Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Bitkisel bir lavman formülü, enterik glial aktivasyonu S100β/RAGE/NF-κB yolu aracılığıyla inhibe ederek ülseratif koliti hafifleter

563 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

28 Kasım 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Sanguisorba officinalis, Bletilla striata ve Acacia catechu'nu birleştiren bitkisel bir lavman formülü, LC-MS/MS profilleme, S100β kenetleme, DSS kolit modeli ve LPS/IFN-γ ile aktive edilmiş enterik glia kullanılarak değerlendirildi. Formül S100β'yi etkiledi, glial aktivasyonu bastırdı ve p-NF-κB/iNOS ekspresyonunu azalttı; bu da S100β-RAGE-NF-κB ekseni üzerinden iyileşmeyi gösterdi.

Özet

Enterik glial hücrelerin (EGC) aktivasyonu, ülseratif kolitin (UC) patogenezine katkıda bulunur. Bu çalışma, Sanguisorba officinalis, Bletilla striata ve Acacia catechu kombinasyonunu içeren bitkisel bir lavmanın Dibai Lavman Sıvısı (DBE)'nin EGC kaynaklı iltihabı modüle edip etmediğini inceledi. DBE bileşenlerinin ve önceliklendirilmiş bileşiklerin LC-MS/MS profilleri S100β'ye eklendi. Vücut ağırlığı, kolon uzunluğu, histopatoloji ve sitokin seviyeleri (ELISA) kullanılarak dekstran sülfat sodyum (DSS) kaynaklı sare kolitinde etkililik değerlendirildi. Glial aktivasyon belirteçleri immünohistokimya, immünfloresans kololokalizasyonu, nicel PCR (qPCR) ve immünoblotlama ile ölçüldü. In vitro modelde, lipopolisakkarit ve interferon-γ ile aktive edilmiş CRL-2690 enterik glia kullanıldı ve müdahale DBE içeren fare serumu (%15) kullanıldı. Kesişme, birkaç DBE bileşeninin S100β'ye güçlü bir şekilde öngörülen bağlanmasını önerdi. DSS, glial hiperaktivasyonla uyumlu olarak hem mRNA hem de protein seviyelerinde TNF-α ve IL-1β seviyelerini artırdı, dar bağlantıları bozdu ve S100β/GFAP'yi yükseltti; DBE bu değişiklikleri önemli ölçüde geri aldı. In vitro DBE, S100β, RAGE, iNOS (NOS2) ve fosforile NF-κB p65'i indirgedi. Topluca, DBE EGC aktivasyonunu engelleyerek ve S100β/RAGE/NF-κB/iNOS eksenini aşağı düzenleyerek mukoza bütünlüğünü koruyarak UC'yi hafifletmiş gibi görünmektedir.

Giriş

Ülseratif kolit (KK), kolonun kronik mukozal iltihabı ile karakterize edilen inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) başlıca bir alt tipidir; 1990'dan bu yana küresel yük artmaktadır ve IBD vakalarının önemli bir kısmını UColuşturur 1,2. Tipik belirtiler arasında karın ağrısı ve kanlı ishal bulunur; bu da ciddi fiziksel ve psikolojik sıkıntı ile önemli tedavimaliyetlerine yol açar 3. Tedavi seçenekleri genişlemiş olsa da, sistemik bağışıklığı baskılayan immünomodülatörlere ve biyolojik ilaçlara uzun süreli maruz kalma, lenfoma ve fırsatçı enfeksiyon risklerinin artmasıyla ilişkilidir ve hastaların bir kısmı dirençli veya intolerans olarakkalır. UC, mukozal immün homeostazının bozulmasının patofizyolojinin merkezinde olduğu bağışıklık aracılı bir durum olarak yaygın olarakkabul edilir 5. Ancak, biriken kanıtlar, sadece mukozal bağışıklık mekanizmalarının IBD'nin tüm özelliklerini açıklamak için yeterli olmadığını göstermektedir; enterik sinir sistemi (ENS), bağırsak iltihabına katkıda bulunur ve hastalık kavramınıIBD 6 içindeki nöroinflamasyona genişletir.

Yetişkin memelilerde enterik nöronlardan fazla olan enterik glial hücreler (EGC) artık bağırsak homeostazı ve iltihabın temeldüzenleyicileri olarak kabul edilmektedir 7,8. EGC'ler, GDNF, TGF-β1, S100β ve 15d-PGJ2 gibi aracıları serbest bırakarak epitel bariyer fonksiyonunu modüle eder; böylece geçirgenlik ve mukozalbütünlüğü etkiler 9. Bu arabulucular arasında, S100β, RAGE/NF-κB yolu da dahil olmak üzere aşağı akış zincirlerini aktive edebilir ve bariyer hasarına ve inflamatuar amplifikasyonayol açar 10,11. EGC'ler ayrıca makrofaj fenotipini ve visseral hassasiyeti connexin-43 ve M-CSF aracılığıyla düzenleyerek ve in vitro T hücrelerine baskılayıcı etkiler uygulayarak bağışıklık yanıtlarını şekillendirir; bu da EGC aktivasyonunu UC 12,13'te yönetilebilir bir tedavi hedefi olarak vurgular.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM) UC'de giderek daha fazla araştırılmakta ve klinik ile deneysel ortamlarda umut verici faydalargöstermiştir 14,15. Sanguisorba officinalis (Diyu) ve Bletilla striata (Baiji) ile Acacia catechu (Ercha) arasındaki klasik eşleşme, materia medica kaynaklarında uzun süredir dizenterik bozukluklar için belgelenmiş olup, hemostatik, analjezik ve yara iyileşme endikasyonları için Çin Farmakopei'sinde listelenmiştir. Çağdaş çalışmalar, bu botanikler için antibakteriyel, anti-inflamatuar, antioksidatif ve anti-ülser etkileri bildirirken, A. catechu da kateketin önde gelen bir bileşen olarak nöroprotektif özellikler gösterir16,17. Geleneksel sistemik immünosupresyona kıyasla, EGC merkezli nöroimmün yolları dahil eden bir formülasyon, belirgin bir mekanizma ile tamamlayıcı etkinlik sunabilir ve potansiyel olarak daha az sistemik bağışıklık kaynaklıriskler sağlayabilir 18,19.

Bu çalışma, Diyu, Baiji ve Ercha (DBE) kombinasyonunun KB'yi hafifledip azaltıp azaltmadığını, EGC aktivasyonunu baskılayıp azaltmadığını değerlendirmektedir. Entegre bir yaklaşım kullanılır: bileşenleri önceliklendirmek için hedefsiz LC-MS/MS profili, S100β'ye karşı moleküler kenetleme, dekstran sülfat sodyumla indüklenen kolit modelinde doğrulama ve EGC'lerde mekanik testler. Çalışma, önceki UC tedavilerinde incelenen nöroimmün mekanizma - S100β/RAGE/NF-κB/iNOS olmadan vurgulanmakta ve doz seçimi, formülasyon optimizasyonu ve sonraki translasyonel çalışmalar için pratik sonuçları ortaya koymaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Pekin Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi [BUCM-2023-0912] tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Hiçbir insan denek dahil değildi.
Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Reaktifler ve malzemeler

Analitik derecede çözücüler ve moleküler biyoloji kalitesinde reaktifler kullanıldı. Üreticiler, katalog numaraları ve yazılım lisans detayları dahil olmak üzere tüm ticari bilgiler, Materyaller Tablosu'nda (xlsx) sağlanmıştır. Tüm hazırlıklar için su deiyonize edilip filtreleniyordu. Tüm tamponlar taze hazırlanmış veya aşağıda belirtilen koşullar altında depolanmıştır.

2. Ekipman ve yazılım kurulumu

Bir UPLC-MS/MS sistemi ve bir quadrupol uçuş zamanı kütle spektrometresine bağlı; sallanan kovalı rotorlu soğutmalı santrifüj; 37 °C, %5 CO₂ ve %≥95 göreli nemde tutulan CO₂ kuluçka makinesi; bir mikroplaka okuyucu (450 nm); gerçek zamanlı PCR termosikleti; elektroforez ve blotlama cihazı; ve sabit uyarılma/emisyon filtreleriyle bir floresan mikroskobu kullanıldı. Cihaz kontrolü ve veri analizi, kromatografik ve kütle spektrometrik veriler için MassLynx v4.2 ile kenetlenme için AutoDockTools 1.5.7 ile AutoDock 4.2 ile gerçekleştirilmiştir. Görüntü analizi ImageJ/Fiji v1.53 sürümünde gerçekleştirildi.

3. Dibai Lavman Sıvısının (DBE) Hazırlanması

Diyu (50 g), Baiji (50 g) ve Ercha (20 g) içeren bitkisel karışım, kaba ezildi ve tam hidrasyon sağlamak için oda sıcaklığında 1.200 mL deionize suda 30 dakika bekletildi. Bekletilmiş karışım, yapışmayı önlemek için ara sıra karıştırarak 30 dakika boyunca yoğun bir kaynatma altında dekokote edildi. Sıcak karışım, steril çok katmanlı tıbbi gazlı bezden steril cam eşyalara süzülerek çözünmeyen malzeme çıkarıldı. Filtrat, 45 °C'yi aşmayan bir su banyosunda vakumla konsantrasyonla konsantre edildi ve nihai stok konsantrasyonu 1.98 g/mL (yüksek dozlu stok) elde edilene kadar. 0,99 g/mL ve 0,50 g/mL ile orta ve düşük dozlu çalışan çözeltiler, steril deionize su ile seyreltilerek her biri 100 mL nihai hacimlere hazırlandı. Her çözelti steril koşullarda 0,22 μm bir membrandan geçirilir, etiketli steril kaplara dağıtılır ve 4 °C'de yedi güne kadar saklanır. Kullanımdan önce çözeltiler nazikçe karıştırılırdı; kabul edilebilir bir görünüm, belirgin veya hafifçe opalecent ile görünür partiküller olmadan devam ediyordu.

4. UPLC - DBE'NIN MS/MS analizi

Her tıbbi bileşenden alınan toz, 50 mg olarak doğru şekilde tartıldı ve 1.0 mL %80 (v/v) metanol ile ultrasonik ajitasyonla ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca ekstraksiyon yapıldı. Özetler sonikasyondan sonra oda sıcaklığına geri getirildi, 15.000 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve süpernatantlar 0,22 μm membranlardan otomatik numune alan şişelere süzüldü. Kromatografik ayrım, 35 °C'de tutulan ters faz kolonunda (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; kutup ucu C18 tipi) gerçekleştirildi; sütun, marka/model ve katalog numarası Materyaller Tablosu'nda verilmiştir. Mobil faz A: suda %0,1 formik asit; mobil B faz Asetonitril. Akış hızı: 0,30 mL/da; enjeksiyon hacmi: 10 μL. Gradient: 0-2 dakika boyunca %5 B; 2→20 dakika arasında %595 B; 20-23 dakika boyunca %95 B; %95→5 B 23,0-23,1 dakika arası; %5 B'de 26 dakikaya kadar yeniden dengelenin (tam gradyan tablosu Tablo 1'de verilmiştir).

Kütle spektrometrisi, pozitif/negatif anahtarlama ile elektrosprey iyonizasyon ve düşük ve yüksek enerjili (MSE) taramalarla veri bağımsız alımı kullandı. Kütle aralığı: k/z-100-1.500; kapiler gerilim: 2.0 kV; örnekleme konisi: 20 V; kaynak sıcaklığı: 120 °C; çözülme sıcaklığı: 360 °C; Koni gazı: 50 L/s; çözünme gazı: 600 L/s. Yüksek enerji fonksiyonu, 20-50 eV basamaklı çarpışma enerjisi kullanır. Veriler, kilit-kütle düzeltmesi ve standart zirve tespit parametreleriyle MassLynx v4.2'de işlendi. Tanımlanan 105 bileşenin (moleküler formüller, gözlemlenen m/z, tutma süreleri ve güven puanları) kapsamlı bir listesi Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

5. Moleküler kenetleme

Kenetlenme, indüklenmiş uyum protokolü altında AutoDock 4.2'de gerçekleştirildi. S100β'nin (PDB 3HCM) üç boyutlu yapısı, kristalografik su moleküllerinin çıkarılması, polar hidrojenlerin eklenmesi ve Kollman yüklerinin atanmasıyla hazırlandı. Karakteristik DBE bileşenlerini temsil eden ligand yapıları inşa edildi, fizyolojik pH'da protonlandı ve enerji en aza indirildi. Bağlanma bölgesi, native-ligand koordinatlarıyla tanımlandı; Doğal ligandın 6 şiçindeki amino-asit kalıntıları kenetlenme sırasında esnek olarak ele alındı. Grid kutuları tüm cebi kaplarken 0.375 şızgara aralığı ile kaplardı. Lamarkın genetik algoritması parametreleri şunlardı: popülasyon büyüklüğü 150; 2,5 × 10⁶ enerji değerlendirmesine kadar; Ligand başına 100 bağımsız koşu. Son pozlar tahmin edilen bağlanma serbest enerjisine göre sıralanmış ve RMSD ile kümelenmiştir; etkileşim desenleri (hidrojen bağları, hidrofobik temaslar, π-π etkileşimleri) bilinen S100β kompleksleriyle tutarlılık açısından görselleştirildi.

6. DSS kaynaklı kolit ve DBE tedavisinin hayvan modeli

Erkek C57BL/6J fareleri (8 haftalık, 20-22 g) en az 7 gün boyunca 22 ± 2 °C sıcaklıkta, %50-60 göreli nem, 12 saat ışık-karanlık döngü, yemek ve su ile libitum ile uyum sağladılar. Hayvanlar rastgele altı gruba (n = 10/grup) ayrıldı: kontrol, dekstran sülfat sodyum (DSS) modeli, sülfasalazin (SASP) pozitif kontrol ve düşük, orta ve yüksek dozlu DBE tedavileri. Histolojik puanlama ve görüntü niceliğinden sorumlu personel, grup tahsisine kör tutuldu.

Deneysel kolit, içme suyunda 7 gün boyunca %2,0 (w/v) DSS ile indüklendi, ardından 3 gün boyunca %1,0 DSS ve ötenazi öncesinde 4 gün normal su ile indüklendi. DBE, günde bir kez 10 mL/kg oranında enema ile rektuma 2,5 cm derinlikte yerleştirilen esnek kateter kullanılarak uygulandı; Hayvanlar dikey olarak 30 dakika boyunca tutuldu, bu da sızıntıyı en aza indirmek için yapıldı. Günlük DBE dozları sırasıyla 12,35, 27,4 ve 49,4 g/kg/gün olarak düşük, orta ve yüksek gruplar için idi; SASP, pozitif kontrol olarak günde 0,5 g/kg'da uygulandı. Vücut ağırlığı, dışkı kıvamı ve dışkı örtülü kan günlük olarak kaydedilip, hastalık aktivite indeksi hesaplandı. Son noktada, fareler 50 mg/kg i.p. pentobarbital sodyum ile anestezi edildi; kan, heparinizlenmiş kapilyarlar kullanılarak retro-orbital sinüslerden toplandı; Hayvanlar servikal dislokasyon ile ötenazi edildi. Kolon, ileosekal birleşimden rektuma doğru ayrılmış, nazikçe uzatılmış ve uzunluk minimum gerginlikle ölçülmüştür. Temsilci segmentler %4 paraformaldehit ile sabitlendi; kalan doku sıvı azotta dondurularak −80 °C'de depolandı.

7. İlaç içeren serumun hazırlanması

Erkek Sprague-Dawley fareleri kontrol ve DBE gruplarına (n = 6/grup) ayrılarak rastgele ayrıldı. DBE grubu, 7 gün boyunca günde bir kez oral garajla günde 12,34 g/kg aldı; kontroller eşit hacimde saflaştırılmış su aldı. Son dozdan yirmi dört saat sonra hayvanlar anestezi edildi ve karın aortasından tam kan alındı. Serum, oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmadan sonra ayrıldı, ardından 1.500 × g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Serumlar, 30 dakika boyunca 56 °C'de ısıyla inaktive edildi ve depolamadan önce steril koşullarda 0,22 μm membranlardan filtrelendi. Serum steril tüplere allikotlanarak −80 °C'de saklanırdı. 414 nm civarında yüksek emilimle tanımlanan hemolize edilmiş örnekler hariç tutuldu.

8. Histolojik muayene (H&E)

24 saat boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlenen kolon dokusu, derecelendirilmiş etanollerle kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve parafine gömülmüştür. 5 μm'lik bölümler kesildi, deparafinize edildi, yeniden nemlendirildi ve 5 dakika boyunca hematoksilinle boyandı, akan suda 5 dakika mavi boyandı, 2 dakika boyunca eosin ile karşı boyandı. Slaytlar reçine ile monte edildi ve kript mimarisi, kadah hücre yoğunluğu, epitel sürekliliği ve infiltrasyon açısından incelendi. Temsilci değişiklikler oklar/ok uçlarıyla belirtilecek ve figür kısalarında tanımlanacaktır; Ölçek çubukları (örneğin, 200 μm) ve önceden tanımlanmış görsel eşikler efsanelerde belirtilecektir.

9. İmmünohistokimya (IHC)

Parafin kesitleri, sitrat tamponunda (pH 6.0) 95-98 °C'de 15-20 dakika boyunca antijen alındı, endojen peroksidazın %3 hidrojen peroksitle 10 dakika söndürüldü ve oda sıcaklığında %5 normal serumla 1 saat bloke edildi. Birincil antikorlar gece boyunca 4 °C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir odada kuluçka edildi. Yıkamadan sonra, bölümler 2 dakika boyunca DAB ile geliştirilen streptavidin-peroksidaz tespit sistemi kullanılarak (mikroskobik izleme) işlendi, hematoksilin ile karşı boyandı, kurutuldu ve monte edildi. Her partide birincil antikoru olmayan negatif kontroller dahil edildi.

10. İmmünoflüoresans (IF) analizi

Parafinli gömülü bölümler deparafinize edilip EDTA tamponunda (pH 8.0) antijen alımına tabi tutuldu. Soğuduktan sonra, oda sıcaklığında %3 sığır serum albümini ile spesifik olmayan bağlanma bloklandı. Kesitler, GFAP (1:500) ve S100β (1:200) ile primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca kuluçka edildi, ardından floroforla konjuge edilmiş ikincil antikorlar (1:500) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kullanıldı. Çekirdekler DAPI ile karşı boyama yapıldı ve slaytlar anti-fade ortamına monte edildi. Görüntüler aynı hedeflerle, sabit 100 ms pozlama süresi ve gruplar arasında 1.0 dedektör kazancı kullanılarak çekildi. Ortalama floresans yoğunluğu, piksel boyutu, arka plan çıkarma (yuvarlanan top yarıçapı 50 piksel) ve DAPI-pozitif alana normalizasyonun kalibrasyonu sonrası ImageJ/Fiji v1.53'te nicelendirildi. Her grup için en az beş biyolojik replikasyon ve her çoğaltma başına üç örtüşmeyen alan analiz edildi.

11. Hücre kültürü ve tedaviler

Fare enterik glial hücreleri (CRL-2690 sınıfı), %10 fetal sığır serumu ve %1 penisillin-streptomisin takviyesi ile 37 °C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO₂ içeren bir kuluçka makinesinde DMEM'de kültürlendi. Hücre kimliği kısa tandem tekrar profilleme ile doğrulandı ve kültürler mikoplazmadan arındı. 5-15. pasajlarda deneyler yapıldı. Hücreler, 2.0 × 10⁵ hücre/kuyu aralığında 6 kuyu plakalarına ekildi ve 2.0 mL/kuyu ortamında 24 saat tutunmasına izin verildi. Deneysel gruplar şunlardı: tedavi edilmemiş kontrol, araç kontrolü, model, DBE-serum ve inhibitör.

Model indüksiyonu için, hücreler tam ortamda 24 saat boyunca lipopolisakkarit (LPS, 1 μg/mL) ve IFN-γ (20 ng/mL) ile maruz bırakıldı; IFN-γ için karşılık gelen U/mL değeri, partiye özgü potensiyete göre Malzeme Tablosu'nda bildirilir. DBE-serum tedavisinde, hücreler %15 (v/v) ısı-inaktive edilmiş (56 °C, 30 dakika), 0,22 μm filtreli DBE içeren fare serumu tam ortamda 24 saat boyunca aldı (doz aralığı 5%-20% CCK-8 bölümünde belirtildiği gibi canlılık optimizasyonunda kullanılmıştır). İnhibörü tedavisinde, seçici S100β inhibitörü SBI-4211 (10-50 μM; anahtar okumalar için 45 μM) 24 saat uygulandı. Araç kontrolleri, aynı ortamla (%0,1 DMSO (v/v)) çözücü içeriğini eşleştirmiştir. Aksi belirtilmedikçe, tedaviler önceden ısıtılmış (37 °C) ortamda hazırlanmış ve hücreler tedavi değişiminden önce PBS ile 2× durulandırılmıştır. Tedaviden sonra, sonraki bölümlerde detaylandırıldığı gibi RNA ekstraksiyonu, protein analizi ve immünoflüoresans için hücreler toplanmıştır. Biyolojik çoğaltma her durum başına n ≥ 5 bağımsız kültürdü.

12. CCK-8 hücre canlılık testi

Hücreler, 100 μL ortamda 5 × 10³ hücre/kuyu aralığında 96 delikli plakalara tohumlanarak gece boyunca yapışmasına izin verildi. Ortam, 24 saat boyunca 5%, 10%, %15 veya %20 (v/v) oranlarında DBE ile işlenmiş serum içeren ortam ile değiştirildi. CCK-8 reaktifi (10 μL/well) eklendi ve plakalar 37 °C'de 1 saat kuluçka edildi. Soğurma 450 nm'de boş çıkarma ile okundu (medium + reaktif, hücresiz). Kullanılabilirlik, araç kontrolünün %'si olarak ifade edildi. Her koşulda n ≥ 5 biyolojik replikat (bağımsız kültür) ve her kültür başına üç teknik kopya kullanıldı.

13. Doku sitokinleri için ELISA

Kolon dokusu, proteaz inhibitörleri içeren PBS (1:9, w/v) ile buz üzerinde homojenleştirildi. Homojenatlar 10 dakika boyunca 4 °C'de 12.000 × g ile aydınlaştırıldı; süpernatantlar, kit protokollerine göre IL-1β ve TNF-α için analiz edildi. Standartlar ve örnekler ikili olarak çalıştırıldı ve eğriler R² ≥ 0.99 ile dört parametreli lojistik (4PL) modelle donatıldı; geriye dönük hesaplanan standartlar nominal oranın %85-%115'i arasında kabul edildi. Soğurma 450 nm'de okunur, mevcut olduğunda 620-650 nm referans olurdu. Sitokin konsantrasyonları doku ağırlığına (pg/mg doku) normalleştirildi. Her grupta n ≥ 5 biyolojik replikat bulunuyordu.

14. Nicel Gerçek Zamanlı PCR (qPCR)

Kolon dokusundan (veya uygun hücrelerden) alınan toplam RNA, silika membranlı spin-kolon kiti ile izole edildi. RNA bütünlüğü A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 ve agarose-jel incelemesi ile doğrulandı. Birinci zincirli cDNA, genomik DNA çıkarılması ile 1 μg RNA'dan sentezlendi. qPCR, programla kalibre edilmiş bir termosikl üzerinde SYBR Green master karışımı kullandı: 95 °C 30 saniye; 40 döngü 95 °C 5 saniye, 60 °C 30 saniye; erime eğrisi 65-95 °C aralığında 0,5 °C/5 s adımlarda gerçekleşir. GAPDH, endogen kontrol olarak hizmet verdi. Göreli ifade, primer verimliliği doğrulandıktan sonra 2⁻ΔΔCt ile hesaplandı (%90-110, standart eğri eğimlerinden). No-RT ve şablonsuz kontroller de dahil edildi. Primer dizileri Tablo 2'de listelenmiştir. Her grupta ≥ 5 biyolojik kopya ve her örnek başına iki teknik tekrar vardı.

15. Western Blot analizi

Kolon dokusundan (veya hücrelerden) alınan proteinler, proteaz/fosfataz inhibitörleriyle RIPA tamponunda çıkarıldı ve BCA testi ile nicelendirildi. Eşit protein (30 μg/şerit) denatüre edildi, %4-20 gradyan SDS-PAGE'de çözüldü ve PVDF'ye (0,45 μm; 0,2 μm, ≤ 20 kDa hedefi için) aktarıldı. Zarlar, %5 yağsız sütte oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloklandı ve 4 °C'de gece boyunca GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), phospho-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Occludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) ve GAPDH (1:5.000) ile birlikte inkübe edildi. HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar (1:5.000) oda sıcaklığında 1 saat uygulandı. Sinyaller ECL ile geliştirildi; Pozlama süreleri doğrusal dinamik aralıkla (10-90 s) sınırlıydı. Transferler, bloklamadan önce geri dönebilir membran boyama ile doğrulandı. Bant yoğunlukları, arka plan çıkarma sonrası ImageJ/Fiji v1.53'te nicelendirildi ve GAPDH'ye normalleştirildi. Beklenen moleküler ağırlıklar: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Her analizde n ≥ 5 biyolojik replikat yer aldı.

16. İstatistiksel analiz

Veriler GraphPad Prism 8.0 ile analiz edildi ve ortalama ± SEM olarak sunuldu. Çoklu grup karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin sonradan yaptığı test kullanıldı; çift karşılaştırmalar için, uygun olduğunda eşleşmemiş iki kuyruklu Öğrenci T-testleri uygulandı. Zaman akışı veya iki faktörlü tasarımlar için (örneğin, tedavi × doz veya × zaman) iki yönlü ANOVA (uygulandığında tekrarlanan ölçümler) ve şekil açıklamalarında belirtildiği şekilde Tukey veya Dunnett'in düzeltmesi kullanıldı. Shapiro-Wilk ve Levene'nin testleri, parametrik testlerden önce normallik ve homoskedastisiteyi incelemek için kullanıldı; varsayımlar ihlal edildiğinde, veriler log-dönüştürüldü veya uygun parametrik olmayan testlerle analiz edildi (Kruskal-Wallis ve Dunn'un post hoc; Mann-Whitney U çift olarak). Kesin p-değerleri ve etki boyutu ölçümleri (ANOVA için η², t-testler için Cohen'in d'si) uygun olduğunda şekil efsanelerinde bildirilir. İki taraflı p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Şekil kısaları önem için aşağıdaki gösterimi kullanır: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Kontrol; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS; NS, önemli değil.

17. Beklenen sonuçlar ve kalite kontrolü

DSS'nin kolon uzunluğunu kısaltması, hastalık aktivite indeksini yükseltmesi ve histolojik hasara (kriptal mimari bozulması, kadeh hücresi tükenmesi, epitel erozyonu) neden olması beklenmektedir. DBE tedavisi, bu indeksleri doza bağımlı olarak iyileştirmeli ve enterik-glial aktivasyon belirteçlerini azaltmalıdır. Western blot'larda yukarıda listelenen moleküler ağırlıklarda bantlar gösterilmeli, DSS'de sinyaller artmalı ve DBE veya SBI-4211 ile zayıflama olmalı; pozlamalar doğrusal dinamik aralık içinde kalmalıdır. GFAP ve S100β için immünoflüoresans, DBE tedavisinden sonra DSS'de ortalama yoğunlukların yükseldiğini ve azalma göstermelidir. LC-MS/MS kromatografileri, referans iyonları için stabil tutma süreleri (sürüklenme ≤ 0,2 dakika) ve kütle doğruluğu ± 5 ppm içinde göstermelidir; ana bileşenler için karakteristik parça iyonları ile birlikte bulunur. Negatif kontroller (örneğin, birincil antikorların atılması) spesifik bir sinyal vermemelidir. Görüntüleme edinim parametreleri (nesnel, maruziyet, kazanç, gamma) geçerli nicel karşılaştırmalar mümkün kılabilmek için gruplar arasında sabit kalmalıdır.

18. Sorun giderme notları

DBE çözeltilerindeki bulanıklık veya partiküller, yetersiz filtreleme veya çöktü olduğunu gösterir; 0.22 μm filtreleme tekrarlanarak pH 6.5-7.5 doğrulan. DSS maruziyeti sırasında aşırı ölüm veya şiddetli kilo kaybı aşırı indüksiyonu gösterir; DSS konsantrasyonunu azaltmak, parti moleküler ağırlığını doğrulamak ve DSS çözeltiklerini günlük olarak değiştirmek. Tutarsız immünoflüoresans nicelenmesi genellikle değişken maruziyeti yansıtır; pozlama süresi ve kazancı düzeltin ve toplu kalibrasyon için referans slayt ekleyin. Zayıf western blot bantları, yetersiz yükleme veya transfer verimsizliğini yansıtabilir; Protein miktarını doğrulayın, uygun jel yüzdesi veya gradyanı seçin ve geri dönebilir membran boyama ile transferi onaylayın. Kötü ELISA uyumu (R² < 0.99 veya %85-115 dışındaki standart geri hesaplama, standart eğrinin tekrarlanmasını ve seyreltilmiş örneklerin yeniden değerlendirilmesini gerektirir. QPCR, primer verimliliği %90-110 civarında olan çalışmalar için, analizden önce tavlama sıcaklığını veya primer konsantrasyonunu yeniden optimize edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DBE bileşenlerinin ve ilaç içeren serumun tanımlanması

LC-MS/MS DBE'DE 105 BENZERSIZ KIMYASAL BILEŞEN TESPIT ETTI VE KÜTLE HATASı 10 PPM < OLDU. Tanımlama, moleküler formül, izotop deseni ve parça eşleştirme ile doğrulandı. Başlıca sınıflar arasında triterpenler, flavonoidler, bifenantrenler ve organik asitler yer alıyordu. İlaç içeren serum, boş çıkarma sonrası 59 DBE kaynaklı bileşen ortaya çıkardı. Temsilc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Ülseratif kolit (UC), çok faktörlü patogenezi olan kronik bir inflamatuar bağırsak hastalığıdır. Düzensiz bağışıklık yanıtlarının yanı sıra, bağırsak epitel bariyer disfonksiyonu ve bağırsak mikrobiyotası disbiyozu iyi bilinen katkıcılardır; enterik sinir sisteminin (ENS) anormallikleri ise giderek UC ilerlemesinde önemli bir itici güçolarak tanımlanmaktadır 23. Özellikle, ENS'nin hem yapısal hem de fonksiyonel düzensizlikleri mukozal iltihabı ve hastalık şiddetin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Çin Tıbbı İdaresi'nin Yüksek Düzey Kilit Tıbbi Disiplinleri İnşaat Projesi (ZYYSZX-2023256) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AutoDock 4.2Moleküler kenetlenme yazılımı-Scripps Araştırma Enstitüsü
Dekstran Sülfat Sodyum (DSS)Farelerde kolit indükleyen kimyasal9011-18-1Sigma-Aldrich
Dibai Lavman Sıvısı (DBE)Ülseratif kolit tedavisi için bitkisel karışım-Pekin Çin Tıp Üniversitesi
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)Hücre kültürü ortamı11965-092Thermo Fisher
Fetal Sığır Serumu (FBS)Hücre kültürü için takviye16000-044Thermo Fisher
Floresans Mikroskobuİmmünoflüoresans görüntüleme aleti-Olympus
LC-MS/MS SistemiLC-MS analizi için kütle spektrometresi-Waters Corporation
Lipopolisakkarit (LPS)Hücre kültüründe iltihaplanma indükörüL2630Sigma-Aldrich
PCR Termal DöngücüqPCR için ekipmanT100Bio-Rad
Birincil Antikor (S100)S100 protein tespiti için antikorABC1234Abcam
Protein Analiz Kiti (BCA)Protein nicelik kiti23225Thermo Fisher
Rekombinant İnterfon- (IFN)Hücre kültüründe EGC aktivasyonu için sitokin-Sigma-Aldrich
İkincil Antikor (HRP ile konjuge)İmmünohistokimya için ikincil antikorXYZ5678Thermo Fisher
Sülkürazalazin (SASP)Ülseratif kolit için pozitif kontrol-Sigma-Aldrich
Western Blot EkipmanıProtein analizi için elektroforez sistemi-Bio-Rad

Kaynaklar

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Enterik Glial H crelerS100 YolaRAGE Sinyal iletimiNF B AktivasyonuDSS Kolit Modelimm nohistokimyaSitokin SeviyeleriS k Ba lar

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.