Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Akut Solunum Sıkıntısı Sendromu'nda Dachengqi Karışımının Moleküler Mekanizmaları: Bir Ağ Farmakolojisi ve Biyoinformatik Analiz

228 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69651

⸱

27 Mart 2026

 , 
1Department of Emergency Medicine, The Fourth Affiliated Hospital of Soochow University

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, ağ farmakolojisi, biyoinformatik ve moleküler kenetlenme kullanarak Dachengqi Decoction (DCQD) ile akut solunum sıkıntısı sendromuna (ARDS) karşı moleküler mekanizmalarını açıklamaktadır. Ana hedefler ve yollar belirlendi. Moleküler kenetlenme, güçlü ligand-hedef etkileşimlerini doğruladı ve DCQD'nin ARDS için çok hedefli terapötik potansiyelini destekledi.

Özet

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), sepsisin hayatı tehdit eden bir komplikasyonudur ve dirençli hipoksemi ile akciğer iltihabı ile karakterize edilir. Şu anda etkili farmakolojik müdahaleler sınırlı kalmaktadır. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), Dachengqi Karışımı (DCQD) ile örneklenen, karmaşık inflamatuar yanıtları modüle etmede terapötik potansiyel göstermiştir. ARDS tedavisinde DCQD'nin mekanizmasını araştırmak için, DCQD'nin aktif bileşenleri ve ilgili hedefleri önce kamu veritabanlarından alındı. ARDS ile ilgili hedefler, kamuya açık veri setlerinin biyoinformatik analiziyle belirlendi. İlaç spesifik hedefleri hastalıkla ilişkili hedeflerle kesiştirerek, protein-protein etkileşimi (PPI) analizi ve fonksiyonel zenginleştirme kullanılarak DCQD-ARDS etkileşim ağı oluşturuldu. Kapsamlı analiz, ARDS'de DCQD'nin terapötik etkinliği için kritik olan 32 örtüşen genin ortaya çıktığını ortaya koydu. Zenginleştirme analizi, kemokin sinyal yolu, NOD benzeri reseptör sinyal izlemesi ve nötrofil ekstrasellüler tuzağı (NET) oluşumu gibi immünomodülasyon ve iltihaplanmada rol oynayan önemli yolları ortaya koydu. PPI ağı, HSP90AB1, MMP9, HSP90AA1, ARG1 ve MYC'yi çekirdek hedefler olarak belirledi. Moleküler kenetlenme, bu hedefler ile DCQD bileşenleri arasında güçlü bağlanma eğilimlerini doğruladı. Bulgularımız, sepsis kaynaklı ARDS için umut vadeden yardımcı tedavi olarak DCQD'yi destekleyen mekanik temeli çözüyor.

Giriş

Akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS), çeşitli akciğer veya ekstrapulmoner faktörler tarafından neden olan, öncelikle diffüz akciğer hasarı ve refrakter hipoksemi ile karakterize edilen son derece heterojen bir kliniksendromdur 1. 1967'deki ilk tanımından bu yana, ARDS anlayışı sürekli olarak gelişmiş ve tanıkriterlerinin yinelemeli revizyonlarına yol açmıştır 2. Ayrıca, akciğer koruyucu ventilasyon, ex vivo destek ve pozisyon pozisyonu gibi terapötik stratejilerin uygulanması hem klinik yönetimi hem de araştırma ilerlemesini derindenetkilemiştir 3. Buna rağmen, ARDS ölüm oranı endişe verici derecede yüksek olmaya devam ediyor. Küresel bir anket, ARDS hastalarının tüm yoğun bakım (yoğun bakım) yatışlarının %10,4'ünü oluşturduğunu ortaya koydu. Son on yıllarda kritik bakımda önemli ilerlemelere rağmen, ölüm oranları (yoğun bakımda ve taburcu sonrası bölümde) %35-45 arasında kalmaya devam etmektedir4.

ARDS'nin patofizyolojisi karmaşıktır ve alveolar epitel ve kapiller endotel hasarı, akciğer ve sistemik inflamatuar yanıtlar ile ventilatör kaynaklı akciğerhasarını içerir 5. Özellikle, COVID-19 ile ilişkili ARDS, klasik ARDS'ye kıyasla belirgin patofizyolojik özellikler gösterir; COVID-19 potansiyel olarak daha şiddetli mikrovasküler tromboz ve bölgesel heterojen iltihabayol açabilir 6,7. Hastalığın karmaşık patofizyolojisi ve yüksek heterojenliği göz önüne alındığında, ARDS için kesin bir farmakoterapi mevcut değildir. Kortikosteroidler ve nöromüsküler blok ajanları dışında — bunlar ölüm faydaları nedeniyle koşullu olarak önerilir — diğer ilaç tedavileri (örneğin, nitrik oksit [NO], prostatasiklin, interferon-β, pulmoner surfaktanlar ve aktive protein C) klinik etkinlik göstermemiştir. Buna karşılık, β-agonistler (örneğin, albuterol) ve keratinosit büyüme faktörü zararlıolduğu kanıtlanmış 8,9. Sonuç olarak, güvenli, çok işlevli tedavilerin geliştirilmesi kritik bir araştırma önceliği olmaya devam etmektedir.

3.000 yılı aşkın bir tarihe sahip geleneksel Çin Tıbbı (TCM), çeşitli solunum yolu hastalıklarını önlemek ve tedavi etmek için kullanılmıştır. Binlerce yıllık klinik uygulama ve TCM araştırmalarının modernizasyonu sayesinde, ARDS10,11 yönetiminde potansiyelini göstermiştir. TCM, terapötik etkilerini çok bileşenli, çok yollu ve çok hedefli mekanizmalarla gösterir; özellikle inflamatuar yanıtları hafifleterek, bağışıklık fonksiyonunu modüle ederek ve akciğer dokularınıkoruyarak 12. Örneğin, Paeonia lactiflora kökleri, Ligusticum chuanxiong köksleri, Salvia miltiorrhiza kökleri, Carthamus tinctorius çiçekleri ve Angelica sinensis köklerinden oluşan TCM kaynaklı Xuebijing enjeksiyonu (XBJ) birçok aktif bileşen içerir. ARDS'yi, bağışıklık fonksiyonu, oksidatif stres ve iltihabı IL-17, HIF-1 ve TNF sinyal yolları13 aracılığıyla düzenleyerek hafifletmektedir. Klinik çalışmalar, XBJ tedavisine maruz kalan hastaların ölüm oranlarının azaldığını, yoğun bakımda daha kısa kalıcılık sürelerinin ve daha düşük inflamatuar sitokin seviyelerinin olduğunugöstermiştir 14. COVID-19 pandemisi sırasında, şiddetli inflamatuar yanıtlar nedeniyle tetiklenen aşırı bağışıklık aktivasyonu ağır vakalarda kritik bir faktör olarak ortayaçıktı 15,16. Ayrıca, bazı TCM bileşenleri antioksidan özelliklere sahiptir; bu da serbest radikalleri toplamaya ve oksidatif stres kaynaklı akciğer hasarını azaltmaya olanak tanır. ARDS genellikle gaz değişimini bozan pulmoner mikro dolaşım disfonksiyonu ile birlikte gelir. Bazı TCM formülasyonları, kan aktive edici ve durağan çözümleyici etkiler sergiler; mikrosirkülasyonu iyileştirerek akciğer ödemini azaltır ve oksijenlenmeyi artırır. Ayrıca, TCM, hücre ölümyollarını düzenleyerek akciğer hasarını iyileştirebilir (12,17,18). Bu bulgular topluca, TCM'nin ARDS tedavisinde önemli klinik potansiyelini vurgulamaktadır.

Dachengqi Demlendirmesi (DCQD), akut durumlar için TCM'de temel bir formül olup, dört bitkisel bileşenden oluşur: Ravent, mucize, manolya kabuğu ve olgunlaşmamış acı portakal19. Bileşik formülasyonu olarak, DCQD çok bileşenli ve çok hedefli etkileşimler sergiler; bu da tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α) ve interlökin-6 (IL-6) dahil olmak üzere çeşitli inflamatuar aracıların ve reaktif oksijen türlerinin üretimini etkili bir şekilde engeller. Yüksek hareketlilik grubu kutusu 1 (HMGB1), derin bir inflamatuar aracı olarak, sepsisin patogenezi ve ilerlemesinde kritik rol oynar. Bağışıklık hücrelerinde ifade edilen bir reseptör olan toll-benzeri reseptör 4 (TLR4), HMGB1'e bağlandığında nükleer faktör-kappa B (NF-κB) ve mitojen-aktifete protein kinaz (MAPK) gibi aşağı akış inflamatuar sinyal yollarını aktive eder ve bu da inflamatuar sitokinlerin salınımının artmasına yol açar. DCQD, HMGB1-TLR4 sinyal ekseni modüle ederek terapötik etkiler uygular; böylece NF-κB ve p38 MAPK'ın aktivasyonunu bastırır, inflamatuar sitokin üretimini azaltır ve sistemik iltihabıazaltır 22,23. Ayrıca, DCQD bileşenleri pro-inflamatuar sinyal yolları, oksidatif stres, apoptoz ve piropatoz 24,25,26,27 modüle ederek terapötik etkiler uygular. DCQD, lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı hiperinflamatuar yanıtları ve pulmoner epitelyal hasarı azaltarak ARDS tedavisinde kritik bir rol oynar. Mekanik olarak, Z-DNA bağlayan protein 1 (ZBP1)-reseptör-etkileşimli protein kinaz 1 (RIPK1)-PANoptosome montajını (çok proteinli bir kompleks oluşumu ve inflamatuar hücre ölümünü tetikleyebilen süreci ifade eder) baskılar, böylece LPS kaynaklı PANoptosis28'i hafifler. DCQD'nin terapötik oral uygulaması, akciğer dokusunda akvaporin-1 (AQP-1) ve akvaporin-5 (AQP-5) protein ifadesini artırırken, TLR4/NF-κB sinyal yolunu ve inflamatuar sitokin üretimini inhibe eder; nihayetinde ARDS ile ilişkili iltihabı iyileştirir.

TCM'nin karmaşık bileşimi, birden fazla bileşiğin sinerjik etkileriyle karakterize edilen, farmakolojik mekanizmalarını açıklamada hem avantajlar hem de zorluklar sunar. Farklı TCM bileşenleri, farklı moleküler hedefler ve yollar aracılığıyla terapötik etkiler yaratabilirken, bu bileşenler arasındaki potansiyel etkileşimler, entegre mekanizmalarının kapsamlı anlaşılmasını daha dakarmaşıklaştırır 29,30. Özellikle, ARDS tedavisinde yer alan fitokimyasallar ve bunların mekanik yolları hâlâ ulaşılmazdır. Bu bilgi eksikliklerini gidermek için, büyük veri analitiği ve yapay zekayı entegre eden ortaya çıkan disiplinlerarası bir alan olan biyoinformatik, aktif ilaç bileşenlerini tanımlama ve temel ilaç mekanizmalarını çözme konusunda umut vaatediyor 31,32,33. Buna göre, bu çalışma, ağ farmakolojisi ve moleküler kenetlenme gibi biyoinformatik yaklaşımları kullanarak ARDS tedavisinde DCQD'nin terapötik etkilerinin altında yatan temel fitokimyasalları, moleküler hedefleri ve yolları sistematik olarak belirlemektedir.

Yukarıdaki gerekçeye dayanarak, DCQD'nin çok bileşenli ağı aracılığıyla inflamatuar bozukluk ve bağışıklık hücresi aktivasyonu dahil olmak üzere temel patolojik süreçleri sinerjik olarak modüle ederek ARDS üzerinde terapötik etkiler uyguladığını varsayıyoruz. Bu hipotezi test etmek ve geleneksel hedef tahmininin sınırlamalarını aşmak için entegre bir biyoinformatik yaklaşım kullandık. Bu stratejinin temel yeniliği, DCQD'nin potansiyel hedeflerini, yalnızca kamu veritabanlarından değil, daha da önemlisi sepsis kaynaklı ARDS hastalarının klinik transkriptomik veri setinden (GSE32707) türetilen ARDS ile ilgili genlerle kesiştirmektir. Bu üç katmanlı tarama, bulgularımızın klinik önemini artırmayı ve DCQD'nin ARDS'yi iyileştirebileceği temel genleri ve yolları belirlemeyi, böylece etki mekanizması için daha hassas ve güvenilir bir teorik çerçeve sağlamayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm materyaller, veritabanları, yazılımlar ve deneysel reaktifler dahil Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir. Tüm deneysel prosedürler Suzhou Dushu Gölü Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (izin numarası: 2410008).

Aktif bileşenlerin taraması ve DCQD'nin hedef edinimi
Da-Cheng-Qi Karışımı (DCQD)'deki ravent, mirabilit, manolya kabuğu ve olgunlaşmamış acı portakal gibi bitkilerin aktif bileşenleri, geleneksel Çin tıp sistemleri farmakoloji (TCMSP) veritabanından şu kriterler kullanılarak taranmıştır: ağızdan biyoyararlanılım (OB) ≥%30 ve ilaç benzerliği (DL) ≥0.18. Belirlenen aktif bileşenlerin ilgili hedefleri daha sonra toplandı. Bu eşikler, ağ farmakolojisi çalışmalarında yaygın olarak benimsenmiştir ve daha yüksek farmakokinetik özelliklere sahip bileşikleri filtrelemek için(34,35). Bileşik seçiminin güvenilirliğini artırmak ve tek veritabanı taramasından kaynaklanan yanlılığı azaltmak için, çapraz doğrulama BATMAN-TCM veritabanı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. BATMAN-TCM, TCM bileşenleri ile hedef proteinler arasındaki bilinen ve tahmin edilen etkileşimleri depolayan bütünleşik bir veritabanıdır; TCM farmakolojik mekanizmalarının keşfedilmesine ve ilaç keşfine yardımcı olur. Güncellenmiş 2.0 sürümü, önemli ölçüde genişletilmiş bir TTI veri seti ve geliştirilmiş özellikler sunarak TCM'nin moleküler mekanizmalarını anlamak ve karmaşık hastalıklar için yeni tedaviler geliştirmek için değerli bir kaynak haline gelmektedir. Tahmini hedefleri olmayan veya BATMAN-TCM hedef puanı 20'nin altında olan bileşikler hariç tutuldu. Ayrıca, nispeten düşük OB değerlerine sahip ancak BATMAN-TCM'de öngörülen hedefleri ve iyi belgelenmiş farmakolojik aktivitelere (örneğin, antrakinonlar ve flavonoidler) sahip bileşikler literatür kürasyonu yoluyla korundu. Potansiyel yanlış pozitif bileşenleri daha da azaltmak için, endogen hormonlar ve nörotransmitter benzeri maddeler (örneğin, progesteron ve serotonin) manuel olarak dışlanmıştır. Son bileşik set, sonraki hedef tahmini ve ağ inşası için kullanıldı. Detaylı iş akışı Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. Aktif bileşenlerin nihai listesi Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

SMILES tanımlayıcıları (moleküllerin kimyasal yapısını tanımlamak için ASCII dizileri kullanan doğrusal bir gösterim yöntemi). Belirli semboller ve kurallar kullanılarak, atomları, kimyasal bağları ve moleküler topolojiyi boşluksuz sürekli bir karakter dizisi halinde kodlar; böylece her aktif bileşenin PubChem veritabanından kısa, net ve bilgisayar tarafından okunabilir moleküler bilgi depolanması ve iletişi) alınır ve potansiyel hedefler İsviçre hedef tahmini kullanılarak tahmin edilir; organizma parametresi 'Homo sapiens' olarak ayarlanmış ve >0 olasılık puanı uygulanmıştır. Her iki veritabanından elde edilen hedef setler birleştirildi ve DCQD için nihai aday hedef seti oluşturulmak üzere tekrarlanan girişler çıkarıldı.

DCQD'de bulunan bir mineral ilaç olan Mirabilitum (Mangxiao, Na₂SO₄·10H₂O) TCMSP veya benzeri bileşik hedef veritabanlarına dahil edilmediğini belirtmek önemlidir. Sonuç olarak, bu veritabanı kısıtlaması nedeniyle, bu çalışmada oluşturulan bileşen-hedef ağı Mirabilitum'un potansiyel katkılarını kapsamamaktadır. Bu nedenle ağ, diğer üç bitkisel bileşenin fitokimyasal bileşenlerine dayanır: Rheum palmatum, Magnolia officinalis ve Citrus aurantium.

DCQD hedeflerinin zenginleştirme analizi
DCQD hedefleri, zenginleştirme analizi için metascape veritabanına aktarıldı ve tür "Homo sapiens" ile sınırlandırıldı. Gen ontolojisi (GO) ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri yapıldı; ilki biyolojik süreçleri (BP), hücresel bileşenleri (CC) ve moleküler fonksiyonları (MF) kapsıyordu. GO zenginleştirme sonuçlarında ilk 6 ve KEGG zenginleştirme sonuçlarında ilk 20 seçildi. KEGG ve GO çubuk grafikleri, biyoinformatikten alınan çevrimiçi araç kullanılarak oluşturuldu. Veriler, hastalık ontolojisi (DO) bar grafiki oluşturmak için R'deki DOSE paketi üzerinden içe aktarıldı.

"Bitkisel Tıp Bileşeni-Hedef" ağının İnşası
DCQD'nin ilgili bileşenleri ve ilgili hedefleri, "bitkisel ilaç-bileşen-hedef" ilişkilerini gösteren bir ağ diyagramı oluşturmak için Cytoscape 3.10.3'e aktarıldı. CytoNCA eklentisi Derece değerlerini hesaplamak için kullanıldı ve en iyi 5 aktif bileşen sıralamaya göre tarandı.

ARDS hedeflerinin kamuya açık veritabanlarından alınması
"Akut solunum sıkıntısı sendromu" anahtar kelimesi kullanılarak, ARDS ile ilgili hedefler OMIM ve GeneCards veritabanlarından alındı. Gen Kartlarında, >5 alaka puanına sahip hedefler seçildi. Her iki veritabanından tekrarlar birleştirilip kaldırıldıktan sonra ARDS için bir aday hedef seti elde edildi.

Biyoinformatik analiz
Sepsis-ARDS ile ilgili veri seti GSE32707 (GPL570 platformu, n = 45), 30 sepsis kaynaklı ARDS hastası ve 15 sağlıklı kontrol testinin periferik kan mononükleer hücrelerinden RNA dizisini içeren veri seti NCBI GEO veritabanından indirildi. Veriler, R'deki GEOquery paketi kullanılarak içe aktarıldı ve normalizasyon limma paketiyle yapılarak örnekler arası değişkenliği en aza indirdi. Farklı şekilde eksprese edilen genler (DEG) |log2FC| > 1 ve p < 0.05. Görselleştirme, volkan haritaları ve ısı haritaları aracılığıyla gerçekleştirildi. GO ve KEGG zenginleştirme analizleri yol analizi için yapıldı, sonuçlar baloncuk grafikleri ve çubuk grafikleri şeklinde sunuldu.

ARDS tedavisinde DCQD için potansiyel hedeflerin tahmini
Biyoinformatik çevrimiçi araç kullanılarak DEG'leri, kamuya açık veri tabanlarından ARDS ile ilgili hedefleri ve DCQD ilaç hedeflerini karşılaştırmak için bir Venn diyagramı oluşturuldu ve böylece ARDS için DCQD'nin potansiyel terapötik hedefleri belirlendi.

Protein-protein etkileşim (PPI) ağının inşası ve çekirdek hedeflerin taraması
Örtüşen hedefler, tür "Homo sapiens" olarak ayarlanmış ve etkileşim puanı eşiği 0.4 olarak belirlenmiş şekilde STRING veritabanına aktarılmıştır. PPI ağ verileri TSV formatında dışa aktarıldı ve Cytoscape 3.10.3 kullanılarak görselleştirildi. CytoHubba eklentisi, MCC, MNC, derece, EPC, aralık, yakınlık, radyalite ve stres puanlarına göre en iyi 10 hedefi taramak için kullanıldı. Bu hedeflerin kesişimi 5 çekirdek hedef ortaya çıkardı.

"Bitkisel Tıp Bileşeni-Hedef-Hastalık" ağının İnşası
Örtüşen hedeflere dayanarak, karşılık gelen DCQD bileşenleri belirlendi. İlgili bileşenler, ilgili hedefler ve hastalık bağlantılarıyla birlikte, "bitkisel tıbb-bileşen-hedef-hastalık" ilişkilerini gösteren bir ağ diyagramı oluşturmak üzere Cytoscape 3.10.3'e ithal edildi.

Temel hedeflerin zenginleştirme analizi ve "bitkisel tıbb-bileşen-hedef-hastalık yolu" ağının inşası
ARDS tedavisinde DCQD'nin potansiyel biyolojik fonksiyonlarını ve ana sinyal yollarını incelemek için, temel hedefler Metascape'de (tür: "Homo sapiens") GO ve KEGG zenginleştirme analizlerine tabi tutuldu. GO'nun ilk 10'u ve KEGG zenginleştirme sonuçlarında ilk 13'ü seçildi. Görselleştirme, Biyoinformatik araçlar kullanılarak KEGG baloncuk grafikleri, GO bar grafikleri ve Sankey baloncuk grafikleri oluşturuldu. Ayrıca, fonksiyonel zenginleştirme sonuçlarına dayanarak, Cytoscape 3.10.3'te "bitkisel tıbb-bileşen-hedef-hastalık-yolu" ilişkilerini göstermek için bir ağ diyagramı oluşturuldu.

Moleküler kenetlenme ve görselleştirme
Bileşiklerin ikincil moleküler yapıları PubChem veritabanından alınırken, çekirdek hedeflerin 3B yapıları PDB veritabanından (http://www.rcsb.org/) alındı. Su molekülleri ve amino asit kalıntıları PyMOL kullanılarak çıkarıldı. Hedef proteinler ve bileşikler, bağlanma enerjilerini hesaplamak için moleküler kenetlenme için AutoDock'a ithal edildi. Görselleştirme PyMOL kullanılarak gerçekleştirildi. R'deki pheatmap paketi kullanılarak bir bağlanma enerjisi ısı haritası oluşturuldu; çekirdek hedefler x ekseninde, bileşikler y ekseninde ve renk gradyanı bağlanma enerjilerini temsil ediyordu. Kenetlenme sonuçlarının iki boyutlu etkileşim diyagramları Discovery Studio Visualizer 4.5 kullanılarak oluşturuldu. Moleküler kenetlenme, gerçek inhibitör etkinliği tahmin etmek yerine bileşikler ve hedefler arasındaki bağlanma fizibilitesini değerlendirmek için gerçekleştirildi.

ARDS fare modelinin inşası
Bu çalışma, Suzhou Dushu Gölü Hastanesi (2410008) tıbbi etik komitesi tarafından onaylandı. Sağlıklı erkek C57BL/6J fareleri (n = 30; 20 ± 5 g) elde edildi. Fareler kontrol grubuna (n = 10), LPS grubuna (n = 10, LPS 10 mg/kg) ve bir DCQD grubuna (n = 10, ağızdan gajaj ile LPS 10 mg/kg kombinasyonu ile DCQD 0,9 g/kg almıştır) olarak ayrılmıştır. LPS grubundaki farelere intraperitoneal LPS enjeksiyonu yapıldı. DCQD grubundaki farelere LPS'nin intraperitoneal enjeksiyonundan hemen sonra oral garaj yoluyla DCQD 0.9 g/kg verildi. Tüm farelerden akciğer ekstraksiyonundan hemen önce ve sonra ölçümler alındı. Daha sonra akciğer dokuları -80 °C'de depolandı.

Western Blot Analizi (WB)
Proteinler fare akciğer dokusu lizatlarından izole edildi ve konsantrasyonları BCA protein nicel kiti kullanılarak ölçüldü. Daha sonra, proteinler 95 °C'de 10 dakika kaynatarak denatüre edildi. Denatüre edilmiş proteinler, jel hazırlama kiti ile hazırlanmış %10 SDS-PAGE jel üzerinde ayrıldı ve ardından PVDF membranına aktarıldı. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için, PVDF zarları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca proteinsiz hızlı bloklama tamponu kullanılarak bloklandı. PBST ile yıkandıktan sonra, zarlar MMP9, HSP90, MYC ve ARG1'e karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi. PBST ile başka bir yıkamadan sonra, zarlar HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG(H+L) ile oda sıcaklığında 2 saat kuluçka altına alındı. Son olarak, ultra hassas kemimilüminesans tespit kiti alt katı uygulandı ve kemilyüminesan protein bantları BIO-RAD kemilyüminsans görüntüleme sistemi kullanılarak tespit edildi. Gri ton analizi ImageJ ile gerçekleştirildi. Bu deneyde kullanılan antikorlar Ek Tablo 2'de listelenmiştir.

Enzim bağlantılı immünosorbent test analizi (ELISA)
İlk olarak, bronkoalveolar lavaj sıvısı (BALF) üç kez 2 ml salin ile lavaj yapılarak toplandı. Ortaya çıkan lavaj sıvıları biriktirilip hücreleri çıkarmak için 10.000 g boyunca 10.000 g seviyesinde santrifüj edildi. Süpernatant daha sonra aspirasyon edilip sıvı azotta dondurularak saklanırdı. Daha sonra, hedef sitokinlerin konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına uygun olarak Mouse IL-6 ELISA Kit, Mouse IL-18 ELISA Kit ve Mouse TNF-alpha ELISA Kit kullanılarak belirlendi. Sonrasında reaksiyon plakası bir mikroplaka okuyucuya yerleştirildi ve her kuyunun optik yoğunluk (OD) değeri 450 nm dalga boyunda ölçüldü; sıfır ayar için boş kontrol kuyusu kullanıldı. Son olarak, standartların konsantrasyonları ve karşılık gelen OD değerlerine dayalı standart bir eğri çizildi. Her örnekteki hedef faktörün konsantrasyonu standart eğri denklemine göre hesaplandı.

İstatistiksel analiz
Veriler GraphPad Prism 10.1.2 kullanılarak analiz edildi. Gruplar arasındaki farkların önemi, tek yönlü varyans analizi veya Öğrenci t-testi ile istatistiksel olarak değerlendirildi. P değeri 0.05'ten küçükse, fark anlamlı kabul edilir; P değeri 0.01'den küçükse, oldukça önemli olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DCQD'nin biyoaktivite analizi
DCQD'nin biyoaktivitesinin altında yatan moleküler mekanizmaları çözmek için, potansiyel hedefler ilk olarak İsviçre hedef tahmin ve TCMSP veritabanları taraması ile belirlendi. Toplam 16 bileşen ravent, 17 olgun olmayan acı portakaldan ve 2 manolya kabuğu eşleştirilerek 614 potansiyel hedef elde edildi (Şekil 1A). Sonrasında, üç bitkisel ilaç, 35 aktif bileşeni ve 614 hedef arasındaki ilişkileri görselleştirmek için bir ağ diyagramı oluşturu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

ARDS, hayatı tehdit eden bir akciğer hastalığına dönüşmüş ve küresel sağlık hizmetlerine önemli bir yük getirmiştir; yıllık vaka sayısı 100.000 kişiye 1,5-79 arasında ve ölüm oranları farklı şiddet seviyelerinde %34,9 ile %46,1 arasında değişmektedir37. Akciğer koruyucu ventilasyon ve pozisyon pozisyonu gibi mekanik ventilasyon stratejilerindeki gelişmelere rağmen, patofizyolojik süreçlerin heterojenliği ve sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle klinik sonuçlar opti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel çıkar çatışması olarak değerlendirilebilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki olmadan yürütüldüğünü belirtmektedir. Bu çalışmanın hazırlanmasında üretken yapay zeka ve yapay zeka destekli teknolojiler kullanılmadı.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklendi (Hibe Numarası: 82570078).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Arginaz-1 Poliklonal antikorProtein Tech Group Inc., ABD16001-1-AP
AutoDockScripps Araştırma EnstitüsüNAhttp://autodock.scripps.edu/
BATMAN-TCM veritabanı Pekin Çin Tıp ÜniversitesiNAhttp://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
BCA protein nicelik kitiServicebioG2026
BiyoinformatikBiyoinformatikNAhttps://www.bioinformatics.com.cn/
BIO-RAD kemimilüminesans görüntüleme sistemiThermo Fisher Scientifichttps://www.bio-rad.com/en-in/category/chemidoc-imaging-systems?ID=NINJ0Z15
C57BL/6J fareleriHangzhou Ziyuan Laboratuvarı Hayvan Teknolojisi A., Ltd
c-MYC Poliklonal antikorProtein Tech Group Inc., ABD10828-1-AP
SitoscapeSitoscapeversion 3.10.3https://cytoscape.org/
DCQDSuzhou Dushu Gölü Hastanesi Geleneksel Çin Tıbbı Bölümü
Discovery Studio Visualizer Keşifsürüm 4.5
GraphPad Prism Dotmaticsversion10.1.2https://www.graphpad.com/
GAPDH Poliklonal antikorProtein Tech Group Inc., ABD10494-1-AP
Jel hazırlama kitiServicebioG2003
GeneCards  VeritabanıCrown insan genom merkeziNAhttps://previous.genecards.org/
GEO veritabanıUlusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI)GSE32707 (GPL570 platformu, n=45)
HRP ile konjuge edilmiş Affinipure Keçi Anti-Tavşan IgG(H+L)Protein Tech Group Inc., ABDSA00001-2
HSP90 Poliklonal antikorProtein Tech Group Inc., ABD13171-1-AP
Lipopolisakkaridler (LPS)SolarbioL8880
Metascape veritabanıNIHNAhttps://metascape.org/gp/index
Microplate okuyucuBioTeKhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/microplate-readers?srs
ltid=AfmBOoqJhJhNJW6vNU
fnskFb9jjcTgXww1A1km-JVP
P1SScq1Mx78HBi
MMP-9 (N-terminal) Poliklonal antikorProtein Tech Group Inc., ABD10375-2-AP
Fare IL-18 ELISA KitiServicebioGEH0010
Fare IL-6 ELISA KitiServicebioGEM0001
Fare TNF-alfa ELISA KitiServicebioGEH0004
OMIM veritabanıJohns Hopkins ÜniversitesiNAhttps://www.omim.org/
Omni-ECL™ Ultra-Hassas Kemimilüminesans Algılama KitiEpizyme BiotechSQ201
PDB veritabanıRCSBNAhttp://www.rcsb.org/
Proteinsiz hızlı bloklama tamponuEpizyme BiotechG2052
PubChem veritabanıUlusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI)https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PVDF membranıMerckNA
PyMOLSchrödingerversion 3.10.3
STRING veritabanıKüresel biyoveri koalisyonu ve ElixirNAhttps://cn.string-db.org/
İsviçre Hedef Tahmin Veritabanıİsviçre Biyoinformatik EnstitüsüNAhttp://www.swisstargetprediction.cn/
Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakolojisi (TCMSP) veritabanıNorthwestern Politeknik Üniversitesisürüm 2.3https://www.tcmsp-e.com/

Kaynaklar

  1. ARDS Definition task force. Acute respiratory distress syndrome: the Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  2. Ashbaugh, D. G., Bigelow, D. B., Petty, T. L., Levine, B. E. Acute respiratory distress in adults. Lancet. 2 (7511), 319-323 (1967).
  3. Matthay, M. A., et al. A new global definition of acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 209 (1), 37-47 (2024).
  4. Jia, F., et al. A prediction model for 30-day mortality in patients with ARDS admitted to the intensive care unit. Eur J Med Res. 30 (1), 559(2025).
  5. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  6. Lippi, G., Mattiuzzi, C., Favaloro, E. J. Prone position and the risk of venous thrombosis in COVID-19 patients with respiratory failure. Semin Thromb Hemost. 50 (7), 1019-1021 (2024).
  7. Ball, L., et al. Understanding the pathophysiology of typical acute respiratory distress syndrome and severe COVID-19. Expert Rev Respir Med. 16 (4), 437-446 (2022).
  8. Battaglini, D., Iavarone, I. G., Rocco, P. R. M. An update on the pharmacological management of acute respiratory distress syndrome. Expert Opin Pharmacother. 25 (9), 1229-1247 (2024).
  9. Matera, M. G., Rogliani, P., Bianco, A., Cazzola, M. Pharmacological management of adult patients with acute respiratory distress syndrome. Expert Opin Pharmacother. 21 (17), 2169-2183 (2020).
  10. Rahman, M. M., et al. Natural therapeutics and nutraceuticals for lung diseases: Traditional significance, phytochemistry, and pharmacology. Biomed Pharmacother. 150, 113041(2022).
  11. Chen, Z., Ye, S. Y. Research progress on antiviral constituents in traditional Chinese medicines and their mechanisms of action. Pharm Biol. 60 (1), 1063-1076 (2022).
  12. Liu, Y., et al. Pharmacological mechanisms of traditional Chinese medicine against acute lung injury: From active ingredients to herbal formulae. Phytomedicine. 135, 155562(2024).
  13. Li, J., Shen, M., Yin, Z. Exploring the mechanism of action of xuebijing injection in treating acute respiratory distress syndrome based on network pharmacology and animal experiments. J Inflamm Res. 18, 6037-6047 (2025).
  14. Zhang, Y., Wang, J., Liu, Y. M., Yang, H., Wu, G. J., He, X. H. Analysis of the efficacy and mechanism of action of xuebijing injection on ARDS using meta-analysis and network pharmacology. BioMed Res Int. 2021, 8824059(2021).
  15. Mehta, P., et al. COVID-19: consider cytokine storm syndromes and immunosuppression. Lancet. 395 (10229), 1033-1034 (2020).
  16. Cavalcante-Silva, L. H. A., et al. Neutrophils and COVID-19: The road so far. Int Immunopharmacol. 90, 107233(2021).
  17. Zhang, Y., et al. Electroacupuncture alleviates LPS-induced ARDS through α7 nicotinic acetylcholine receptor-mediated inhibition of ferroptosis. Front Immunol. 13, 832432(2022).
  18. Zhang, H., et al. Pharmacodynamic advantages and characteristics of traditional Chinese medicine in prevention and treatment of ischemic stroke. Chin Herb Med. 15 (4), 496-508 (2023).
  19. Liu, Z., et al. Dachengqi Decoction alleviates intestinal inflammation in ovalbumin-induced asthma by reducing group 2 innate lymphoid cells in a microbiota-dependent manner. J Tradit Complement Med. 13 (2), 183-192 (2023).
  20. Shuhan, W., et al. Dachengqi decoction ameliorated liver injury in liver fibrosis mice by maintaining gut vascular barrier integrity. Phytomedicine. 136, 156272(2025).
  21. Yin, F. T., et al. Prediction of the mechanism of Dachengqi Decoction treating colorectal cancer based on the analysis method of " into serum components -action target-key pathway.". J Ethnopharmacol. 293, 115286(2022).
  22. Chen, Z., et al. Dachengqi Decoction attenuates inflammatory response via inhibiting HMGB1 mediated NF-κB and P38 MAPK signaling pathways in severe acute pancreatitis. Cell Physiol Biochem. 37 (4), 1379-1389 (2015).
  23. Zhu, Q., et al. Large Chengqi Decoction improves sepsis-related intestinal damage by inhibiting inflammatory response through the HMGB1-TLR4 signaling pathway. J Inflamm Res. 18, 5415-5425 (2025).
  24. Vajdi, M., Karimi, A., Karimi, M., Abbasalizad Farhangi, M., Askari, G. Effects of luteolin on sepsis: A comprehensive systematic review. Phytomedicine. 113, 154734(2023).
  25. Gao, L. L., Wang, Z. H., Mu, Y. H., Liu, Z. L., Pang, L. Emodin promotes autophagy and prevents apoptosis in sepsis-associated encephalopathy through activating BDNF/TrkB signaling. Pathobiology. 89 (3), 135-145 (2022).
  26. Fu, W., et al. Emodin inhibits NLRP3 inflammasome activation and protects against sepsis via promoting FUNDC1-mediated mitophagy. Int J Biol Sci. 21 (8), 3631-3648 (2025).
  27. Chunlian, W., Heyong, W., Jia, X., Jie, H., Xi, C., Gentao, L. Magnolol inhibits tumor necrosis factor-α-induced ICAM-1 expression via suppressing NF-κB and MAPK signaling pathways in human lung epithelial cells. Inflammation. 37 (6), 1957-1967 (2014).
  28. Zhang, M., et al. Dachengqi decoction dispensing granule ameliorates LPS-induced acute lung injury by inhibiting PANoptosis in vivo and in vitro. J Ethnopharmacol. 336, 118699(2025).
  29. Li, J., et al. Macrophagedriven pathogenesis in acute lung injury/acute respiratory disease syndrome: Harnessing natural products for therapeutic interventions (Review). Mol Med Rep. 31 (1), 16(2025).
  30. He, Y. Q., et al. Natural product derived phytochemicals in managing acute lung injury by multiple mechanisms. Pharmacol Res. 163, 105224(2021).
  31. He, T., et al. Integrating network pharmacology and non-targeted metabolomics to explore the common mechanism of Coptis Categorized Formula improving T2DM zebrafish. J Ethnopharmacol. 284, 114784(2022).
  32. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X., Zhou, Q., Shi, R. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  33. Mao, X., et al. Toosendanin alleviates acute lung injury by reducing pulmonary vascular barrier dysfunction mediated by endoplasmic reticulum stress through mTOR. Phytomedicine. 136, 156277(2025).
  34. Li, X., Liu, Z., Liao, J., Chen, Q., Lu, X., Fan, X. Network pharmacology approaches for research of Traditional Chinese Medicines. Chin J Nat Med. 21 (5), 323-332 (2023).
  35. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 309, 116306(2023).
  36. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PloS One. 8 (12), e83922(2013).
  37. Mannes, P. Z., et al. Molecular imaging of chemokine-like receptor 1 (CMKLR1) in experimental acute lung injury. Proc Nat Acad Sci U. 120 (3), e2216458120(2023).
  38. Lu, Y., Li, W., Qi, S., Cheng, K., Wu, H. Mapping knowledge structure and emerging trends of extracorporeal membrane oxygenation for acute respiratory distress syndrome: a bibliometric and visualized study. Front Med. 11, 1365864(2024).
  39. Sherman, E., Han, M. H. Acute and chronic management of neuromyelitis optica spectrum disorder. Curr Treat Options Neurol. 17 (11), 48(2015).
  40. Piccinini, A. M., Midwood, K. S. DAMPening inflammation by modulating TLR signalling. Mediators Inflamm. 2010, 672395(2010).
  41. Al-Husinat, L., et al. A narrative review on the future of ARDS: evolving definitions, pathophysiology, and tailored management. Crit Care. 29 (1), 88(2025).
  42. Ma, W., et al. Advances in acute respiratory distress syndrome: focusing on heterogeneity, pathophysiology, and therapeutic strategies. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 75(2025).
  43. Cao, Z., et al. Targeting of the pulmonary capillary vascular niche promotes lung alveolar repair and ameliorates fibrosis. Nat Med. 22 (2), 154-162 (2016).
  44. Fang, C., Wang, Y., Pan, Z. Formation of self-assembly aggregates in traditional Chinese medicine decoctions and their application in cancer treatments. RSC advances. 15 (7), 5476-5506 (2025).
  45. Shuhan, W., et al. Dachengqi decoction ameliorated liver injury in liver fibrosis mice by maintaining gut vascular barrier integrity. Phytomedicine. 136, 156272(2025).
  46. Pan, G., Wu, Y., Liu, Y., Zhou, F., Li, S., Yang, S. Dachengqi decoction ameliorates sepsis-induced liver injury by inhibiting the TGF-β1/Smad3 pathways. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 14 (3), 256-265 (2024).
  47. Guo, W., et al. Dachengqi decoction for the treatment of acute pancreatitis: a comprehensive analysis based on metabolites, pharmacokinetics, and metabolites efficacy mechanisms. Front Pharmacol. 16, 1549909(2025).
  48. Yin, F. T., et al. Prediction of the mechanism of Dachengqi Decoction treating colorectal cancer based on the analysis method of " into serum components -action target-key pathway.". J Ethnopharmacol. 293, 115286(2022).
  49. Hu, X., Liu, S., Zhu, J., Ni, H. Dachengqi decoction alleviates acute lung injury and inhibits inflammatory cytokines production through TLR4/NF-κB signaling pathway in vivo and in vitro. J Cell Biochem. 120 (6), 8956-8964 (2019).
  50. Yang, J. Y., et al. Material basis and molecular mechanism of Dachengqi Decoction in treatment of acute pancreatitis based on network pharmacology. Chin J Chin Materia Medica. 45 (6), 1423-1432 (2020).
  51. Lu, X., et al. Integrating network pharmacology, transcriptome and artificial intelligence for investigating into the effect and mechanism of ning fei ping xue decoction against the acute respiratory distress syndrome. Front Pharmacol. 12, 731377(2021).
  52. Liang, X., et al. Study on intervention mechanism of yiqi huayu jiedu decoction on ARDS based on network pharmacology. Evid-Based Complement Alternat Med. 2020, 4782470(2020).
  53. Yang, B., Liu, X., Liang, Y., Li, Y. Chemical inhibition of HSP90 inhibits TNF-α mediated proliferation and induces apoptosis in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. J Cell Biochem. 120 (2), 2547-2553 (2019).
  54. Zhang, X., et al. Ponicidin-induced conformational changes of HSP90 regulates the MAPK pathway to relieve ulcerative colitis. J Ethnopharmacol. 321, 117483(2024).
  55. Albakova, Z. HSP90 multi-functionality in cancer. Front Immunol. 15, 1436973(2024).
  56. Chien, L. H., Deng, J. S., Jiang, W. P., Chou, Y. N., Lin, J. G., Huang, G. J. Evaluation of lung protection of Sanghuangporus sanghuang through TLR4/NF-κB/MAPK, keap1/Nrf2/HO-1, CaMKK/AMPK/Sirt1, and TGF-β/SMAD3 signaling pathways mediating apoptosis. Biomed Pharmacother. 165, 115080(2023).
  57. Warburton, D., Shi, W., Xu, B. TGF-β-Smad3 signaling in emphysema and pulmonary fibrosis: an epigenetic aberration of normal development. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304 (2), L83-L85 (2013).
  58. Yadav, P., et al. Macrophage-fibroblast crosstalk drives Arg1-dependent lung fibrosis via ornithine loading. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  59. Lamoke, F., et al. Amyloid β peptide-induced inhibition of endothelial nitric oxide production involves oxidative stress-mediated constitutive eNOS/HSP90 interaction and disruption of agonist-mediated Akt activation. J Neuroinflamm. 12, 84(2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Etkileşim AğıKemokin SinyalizasyonuNOD-Benzeri ReseptörNötrofil Ekstraselüler TuzağıMoleküler Kenetlemeİnflamatuar Yanıt
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.