Yöntem makalesi

CUT&RUN kullanılarak nöroendokrin küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatlarında histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü bağlanma noktalarının genom çapında haritalanması

DOI:

10.3791/69656

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, 2Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöroendokrin küçük hücreli akciğer kanseri hücre hatları için optimize edilmiş bir Hedefin Altında Bölünme ve Nükleaz Kullanılarak Bırakım ve ardından yeni nesil dizileme (CUT&RUN-seq) protokolü tanımlanmıştır. SCLC patobiyolojisinde epigenetik ve transkripsiyonel deregülasyonları incelemek için çeşitli histon modifikasyonları ve transkripsiyon faktörü (örneğin E2F7) bağlanma noktalarının genom çapında haritalanmasını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kromatin yeniden şekillendirme proteinleri ve transkripsiyon faktörleri (TF'ler), küçük hücreli akciğer kanserinin (SCLC) tümör biyolojisinde kritik roller oynar. Histon post-translasyonel modifikasyonların (PTM'ler) ve TF bağlanma noktalarının genom çapında karakterizasyonu, SCLC'nin daha derin mekanik anlayışına ve terapötik müdahale için hedeflerin belirlenmesine yol açacak düzenleyici DNA öğeleri ve gen yollarını belirlemek için gereklidir. Hedefin Altında Bölünme ve Nükleaz Kullanılarak Salınım, ardından Next Generation Dizileme (CUT&RUN-seq), hücresel genomda yerinde çok çeşitli proteinlerin belirli histon modifikasyonlarını haritalamak ve DNA bağlama profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. CUT&RUN'da, Protein A/G ile birleşen mikrokokkal nükleaz (MNaz), antikorlar aracılığıyla kromatinle ilişkili proteinlerin genomik konumlarına yönlendirilir; burada alttaki DNA parçaları MNaz aktivasyonu ve bölünmesiyle toplu kromatinden salgılanır. Bu lokal sindirim, dizileme için uygun küçük, lokus-spesifik DNA parçaları üretir.

Burada, aktif veya açık promotörlerle ilişkili H3K4me3 ve aktif güçlendiricilerle ilişkili H3K4me1 histon modifikasyonlarının profillenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz; ayrıca SCLC'de transkripsiyon faktörü E2F7'yi de tanıtıyoruz. Bu protokol, genellikle büyük çekirdekler, az sitoplazma ve süspansiyonda yapışmayan agregalar olarak büyüme ile karakterize edilen nöroendokrin (NE) SCLC hücre hattı modelleri için optimize edilmiştir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon post-translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) ve transkripsiyon faktörleri (TF'ler), gen ifadesinin merkezi düzenleyicileridir. Asetilasyon, metilasyon, fosforilasyon ve ubiquitinasyon gibi histon PTM'ler, öncelikle N-terminal kuyruklarında kromatin yapısı 1,2'yi etkiler. Kanserde, histon PTM'ler genellikle düzensiz olur; bu da onkogenlerin anormal aktivasyonuna veya tümör baskılayıcıgenlerin susturulmasına yol açar 3. TF'ler, hedef genleri aktive etmek veya bastırmak için promotor veya güçlendiricilerde spesifik DNA dizilerini bağlar; genellikle kromatin yeniden modellemesini koordine eden histon modifiye edicienzimleri toplar. Histon asetil transferazlar (HAT), histon deasetilazlar (HDAC) ve metiltransferazlar (HMT) gibi histon işaretlerini yazan, silen veya okuyan enzimler kanserde sıklıkla mutasyona uğrar veya düzensizleşir, bu da onları çekici terapötik hedefleryapar 5.

SCLC'de, epigenetik değişiklikler ve soyu tanımlayan transkripsiyon faktörleri (LDTF) tümör biyolojisinin temel iticigüçleridir 6. Genetik mutasyonların aksine, DNA metilasyonu ve histon modifikasyonları dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, temel DNA dizisini değiştirmeden gen ifadesini düzenler. Bu modifikasyonlar, tümör baskılayıcı genleri susturabilir veya onkogenleri aktive edebilir, SCLC'nin agresif davranışını besleyebilir. Örneğin, histon metiltransferaz KMT2D, büyük bir gerçek dünya SCLC hastakohortu 7'de sık sık %12,9 değişim sıklığıyla mutasyona uğrar ve genomdaki aktif artırıcı bölgelerle ilişkili bir işaret olan histon H3 lizin 4 mono-metilasyonundan (H3K4me1) sorumludur. SCLC, moleküler olarak heterojen bir hastalıktır. SCLC, dört LDTF'nin diferansiyel ifadesine dayalı moleküler alt tiplere ayrılır: achaete-scute homolog 1 (ASCL1), nörojenik farklılaşma faktörü 1 (NEUROD1), evet ilişkili protein 1 (YAP1) ve POU sınıf 2 homeobox 3 (POU2F3). ASCL1 ve NEUROD1 dahil olmak üzere nöroendokrin (NE) alt tipleri SCLC vakalarının yaklaşık %70-80'inioluşturur 8. Bu nedenle, farklı SCLC alt tiplerindeki farklı histon PTM'lerin ve TF bağlanma noktalarının dağılımı ve profillerinin incelenmesi, terapötik müdahaleye karşı savunmasız alt tipe özgü gen programlarını aydınlatabilir.

Genom genelinde histon PTM'leri ve dizisine özgü düzenleyici proteinlerin bağlanma noktalarını tanımlamak için geleneksel yöntem kromatin immünopresipitasyon dizilemesidir (ChIP-seq)9. Ancak, ChIP-seq çok sayıda giriş hücresi gerektirir ve genom genelinde genellikle yüksek arka plan sağlar. Sonuç olarak, ChIP-seq gerçek sinyal ile gürültüyü ayırt etmek için hedef proteinin yüksek düzeyde zenginleştirilmesini gerektirir ve etkili veri analizi için derin dizileme gerektirir. Ayrıca, ChIP-seq'de kullanılan formaldehit çapraz bağlama epitleri maskeleyebilir ve yanlış pozitif bağlanma noktalarıoluşturabilir 10. Hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma, ardından yeni nesil dizileme (CUT&RUN-seq), sağlam hücreler içinde histon PTM'leri ve TF bağlanma noktalarının yerinde haritalanması için yüksek çözünürlüklü bir alternatiftir. Bu yöntemde, permeabilize hücreler, ilgi çeken kromatin ilişkili proteini hedef alan bir antikor ile kuluçka edilir ve ardından bir Protein A(G)-mikrokokkal nükleaz (MNase) füzyon proteini bağlanır. İlgilenen proteinin yanında hedeflenen DNA sindirimi, yüksek kalsiyum/düşük tuzlu koşullarda indüklenir ve saflaştırma için spesifik DNA parçaları serbest bırakılır. Arındırılmış DNA parçaları, yüksek verimlilikli dizileme kütüphaneleri oluşturmak için kullanılır; bu kütüphaneler yüksek verimliliklidizileme 11,12,13,14 için bir araya getirilebilir. ChIP-seq ile karşılaştırıldığında, CUT&RUN girdi olarak önemli ölçüde daha az hücre gerektirir, daha düşük arka plan gürültüsü üretir, çapraz bağlanan artefaktlardan kaçınır ve daha az dizileme okuması gerektirir - bu da kanserde dinamik kromatin durumlarını maliyet etkin bir şekilde incelemek için özellikle uygun hale getirir.

CUT&RUN teknolojisi, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin genomik konumlarını, histon modifikasyonları, TF bağlanma noktaları ve kromatin ilişkili kompleksleri araştırmak için geliştirilmiştir ve böylece epigenetik düzenleyici manzaralarortaya çıkarılmıştır 11,12. Bu teknik, gelişim ve hastalık ilerlemesi sırasında enhafizator-promotör mimarisi, transkripsiyonel ağ düzenlemesi ve kromatin durum dinamiklerinin ayrıntılı analizlerini mümkünkılmıştır 15. Kanser araştırmalarında CUT&RUN, histonişaretleri 16,17 ve onkojenik transkripsiyon faktörünün doluluğunun hassas haritalanmasını sağlar; bu da soy-sığır spesifik düzenleyici programları ve potansiyel terapötikhedefleri belirlemeye yardımcı olur 15,16. Ayrıca, CUT&RUN CD8+ Thücresi 17 dahil hücrelerde ve dokuörneklerinde (18,19) yerinde yapılabilir.

SCLC alt tiplerinde PTM'lerin genomik konumunu ve transkripsiyon faktörü E2F7 bağlanma noktalarını tespit etmek için, CUT&RUN-seq'u dört SCLC NE hücre hattı modeline uyguladık: H146 ve DMS79 (ASCL1 alt tipi), ayrıca H446 ve H82 (NEUROD1 alt tip), KMT2D mutasyonları olsun ya da olmasın. KMT2D tarafından katalize edilen esas olarak artırıcı ile ilişkili bir modifikasyon olan H3K4me1 histon işaretini ve ASCL120'nin bir kofaktörü olduğu gösterilen E2F7'yi profil olarak kullandık. Aktif promotörlerle ilişkili olan histon işareti H3K4me3 pozitif kontrol olarak hizmet verirken, IgG negatif kontrol görevini yapmıştır.

Burada, SCLC NE hücre hatları için aşağıdaki temel temel alınan ayrıntılı bir CUT&RUN protokolü sunuyoruz: ticari olarak mevcut bir CUT&RUN kiti (bkz. Materyaller Tablosu), Skene ve Henikoff 11,12,13'ün orijinal çalışmaları ve kendi laboratuvar optimizasyonlarımız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol (Şekil 1), genellikle yapışmayan agregalar veya yüzen kümeler olarak büyüyen SCLC NE hücre hatlarında CUT&RUN-seq uygulamak için adım adım talimatlar sunar.

1. Hücre Kültürü

  1. 75 mL şişelerde 13 mL RPMI-1640 ortamında, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ( bkz. Malzeme Tablosu) ile takviye edilmiş 13 mL RPMI-1640 ortamında, DMS79 (ASCL1 alt tipi), H146 (ASCL1 alt tipi), H82 (NEUROD1 alt tip) ve H446 (NEUROD1 alt tip) hücre hatlarını korumak. Hücreleri 37 °C'de %5CO2 ile kuluçka içinde yetiştirin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm hücreler ATCC'den satın alınmış ve kısa tandem tekrar profilleme ile doğrulanmıştır.

2. Hücre geçirimliliği

NOT: Doğru hücre permeabilizasyonu, antikorların, pAG-MNazın ve sindirilmiş protein-DNA parçalarının hücrelere serbestçe girip çıkmasını sağlamak için gereklidir. CUT&RUN protokolünü yeni bir hücre hattında başlatmadan önce, etkili permeabilizasyon için ideal digitonin konsantrasyonu belirlenmek üzere optimizasyonlar yapılmalıdır. CUT&RUN protokolü için %95'ten fazla permeabilizasyon (%95 "ölü") elde edilen en düşük konsantrasyon kullanılmalıdır.

  1. %5 digitonin stokunu, proteaz inhibitörü ve spermidini buz üzerine koyun ve tamamen erimelerine izin verin.
  2. Yıkama tamponunu Tablo 1'e göre hazırlayın ve tamponu buz üzerinde tutun.
  3. %5 stoktan 10 μL ile 990 μL Yıkama Tamponu karıştırarak %0,05 digitonin çalışma çözeltisi hazırlayın. Vortex ile iyice karıştırın ve buzda kalın.
  4. Önceki çözeltiyi sıralı olarak her tüpün 1 mL hacmine seyreltirerek bir seyreltme serisi (0,05%, 0,001%, %0,0001) üretin. Her seyreltmeyi girdablandırın, sonra bir diğerine geçin. Aynı zamanda, Wash Buffer'da %0,05 Dimetil Sülfoksit (DMSO) kontrolü hazırlanın (toplamda 100 μL; bkz. Tablo 2).
    NOT: Digitonin ve DMSO tehlikeli kimyasallardır. Dikkatli davranın ve tüm atıkları güvenli kapaklı, uygun şekilde etiketlenmiş tehlikeli atık konteynerine atın.
  5. Tüm digitonin seyreltme çözeltilerini ve DMSO kontrolünü kullanılana kadar buzda tutun.
  6. Bir test başına gereken hücre sayısını, permeabilizasyon koşullarının sayısını çarparak belirleyin. Pipetleme varyasyonunu telafi etmek için ek %20 ekleyin (örneğin, her biri 5×105 hücre içeren beş koşul için yaklaşık 1,2 x 5 x 5 x 105 hücre hazırlanın).
  7. Oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 600 × g santrifüjle gerekli sayıda kültür hücresi toplayın. Pelleti 600 μL 1× PBS (her koşul başına 100 μL artı %20 fazla) içinde yeniden askıya alın.
  8. PBS ile yeniden askıya alınmış hücrelerin 100 μL'sini beş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne alarak alarak her digitonin konsantrasyonu için bir tüp, bir tane DMSO kontrolü için.
  9. Tüpleri 600 × g'de 3 dakika boyunca RT'de santrifüj yapın.
  10. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve her bir pelleti ilgili digitonin veya DMSO kontrol tamponunun 50 μL'sinde yeniden askıya alın.
  11. Örnekleri RT'de 10 dakika kuluçka edin.
  12. 10 μL işlenmiş hücreleri 10 μL tripan mavisiyle karıştırın ve 10 uL karışımı bir hücre sayma slaytına yükleyin.
  13. Canlı hücreleri (lekelenmemiş) ve yaşatıcı olmayan, geçirimli pozitif hücreleri (boyalı mavi) ölçmek için hücre sayacı kullanın.
  14. Tripan mavisi pozitif hücrelerin en yüksek oranını üreten en düşük digitonin konsantrasyonunu belirleyin. Bu konsantrasyonu aşağı akış CUT&RUN deneyi için kullanın. DMSO kontrolünün normal sağlıklı bir hücre kültürüne özgü canlılığı koruduğunu doğrulayın.

3. CUT&RUN sek

NOT: Bu protokoldeki reaktifler 5 reaksiyon için ölçeklendirilmiştir ve pipetleme kaybını hesaba katmak için ekstra reaktivler eklenmiştir. Malzeme ve ekipman listesi için Materyaller Tablosu'na bakınız. Her CUT&RUN deneyi için en az iki bağımsız biyolojik kopya önerilir.

  1. 1. Gün
    1. CUT&RUN tampon hazırlığı
      1. Wash buffer'ı, Tablo 3'te belirtildiği gibi Pre-Wash Buffer, 25x Proteaz İnhibörü ve 1 M Spermidin birleştirerek hazırlayın.
      2. Hücre Geçirimliliği Tamponunu Yıkama Tamponuna %5 Digitonin ekleyerek Tablo 3'e göre hazırlayın.
      3. Antikor Tamponu, Tablo 3'te açıklandığı gibi uygun digitonin konsantrasyonuyla 100 μL hücre permeabilizasyon tamponuna 0,4 μL EDTA ekleyerek hazırlayın. Hazırlanan tamponu buzun üzerine koyun.
      4. Kalan Hücre Permeabilizasyon Tamponunu 2. Gün için 4 °C'de sakla.
    2. Concanavalin A (ConA) boncukları aktivasyonu
      1. ConA boncuklarının askısını nazikçe tekrar askıya alın ki eşit dağıtımı sağlansın.
      2. 55 μL boncuk süspansiyonu (örnek başına 11 μL) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      3. Boncuklar tamamen ayrılana kadar boru 1.5 mL'lik manyetik bir rafa yerleştirin, ardından pipetle süpernatantı çıkarın.
      4. Boncukları hemen 500 μL buz gibi soğuk Boncuk Aktivasyon Tamponu (örnek başına 100 μL) ile iki kez yıkayın. Her yıkamada boncukları nazikçe pipetle tekrar asın ve yıkamalar arasında manyetik raf kullanarak üst yüzeyi atabilirsiniz.
      5. Son yıkamadan sonra, üst boncukları çıkarın ve aktive boncukları 55 μL (örnek başına 11 μL) buz soğukluğu Boncuk Aktivasyon Tamponu içinde nazikçe yeniden süsküyünüz.
      6. Aliquot 10 μL boncuklar 8 şeritli bir boru setinin her tüpüne süzülür ve borular buz üzerinde tutulur.
    3. Hücreleri topla ve hücreleri aktive boncuklara bağla
      NOT: Hücre canlılığı sinyal/arka plan oranı için önemlidir. Ancak, SCLC NE hücre hatlarının yaşamı, hücre değişiminin doğal olarak yüksek olması ve süspansiyonda orta-büyük agregalar olarak büyüme tercihi nedeniyle değişken olabilir (%70-%90).
      1. Hücreleri 37 °C kuluçka makinesinden çıkarıp kaliteden emin olmak için mikroskop altında inceleyin.
      2. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 1.000-1.200 ×g arasında RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
      3. Ortamı konik tüpten aspire edin ve hücre pelletini 20 mL 1× PBS ile durulayın.
      4. Tekrar santrifüj yapın, PBS'yi aspire edin ve pelletin boyutuna göre 37°C'de 3-5 dakika boyunca Accutase ile sindirin.
      5. Sindirimi 5 mL PBS + %10 FBS ekleerek sonlandırın. Tek hücreli süspansiyonu serolojik pipetle nazikçe yukarı aşağı pipetle elde edin.
      6. Hücreleri 1.000-1.200 g × g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatı atın ve hücre pelletini 5 mL PBS ile yeniden askıya alın.
      7. Başlangıç hücrelerini sayın, hücrenin canlılığını ve bütünlüğünü doğrulayın.
      8. Reaksiyon sayısını bir reaksiyon başına hücre sayısıyla çarparak toplam hücre sayısını hesaplayın (5×105). Pipetleme hatalarını hesaba katmak için %20 fazlalık ekleyin (örneğin, 6 reaksiyon için 1.2 × 6 × 5 × 105 ). Hesaplanan hücre süspansiyonlarını 1.5 mL tüplere aktarın. Santrifüj 600 x g'de, RT'de 3 dakika.
        NOT: En az bir ek tepki yedek olarak hazırlanın.
      9. Hücreleri RT Yıkama Tamponunda her reaksiyon başına 5×10-5 hücre yoğunluğunda (toplamda altı reaksiyon) yeniden süspansiyona alın; her reaksiyon başına 100 μL kullanılarak, nazik ama titiz pipetleme ile düzgün bir süspansiyon sağlanır. 600 x g ile 3 dakika boyunca RT ile santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarmak için pipet.
      10. Yıkama adımını (9. adım) bir kez daha tekrarlayın.
      11. 10 μL aktive CoA boncukları içeren 8-şeritli setteki her tüpte 100 μL yıkanmış hücre Aliquot gönderin. Nazikçe pipet yapın ve mini santrifüjde hızla çevirip bulamacı toplayın (boncuklar yerleşmemeli).
      12. Boncuk hücresi bulamaçını RT rejiminde 10 dakika kuluçka altına alın, böylece hücreler boncuklara bağlanabilir.
      13. Tüpleri 0.2 mL'lik bir tüplü mıknatıs rafına koyun, çamurun temizlenmesine izin verin ve pipet ile üst patronu çıkarın. Hücrelerin boncuklara bağlı olduğunu doğrulamak için 10 μL süpernatant saklayın. Kalan süpernatantı atın ve hızla bir sonraki adıma geçin.
      14. Mıknatıstan tüpleri çıkarın. Her reaksiyona hemen 50 μL buz gibi soğuk Antikor Tamponu ekleyin ve boncukları tekrar askıya almak için nazikçe pipetleyin.
      15. Hem üst yüzeyden 10 μL hem de 10 μL hücre/boncuk süspansiyonundan (Antikor Tamponunda yeniden süspansiyon) 10 μL tripan mavisiyle karıştırın ve karışımı hücre sayaç sürgüsüne yükleyin.
      16. Hücre sayacı ile analiz edin. Üst katmanın neredeyse hiç boncuk veya hücre içermediğini, boncuk/hücre karışımının ise permeabilize hücreler içerdiğini ve boncuklarla çevrili olduğunu doğrulayın.
        NOT: Cells CoA boncuklarının bağlanma uyumunu kontrol etmek önemlidir.
    4. Permeabilizasyon ve antikor bağlanması
      NOT: CUT&RUN'un başarısı, antikorun hedefe olan yakınlığına ve belirli deneysel koşullar altındaki özgüllüğüne bağlıdır. Şunları öneriyoruz: 1. Mevcut olduğunda CUT&RUN için doğrulanmış ticari antikorları kullanın. 2. CUT&RUN doğrulanmış antikorları olmayan hedefler için, İmmünoflüoresans (IF) için doğrulanmış hedefleri düşünün; çünkü IF antikorları, CUT&RUN'da permeabilize hücrelerde antikorun hedefe yerinde bağlanmasına benzer şekilde, kendi hücresel bağlamlarında epitopları tanır. 3. Uygulamanız için en etkili olanı belirlemek için 3-5 antikoru paralel olarak test edin.
      1. K-MetStat Paneli ve pipet'i hızlıca döndürerek yeniden askıya alın. H3K4me3 pozitif ve IgG negatif kontrol antikorları için belirlenmiş reaksiyonlara 2 μL K-MetStat Paneli ekleyin. Pipet karıştırmak ve hızlı spin borular (isteğe bağlı).
      2. Her reaksiyona farklı kaynaklardan 0,5 μg H3K4me3, H3K4me1 ve IgG antikorları ile 0,6 μg E2F7 poliklonal antikoru ekle (Tablo 4). 8-şeritli tüpleri etiketleyin.
      3. Her reaksiyon tüpünü doğru şekilde karıştırmak için nazikçe pipet yapın. Tüp kapakları yukarıda bir nutator ile 4 °C sıcaklıkta gece boyunca kuluçka yapın. Tüpleri döndürmeyin veya ters çevirmeyin.
  2. 2. Gün
    1. pAG-MNazın antikora bağlanması
      NOT: Boncukların gece boyunca yerleşmesi normaldir ve sonuçları etkilemez. Eğer boncuklar gece kuluçkasından sonra topaklı veya yapışkan hale gelirse, boncukları nazikçe pipetle tekrar askıya alın. Tutarlılık ve verimliliği artırmak için çok kanallı pipetleme önerilir. 8-şeritli tüpler kullanılırken, ConA boncuklarının kurumasını önlemek için tamponları birer birer çıkarıp değiştirin.
      1. Mıknatıs standını buzun üzerine koy.
      2. 4 °C kuluçkadan 8 şeritli tüpleri çıkarın ve sıvı toplamak için hızlıca döndürün.
      3. Lambaç temizlenene kadar mıknatıs standına tüpler yerleştirin. Dikkatlice pipet yapın ve süpernatantı çıkarın.
      4. Tüpleri mıknatıs standında tutun. Tüpleri 200 μL soğuk hücre permeabilizasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Süpernatantı çıkarmak için pipet.
      5. Mıknatıs standından tüpleri çıkarın ve her reaksiyona hemen 50 μL soğuk hücre permeabilizasyon tamponu ekleyin. Hücreleri/boncukları yeniden süslemek için nazikçe pipetle.
      6. Her reaksiyona 2,5 μL pAG-MNaz ekleyin ve nazikçe pipetle karıştırın.
      7. Reaksiyonları RT'de 10 dakika kuluçka edin.
      8. Tüpleri hızlıca döndürün, tekrar mıknatıs standına yerleştirin, çamur geçene kadar. Süpernatantı çıkarmak için pipet.
      9. Tüpleri mıknatıs standında tutarak, tüpleri 200 μL soğuk Hücre Permeabilizasyon Tamponu ile iki kez yıkayın. Süpernatantı çıkarmak için pipet.
      10. Tüpleri mıknatıs standından çıkarın, 50 μL soğuk hücre permeabilizasyon tamponu ile nazikçe yeniden süzülün. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
    2. Hedefli kromatin sindirimi ve salınımı
      NOT: 0 °C'de Ca2+ bağımlı sindirim uygulayarak erişilebilir DNA12'nin istenmeyen MNaz parçalanmasını en aza indirin. Escherichia coli (E. coli) gibi spike-in DNA'sını da ekleyin; böylece toplam dizileme13'ün yaklaşık %0,5-5'ini (ideal olarak ~%1) temsil eder. Spike-in DNA, dizileme derinliğini normalleştirmek için kullanılır ve özellikle bir serideki örnekler karşılaştırılırken, örneğin, histon modifiye edici enzimlerin inhibisyonu veya genetik silinmesinden sonra küresel histon modifikasyon değişikliklerini değerlendirirken.
      1. 8 tüplü şeritte (3.2.1.10. adımdan itibaren) buz üzerinde her reaksiyona 1 μL 100 mM Kalsiyum Klorür ekleyin. Boncukları tamamen yeniden asmak ve verimli sindirim sağlamak için nazikçe pipet yapın.
      2. Tüpleri 4 °C'de 2 saat boyunca kübeceğe dönüştürün, kapaklı uçlar yukarı kaldırın.
      3. Yeni bir 1.5 mL tüpte Stop Buffer Mix'i hazırlanır. Her reaksiyon için, 33 μL Stop Buffer ile 1 μL E. coli spike-in DNA (0,5 ng) birleştirin. Nazikçe vortex ile karıştırın.
      4. 2 saatlik kuluçkanın sonunda her reaksiyona 33 μL stop buffer ekleyin. Nazik pipetle karıştırın.
      5. Reaksiyonları termosiklde 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
      6. İçeriği alt kısımdan toplamak için hızlı spin tüpleri kullanın, ardından çözelti berrak olana kadar bir mıknatıs rafına yerleştirin.
      7. CUT&RUN tarafından salınan DNA'yı içeren yaklaşık 84 μL süpernatantı dikkatlice taze 1.5 mL tüplere aktarın.
    3. DNA Arıtma Kiti kullanılarak DNA arıtma (bkz. Materyaller Tablosu)
      NOT: İlk kullanımdan önce, DNA Bağlama Tamponuna 6.9 mL izopropanol ekleyin ve DNA Yıkama Tamponuna %95 etanol ≥ 20 mL ekleyin.
      1. Her toplanan süpernatana 420 μL DNA Bağlama Tamponu ekleyin. Kısa bir süreliğine iyice karıştırmak için vortex.
      2. Toplama tüplerine bir DNA Temizleme kolonu yerleştirin.
      3. Her örneği ilgili sütuna yükleyin.
      4. 16.000 × g ile 30 saniye RT'de santrifüj yapın. Akışı atın ve kolonu toplama tüpüne geri döndürün.
      5. Her kolona 200 μL DNA yıkama tamponu ekleyin ve RT'de 30 saniye boyunca 16.000 x g değerinde santrifüj yapın. Akışı atın ve kolonu toplama tüpündeki yerine koyun.
      6. Yıkama adımını bir kez tekrarlayın.
      7. Tekrar 16.000 x g ile 30 saniye RT'de santrifüj yapın, böylece kalan yıkama tamponu tamamen ortadan kaldırın.
      8. Kolonları etiketli 1.5 mL tüplere aktarın.
      9. 12 μL Elution Buffer'ı doğrudan kolonun merkezindeki membrana uygulayın.
      10. RT'de 5 dakika kuluçka yapın, ardından 16.000 × g ile RT'de 1 dakika santrifüj yapın ve DNA elüasyonu elde edilir.
        NOT: Burası güvenli bir durak noktasıdır. Elütlenmiş DNA'yı ileride işlemek için -20 °C'de depolayın.
    4. CUT&RUN DNA nicelleştirme ve parça boyutu dağılım analizi
      NOT: DNA'yı dsDNA Yüksek Duyarlılık Test Kiti ile Fluorometre kullanarak nicelikle ölçün; bu cihaz, çift zincirli DNA'nın absorbans tabanlı yöntemlere göre daha doğru ölçümlerini sağlar.
      1. Her örnekten 1 μL kullanılarak dsDNA Yüksek Duyarlılık Analiz Kiti kullanılarak CUT&RUN DNA konsantrasyonu belirlenir ( bkz. Materyal Tablosu).
      2. Bölünmüş parçaların varlığını ve boyut dağılımını değerlendirmek için ek 1 μL DNA kullanın. Üreticinin yönergelerine (isteğe bağlı) uygun olarak Yüksek Duyarlılık DNA Kiti ( bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak parça analizi yapmak
        NOT: Bu adımda yüksek bol bulunan bağlanma proteinleri, örneğin histon post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) kolayca tespit edilebilir. Ancak, düşük bolluklu transkripsiyon faktörleri tespit edilmesi daha zor olabilir.
    5. Kütüphane yapısı, parça analizi ve dizileme
      NOT: dsDNA Yüksek Duyarlılık Test Kiti nicel olarak belirlenen toplam CUT&RUN DNA'sı ≤CUT&RUN yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanelerinin inşasında kullanılan toplam CUT&RUN DNA'sı kullanılmıştır. Adaptör dimerlerini en aza indirmek için, adaptör ligasyonu için Illumina'dan 1 μL'ye indirin. Kütüphane inşası sırasında PCR döngülerinin sayısı, giriş miktarı, kütüphane verimi ve çoğaltma oranına göre ayarlanabilir. Hedef-histon PTM'lerine veya transkripsiyon faktörlerine bağlı olarak farklı DNA arıtma Manyetik Boncuklar ( bkz. Malzeme Tablosu) boyut seçimi stratejileri kullanılabilir.
      1. Kütüphane yapımı, kit üreticisinin talimatlarına uygun olarak CUT&RUN kütüphane hazırlık kiti ( bkz. Materyal Tablosu) kullanılarak küçük değişikliklerle inşa edilmiştir. Kısaca, kütüphane hazırlığı için önerilen girdi olarak 5 ng CUT&RUN DNA'sı kullanıldı. 5 ng'den küçük DNA için, kütüphane hazırlığı için mümkün olduğunca çok kullanın. Her örnek için başarılı çoklamalı dizileme sağlamak için çift i5 ve i7 indeks primerleri kullanıldı.
        NOT: Burası güvenli bir durak noktasıdır. DNA, daha fazla işlem için -20°C sıcaklıkta depolanabilir.
      2. CUT&RUN kütüphanesinin konsantrasyonunu bir florometre ve dsDNA Yüksek Duyarlılık Test Kiti ile ölçün. CUT&RUN NGS kütüphanelerinin boyut dağılımı, Yüksek Duyarlılık DNA Kiti Kılavuzu veya benzer bir kapiller elektroforez cihazı olan TapeStation (bkz. Materyal Tablosu) temelinde Yüksek Duyarlılık DNA Kiti (bkz. Materyal Tablosu) kullanılarak belirlendi.
        NOT: CUT&RUN kütüphanesini seyreltirerek konsantrasyonu dsDNA Yüksek Duyarlılık Test Kiti ve Yüksek Duyarlılık DNA Kiti tespit aralığına getirin.
      3. Havuz kütüphaneleri (40-46) eşit moleküler ve benzersiz indekslere dayanır. DNA arıtmasından sonra Manyetik Boncuklar boyut seçimi, havuzlanmış kütüphaneler için eşleştirilmiş uç dizileme (100 bp okuma uzunluğu) Illumina NovaSeq 6000 sisteminde yarım S-Prime (SP) için kütüphane başına tahmini 10 milyon okuma derinliğinde gerçekleştirildi.
    6. CUT&RUN veri analizi
      1. CUT&RUN verilerini özel bir boru hattı kullanarak analiz edin (Şekil 5A). FastQC ile okuma kalitesini değerlendirin. Cutadapt kullanarak okumaların başındaki adaptör dizilerini çıkarın. Eşleştirilmiş uç okumalarını insan genomuna (hg38) ve E. coli referans genomuna Bowtie2 ile hizalayın. Eşlenmemiş okumaları kaldırmak için Samtools kullanın. Picard ile tekrarlanan okumaları kaldırın ve Bedtools kullanarak bedGraph dosyaları oluşturun. DeepTools ile bigWig (bw) dosyaları oluşturun. Verileri IGV ve DeepTools kullanarak görselleştirin. Toplam okuma sayılarını spike-in E. coli okuma sayısına normalleştirin. SEACR (CUT&RUN için Seyrek Zenginleştirme Analizi)19 kullanarak tepe çağrısı gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tipik veya "klasik" SCLC NE hücre hatları, büyük çekirdekler, az sitoplazma ve yapışmaz agregalar veya süspansiyonda kompakt sferoidler olarak büyüme ile karakterize edilir. NCI-H146 ve DMS79 gibi ASCL1 yüksek hücre hatları ile NCI-H82 ve H446 gibi NEUROD1 yüksek hücre hatları, bu klasik SCLC fenotipini gösterir: az sitoplazma, ince granül kromatin ve ağırlıklı olarak yapışmayan agregatlar veya kompakt sferoidler olarak büyüme eğilimi olan küçük-orta boyutlu hücreler. NEUROD1 yüksek mode...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetik düzensizlik ve LDTF'ler, SCLC tümör biyolojisinin temeliticileridir 6. SCLC'de spesifik histon modifikasyonlarının ve DNA bağlayan proteinlerin genomik dağılımının belirlenmesi, edinilmiş terapötik direnç ve fenotipik plastisite mekanizmalarını ortaya çıkarabilir. CUT&RUN-seq, hücrelerden ve dokulardan yüksekçözünürlüklü 14 çözünürlükte histon ve histon dışı protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için güçlü bir yöntemdir. Bu pro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, NCI K08CA241309 (PI: Hui-Zi Chen), ACS IRG Ödülü (PI: Hui-Zi Chen) ve Amerikan Akciğer Birliği Akciğer Kanseri Keşif Ödülü (PI: Hui-Zi Chen) tarafından desteklenmiştir. Dizileme işlemi Linda T. ve John A. Mellowes Genomik Bilimleri ve Hassas Tıp Merkezi'nde gerçekleştirildi. Ayrıca, bu çalışmaya verdikleri görüş ve destek için tüm laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
reaktif
RPMI-1640 medya Gibco ThermoFisher Scientific11875093Hücre kültürü ortamı
Fetal Sığır Serumu (FBS)NöromikFBS002-HIHücre kültür ortamının bileşeni
%1 Penisilin-Sstreptomisin Gibco ThermoFisher Scientific15140122Hücre kültürlerinde bakteriyel kontaminasyonu önlemek için antibiyotikler
Trypan Blue Solution, %0,4Gibco ThermoFisher Scientific15250061Trypan Blue Boyama, otomatik hücre sayacı ile geçirgenliği değerlendirmek için kullanıldı. 
Roche cOmplete, EDTA'sız Proease Inhibitör KokteyliRoche11873580001Proteaz inhibitörü. Yıkama tamponu bileşenleri
%5 Digitonin EpiCypher21-1004Buffer bileşenleri  ve Buffer tarifi ise Buffer sayfasında bulunabilir
Boncuk aktivasyon tamponuEpiCypher21-1001Buffer bileşenleri  ve Buffer tarifi ise Buffer sayfasında bulunabilir
Concanavalin A (ConA) BoncuklarıEpiCypher21-1401KonA ile konjuge paramanyetik mikrosferler, lipid membran bağlanmasına izin veren lektin kaplı manyetik boncuklardır
CUT& RUN Kit CUTANA ChIC EpiCypher14-1048CUT& için reaktifler RUN DNA üretimi
DNA Arıtma KitiCUTANA  EpiCypher14-0050ReactIon'daki süpernantanttaki salınan hedefli DNA parçalarından DNA çıkar
CUT& RUN Kütüphane Hazırlık KitiCUTANA EpiCypher14-001Generate the CUT& RUN yeni nesil dizileme (NGS) kütüphaneleri
  DNA arıtma Manyetik BoncuklarAgencourt AMPure XP Beckman CoulterA63880PCR üretim temizliği ve boyut seçimi (örneğin adaptör dimer ve primer çıkarma)
E. coli Spike-in DNA'sıEpiCypher18-1401Bir dizi örnek boyunca dizileme okumalarını kalibre etmek için dışsal bir spike-in olarak kullanılmıştır— örneğin, tedavi edilenle tedavi edilmemiş durumlar arasında
pAG-MNaseEpiCypher  15-1016Birincil antikora bağlandığında, enzim kalsiyum tarafından aktive edildiğinde hedeflenen DNA parçasını bağlı proteinin her iki tarafında parçalar
PBS PH7.4 1xGibco (Termo Balıkçı Bilimci)10010-049Yıkama hücreleri
Ön Yıkama TamponuEpiCypher21-1002Buffer bileşenleri  ve Buffer tarifi ise Buffer sayfasında bulunabilir
dsDNA Yüksek Duyarlılık  Test KitiQubitTM Thermo Fisher ScientificQ32854CUT& RUN DNA nicelik
Stop BufferEpiCypher21-1003Buffer bileşenleri  ve Buffer tarifi ise Buffer sayfasında bulunabilir
Yüksek Duyarlılıklı DNA Kiti Agilent Technoligies5067-4626CUT& RUN DNA ve NGS kitapçıkları kuatifikasyonu ve parça boyutu dağılımı analizi
Malzeme
8-şerit 0.2 mL PCR tüpleriEpiCypher10-0009kCUT& için tüpler RUN reaksiyonları, 0.2 ml tüpler Manyetik Ayırma Rafı ile uyumlu
LUNA 8 kanallı slaytlarLogos BioSystems INCL72001Hücre sayımı için slaytlar,   Hücre yaşamlılığı ve bütünlüğü kontrolü
Çok kanallı reaktif rezervuarıFisher Scientific14-387-072Yıkama tampon kabı
DynaMagTM-2 (Manyetik ayırma rafı), 1.5 mL tüplerThermo Fisher Scientific12321DConA boncukları, manyetik ayırma rafı ile depolama tamponundan izole edilmiş ve ardından 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aktivasyon tamponunda yeniden süspansiyon yoluyla aktive edilmiştir.
Manyetik Ayırma Rafı, 0.2 mL tüplerEpiCypher10-0008Ayrılmak için stand  boncuk bağlayan hücreler, antikorlar, reaksiyon ve yıkama tamponlarından pAG/MNaz.
Eppendor Research artı 8-kanallı pipet, 0.5-10 uL Eppendorf3125000010Aspiration 8-şeritli tüplerin örnekleri  İş akışını hızlandırmak için, benzer çok kanallı pipetör
Eppendorf Refrence 2 8 kanallı pipet, 30-300 uLEppendorf4926000050İş akışını hızlandırmak için aspirasyon ve yıkama adımları, karşılaştırılabilir çok kanallı pipetör
Ekipman
Scientific Industries Vortex-Genie 2 Mikser, Değişken hız, 120VFisher Scientific50-728-002Min-santrifüj ve spin
LUNA FX7 Otomatik hücre sayacıLogos BioSystems INCL70001Hücre Sayacı
Nutatif MikserVWR82007-202Boncuk kuluçka aşamaları (gece boyunca antikor kuluçkası, pAG-MNaz sindirim reaksiyonu).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Termal CyclerEppendorf6331CUT& RUN yeni nesil kütüphane inşasını
Qubit 4 FluorometreThermo Fisher ScientificQ33226DNA nicelik belirleme.
Agilent 2100 BiyoanalizörüAgilent TeknolojileriG2939ACUT& için parça boyutu, konsantrasyon analizi RUN DNA ve CUT& RUN kütüphaneleri,  karşılaştırılabilir kapiler elektroforez cihazı (örneğin Agilent TapeStation)
Agilent TapeStationAgilent TeknolojileriG2992AACUT& için parça boyutu, konsantrasyon analizi RUN DNA ve CUT& RUN kütüphaneleri
Illumina NovaSeq 6000 sistemi  Illumina, San Diego, CA, ABDBirleştirilmiş CUT& dizileme RUN kağızlar 

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications-cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  4. Wang, Y., et al. STAT3 facilitates super enhancer formation to promote fibroblast-to-myofibroblast differentiation by the analysis of ATAC-seq, RNA-seq and ChIP-seq. J Cell Mol Med. 29 (11), e70639(2025).
  5. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol. 20 (1), 245(2019).
  6. Takumida, H., et al. Integrative epigenome and transcriptome analyses reveal transcriptional programs differentially regulated by ASCL1 and NEUROD1 in small cell lung cancer. Oncogene. 44 (34), 3113-3125 (2025).
  7. Sivakumar, S., et al. Integrative analysis of a large real-world cohort of small cell lung cancer identifies distinct genetic subtypes and insights into histologic transformation. Cancer Discov. 13 (7), 1572-1591 (2023).
  8. Rudin, C. M., et al. Author correction: Molecular subtypes of small cell lung cancer: A synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 19 (7), 415(2019).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  10. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  11. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, e21856(2017).
  12. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  13. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife. 8, e46314(2019).
  14. Custers, S., et al. Cleavage under targets & release using nuclease (CUT&RUN) protocols for the study of genetic and epigenetic regulation in cancer. Methods Mol Biol. 2944, 207-225 (2025).
  15. Hainer, S. J., Boskovic, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329.e11 (2019).
  16. Marroquin-Rivera, A., et al. Immune-related transcriptomic and epigenetic reconfiguration in BV2 cells after lipopolysaccharide exposure: An in vitro omics integrative study. Inflamm Res. 73 (2), 211-225 (2024).
  17. Huang, H., et al. Deciphering the role of histone modifications in memory and exhausted CD8 T cells. Sci Rep. 15 (1), 17359(2025).
  18. De Sarkar, N., et al. Nucleosome patterns in circulating tumor DNA reveal transcriptional regulation of advanced prostate cancer phenotypes. Cancer Discov. 13 (3), 632-653 (2023).
  19. Roberti, A., Fraga, M. F. Epigenomic profiling of histone posttranslational modifications in frozen cancer tissue using CUT&RUN. Methods Mol Biol. 2930, 229-243 (2025).
  20. Black, J. B., et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 33 (9), 108460(2020).
  21. Augert, A., et al. Small cell lung cancer exhibits frequent inactivating mutations in the histone methyltransferase KMT2D/MLL2: CALGB 151111 (Alliance). J Thorac Oncol. 12 (4), 704-713 (2017).
  22. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  23. Yang, Y., et al. H3K9me3 involved in FOXL2 regulation of SerpinE2 expression to affect steroid hormone synthesis in follicular granulosa cells. FASEB J. 39 (12), e70730(2025).
  24. Panday, A., Elango, R., Willis, N. A., Scully, R. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 3 (3), 101529(2022).
  25. Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease. J Vis Exp. (180), e63536(2022).
  26. Hsieh, T. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Mol Cell. 78 (3), 539-553.e8 (2020).
  27. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CUT and RUNKromatin Yeniden D zenlenmesiN roendokrin H cre HatlarH3K4me3 ProfillemeH3K4me1 EnhancerYeni Nesil DizilemeE2F7 Transkripsiyon Fakt r

İlgili makaleler