviyeleri kandakine göre belirgin şekilde yükselirken, Serotonin (D4), Serotonin, Triptamin ve ilgili bileşikler seviyeleri önemli ölçüde azalır. (C) ISF'de, amino asitler, peptitler ve analoglarla ilişkili metabolitlerin çoğu, kanda gözlemlenenlerden belirgin şekilde daha düşüktür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6
Şekil 6: Normal interstisial sıvının metabolit seti zenginleştirme analizi (MSEA), metabolik aktivitenin ağırlıklı olarak enerji üretimi, redoks homeostazı ve amino asit dönüşümü ile ilgili yollar arasında dağıldığını ortaya koydu. En zenginleştirilmiş yollar arasında butanoat metabolizması, pürin metabolizması ve glutatyon metabolizması bulunur; bu da fizyolojik koşullarda mitokondriyal enerji arzının ve antioksidan kapasitesinin korunmasını yansıtır. Ayrıca, arginin ve prolin metabolizması, triptofan metabolizması ve sistein ile metionin metabolizması gibi birkaç amino asit ile ilişkili yol da temsil edilmektedir; bu da hücre dışı mikroçevrede aktif amino asit dönüşümü ve azot dengesi düzenlemesini gösterir. Bu bulgular, normal interstisiyal metabolomun biyoenerjetik süreçler, oksidatif savunma ve amino asit metabolizması arasında dinamik bir denge sağladığını, doku homeostazını ve mikro dolaşım stabilitesini desteklediğini göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: -80 °C sıcaklıkta depolanan mikrodiyalizat aliquotlarında laktat ve serotonin stabilitesi. Veri, ortalama ± SEM (n = zaman noktası başına 6 tekrar). 72 saat boyunca hiçbir analitte taban seviyesinden %>5 sapma olmadı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Kanda ve adventisyonel interstisiyel sıvı mikrodiyalizatında tespit edilen diferansiyel metabolitler. Buna metabolit adı, katlama değişimi (FC), öğrencinin t-testi P değeri ve VIP (OPLS-DA) dahildir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Üç ardışık perivasküler doku-sıvı örneğinde on beş rastgele seçilmiş metabolit için varyasyon katsayısı (CV). Tüm CV'ler %<20 oranında. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Interstisiel sıvı (ISF), her doku hücresini kaplayan ve ekstraselülük sıvıbölmesi 8,9'un yaklaşık %75'ini oluşturan sulu mikro-ortamdır. Plazmanın kapiller filtrasyonu ile üretilen ISF, kan içindeki hücresel ve yüksek protein içeriğinden yoksundur ancak elektrolitleri, küçük çözücüleri ve suyututar 9. Bu bileşim, ISF'yi damar ve hücresel dünyalar arasındaki temel arayüz olarak konumlandırır. Fonksiyonel olarak, ISF dinamik bir taşıma ortamıdır. Oksijen, glikoz, amino asitler ve mikrobesinleri kan dolaşımından hücrelere iletirken, aynı zamanda karbondioksit, üre ve diğer metabolik atıkları toplayıp dolaşıma geri döner. Sıvı aynı zamanda bir yağlayıcı ve tampon olarak da hizmet eder; interstisiel osmotik basıncı, pH ve iyonik dengeyistabilize eder 11. Metabolizmanın ötesinde, ISF bağışıklık gözetimini destekleyerek lökositleri, antikorları ve sitokinleri doku boşlukları aracılığıyla taşıyarak ve hormonlar ile parakrin sinyaller için bir iletişim yoluolarak işlev görür 12,13. Kan ile karşılaştırıldığında, ISF esasen hücresiz, düşük proteinli birfiltrat 14'tür. Damar ağacıyla sınırlı olan kan, kırmızı ve beyaz hücreler, trombositler ve yüksek konsantrasyonlarda albümin ile pıhtılaşma faktörleri içerir. Oksijen ve besin seviyeleri kan'da en yüksek, hücresel alım nedeniyle ISF'de giderek daha düşüktür; atık ürünler ise lenfatik veya venöz dönüşe girmeden önce ISF'de birikir. Normal ISF'de büyük protein ve hücrelerin olmaması onkotik basıncı en aza indirir ve hızlı difüzyon sağlar, ancak iltihap durumlar bu profili geçici olarakdeğiştirebilir 15.

Ancak, ISF'nin çalışması, basit, hızlı ve güvenilir seçme metodolojilerinin olmaması nedeniyle sınırlı kalır. Mevcut yöntemler arasında mikroiğne (MN) yamaları, emici kabarcıklar, ters iyotoforez, termal ablasyon ve mikrodiyaliz yer almaktadır. MN yamaları, ISF ekstraksiyonu için deri üzerinden mikrokanallar oluşturur; çekirdek kabuk varyantları ISF'yi 30 saniyenin altında, osmotik hidrojel MN'ler ise yaklaşık 3 dakikada çıkarır. Bunlar, yama analizi için sensörlerle birleştirilebilir, ancak hacim açısından sınırlıdır ve güç ile şişlik arasında bir denge gerektirir. Emizici kabarcıklar saf ISF sağlar ve minimal kan kontaminasyonu sağlar ancak invaziv, ağrılı veyavaştır 16,17,18. Ters iyotoforez (RI), düşük elektrik akımları kullanarak glikoz ve lityum iyonları gibi yüklü analitleri invaziv olmayan izleme için cilt yüzeyine taşır. Ancak, düşük veri verimliliği, bireyler arasında değişkenlik ve potansiyel cilt tahrişi gibi zorluklarlakarşı karşıya 19,20. Transdermal uygulama (TA), lokal ısıtma ile tabaka korneumunu bozarak ISF'nin pasif olarak hidrofilik mikrokanallara girmesine izin verir. Cihaz tasarımı daha basit olsa da, 5 μL'den az sıvı toplar; yanmaları önlemek için son derece hassas algılama ve dikkatli termal yönetimgerektirir 21,22. Buna karşılık, implante edilmiş yarı geçirgen problar arasında difüzyona dayanan mikrodiyaliz (MD), ayarlanabilir moleküler ağırlık kesme (MWCO) zarları sayesinde benzersiz moleküler seçicilik sunar; örneğin glikoz için 10 kDa, proteinler ve sitokinler için 100 kDa(23,24). Bu teknik, sürekli ve minimal invaziv numune almayı destekler. Ancak MD operasyonel olarak karmaşıktır, in vivo kalibrasyon gerektirir ve hidrofobik türler için değişken iyileşme oranları gösterir. Özellikle, MD büyük biyomoleküllerin boyut seçici izolasyonu yapabilen tektekniktir 25. Damar adventisisine bitişik olarak toplanan diyalizatın kan ile karşılaştırmalı çalışmaları, laktat ve serotonin profillerinin belirgin olduğunu göstererek MD yaklaşımının kararlılığını ve özgüllüğünü doğrulamaktadır.

Hayvan çalışmaları, kalp ve akciğerler tarafından sinerjik olarak düzenlenen ISF'nin büyük arterler, damarlar ve periferik sinirlerle ilişkili adventitislerdeakabileceğini göstermiştir 5,9. Genellikle ISF, doğrudan plazmadan türetilen ve dokularda yerel olarak sentezlenenmetabolitler içerir 26,27,28. Bu nedenle, AISF ve plazmadaki metabolitlerin belirlenen örtüşmeleri ve farklarının, ISF dolaşım sisteminin damar boyunca dokularda besinlerin ve metabolitlerin taşınması ve temizlenmesinde rol almasını temsil ettiği makul bir durumdur. AISF örneklemesi için burada tanıtılan mikrodiyaliz temelli teknik, vücut genelinde birden fazla organ ve dokuda metabolizmayı düzenlemede sistemik ISF dolaşımının çalışmalarını önemli ölçüde geliştirecektir.

Bu çalışmada kullanılan 20-kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) zarı, glikoz, laktat, piruvat ve amino asitler dahil olmak üzere küçük metabolitlerin nicel geri kazanımı için en uygun şekilde tasarlanmıştır. Ancak, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı enzimler gibi biyolojik açıdan önemli birçok makromolekülü tutarlı olarak az örnekler alır veya tamamen dışlar. Klinik ve metodolojik incelemeler, standart 20-kDa kateterlerin küçük hidrofilik metabolitleri toplamada etkili olduğunu, ancak proteinler ve iltihap aracılar için zayıf iyileşme oranlarıgösterdiklerini ortaya koymuştur 29. Sonuç olarak, daha yüksek MWCO'ya sahip zarlar (örneğin, 100 kDa) veya alternatif örnekleme stratejileri doğru sitokin nicelenmesiiçin gereklidir 30,31. Bu nedenle, grubumuz tarafından yürütülen gelecekteki araştırmalar, periferik interstisyel sıvının makromoleküler bileşimini karakterize etmek için daha büyük MWCO'lara sahip membranlar kullanacaktır. Bu çalışmada diyalizatlar genel anestezi altında toplanmıştır. Mikrodiyaliz daha önce uyanık, serbest hareket eden hayvanlarda doğrulanmış ve bilinçli modellerde kullanılmak üzere birkaç "açık akış" mikro-perfüzyon tekniğiuyarlanmıştır 32. Ancak, prob tasarımı ve implantasyon protokolümüzü uyanık hayvanlarda kullanıma uyarlamak, tethering, hayvan stresi, prob stabilitesi, hareket artefaktları ve uzun vadeli açıklık gibi zorlukların ele alınmasını gerektirecektir. Şu anda hafif bir tether-swivel sistemi geliştirme sürecindeyiz ve sonraki çalışmamızda bilinçli numune almayı planlıyoruz.

Açıklamalar

Açıklanacak finansal çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (2025YFC3507601) ve Merkezi Kamu Refahı Araştırma Enstitüleri için Temel Araştırma Fonları (No. ZZ-YC2023007).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
EKG izleme sistemiAD Instruments, AvustralyaPowerLabEkipman
ForsepsF.S.T (Güzel Bilimler Araçları) Almanya11252-00Cerrahi aletler
Heparin sodyumSigma-Aldrich, ABD9041-08-1Materyal
Yüksek performanslı sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS)SCIEX, ABDExionLC-20ACEkipman
IRIS standart makasF.S.T (Güzel Bilimler Araçları) Almanya14060-09Cerrahi aletler
İzofluranRWD Yaşam Bilimleri, PRCR510-22-10Materyal
Düşük Akışlı Anestezi SistemiKent Scientific, ABDSomnoSuiteEkipman
Mikrodiyaliz Perfüzyon Sıvısı T1CMA Mikrodiyaliz, İsveçP000034Materyal
Mikrodiyaliz probu, 20 EliteCMA Mikrodiyaliz, İsveç8010436Materyal
Mikrodiyaliz Şırıngaları 1 mL Gaz GeçirmezCMA Mikrodiyaliz, İsveç8309020Materyal
Soğutmalı Fraksiyon ToplayıcıCMA Mikrodiyaliz, İsveç470Ekipman
CMA 20 Probları için Bölünmüş BoruCMA Mikrodiyaliz, İsveç8309019Materyal
Stereoskopik mikroskopOlimpos, JaponyaSZ61Ekipman
Şırın PompasıCMA MD AB, İSVEÇ800310Ekipman

Kaynaklar

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Adventisyal ISFSıçan Femoral ArterMetabolik ProfillemeTemel Bileşen AnaliziDüşük Molekül Ağırlıklı MetabolitlerBiyobelirteç KeşfiVasküler Patofizyoloji
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.