Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Glioblastomada AKT/Wnt/β-katenin Yolunun Düzenlenmesi ve Kurkumin ile Kuproptozun Indüksiyonu

653 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

27 Ocak 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

Bu makalede

Özet

Kurkumin (CUM), AKT/Wnt/β-katenin eksenini baskılayarak cuproptozu indükleyerek glioblastoma (GBM) ilerlemesini indikler. Bu protokol, CUM'un GBM'de malign ilerlemeyi engellemesinin moleküler mekanizmasını inceler ve CUM'un bu yolu modüle ederek cuproptozu nasıl indükettiğini değerlendirme yöntemlerini tanımlar.

Özet

Kurkumin (CUM), glioblastomanın (GBM) kötü hutlu davranışını düzenleyebilir. Bu çalışma, CUM'un AKT/Wnt/β-katenin sinyal yolu aracılığıyla cuproptozu indükleyerek GBM ilerlemesini bastırıp bastırmadığını araştırmaktadır. Optimal kurkumin konsantrasyonları MTT testi kullanılarak belirlendi. A172 ve U251 hücreleri CUM, AKT inhibitörü MK-2206, Wnt inhibitörü LGK974 ve Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl2) ile tedavi edildi. Hücre çoğulama, göç, istila ve apoptoz, sırasıyla karboksifloressein süksinimidil amin ester boyama, çizik testleri, Transwell testleri ve akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. MitoSOX floresans, deniz atı metabolik analizi, immünoflüosans, Cu2+ tespiti ve Western blotlama mitokondriyal oksidatif stres ve cuproptozu değerlendirmek için kullanıldı. AKT/Wnt/β-katenin ekseni, TCF/LEF1 haber kiti ve western blotting kullanılarak analiz edildi. GBM ksenograft modeli oluşturuldu ve CUM beş hafta boyunca gavaj ile uygulandı. CUM etkileri tümör büyümesi, kuproptoz ve AKT/Wnt/β-katenin yolu protein ekspresyonu üzerinde değerlendirildi. Hücreler in vitro 10 μM ve 20 μM CUM ile tedavi edildi. CUM tedavisi, çoğu, göç ve istilayı azaltırken, oksidatif stres ve cuproptozu teşvik etmiştir. CUM ayrıca Wnt/β-katenin sinyal aktivitesini bastırmıştır. Yol inhibisyonu, reaktif oksijen türlerini (3,7 kat) ve Cu2+ (3,1 kat) seviyelerini artırdı, dihidrolipoamid asetiltransferaz ekspresyonunu azaltarak kötü huylu davranışı engelledi. Çıplak farelerde CUM tümör büyümesini önemli ölçüde azaltmış, cuproptozu teşvik etmiş ve AKT/Wnt/β-katenin ekseninin aktivasyonunu engellemiştir. Sonuçlarımız CUM'un AKT/Wnt/β-katenin sinyalini baskıladığını, cuproptozu teşvik ettiğini ve GBM ilerlemesini etkilediğini göstermektedir.

Giriş

Glioma, merkezi sinir sisteminde (MSS) en yaygın birincil intrakraniyal malign tümördür.1. 4. derece glioma genellikle glioblastoma (GBM) anlamına gelir ve kötüprognoz 2'yi içerir. GBM, yoğun bir beyin tümörü olup, MSS malignitelerinin neredeyse %50'sini oluşturur ve medyan hayatta kalma süresi 1yıldan 3 yıldan azdır. Yüksek malignitesi ve yüksek yeksoranı 4,5 ile bilinir. Şu anda GBM tedavi stratejileri öncelikle cerrahiye dayanır ve radyoterapi, kemoterapi ve diğer kapsamlı tedavi yöntemleriyledesteklenir. İmmünoterapi, biyoterapi ve nanotıp gibi yeni terapötik stratejiler preklinik çalışmalarda dikkat çekici sonuçlar eldeetmiş olsa da, genel 5 yıllık sağlık oranı sadece %4,3 olarak kalmaktadır9. En yaygın kullanılan kemoterapi rejimi, ünlü Stupp rejimidir; ancak, metilelenmemiş MGMT'li GBM hastalarda genel sağkalım oranı anlamlı şekilde uzanamaz10. Bu nedenle, yeni tedavi stratejilerinin keşfedilmesi, hastaların hayatta kalma süresini uzatmada kilit öneme sahiptir. Bu araştırma, GBM'de kurkuminin (CUM) antikanser mekanizmasının cuproptozu içerdiğini öne sürmektedir.

Anormal bakır metabolizması veya bakır kaynaklı hücre hasarı bir dizi hastalığa yol açabilir11. Geleneksel redoks koşullarında, indirgenmiş Cu+ Cu2+ olarak oksitlenebilir. Tsvetkov ve ark. daha önce keşfedilmemiş bakır kaynaklı hücre ölümü mekanizması olan cuproptoz adını bulmuştur. Cu2+ iyonları asillenmiş bileşiklere bağlanır ve ardından Fe-S küme proteinlerinin ekspresyonu aşağı düzenlenerek hücreölümüne neden olur 12,13. Kapsamlı araştırmalar, cuproptozun tümörlerin patofizyolojik süreciyle yakından ilişkiliolduğunu doğrulamıştır 14,15. Cuproptozla ilişkili lncRNA'lar ve genler, GBM prognozu ve tedavisi için potansiyel biyobelirteçleritemsil eder 16. BCMD, Cu2+ salgılayabilir, kuprotozu indükleyebilir ve GBM17'yi tedavi etmek için immünojenik hücre ölümünü tetikleyebilir. Bu nedenle, cuproptozun GBM tedavisi için yeni bir hedef olarak kullanılabileceğine inanıyoruz. Ancak, mevcut sistemlerin çoğu Elesclomol-Cu gibi sentetik taşıyıcılara veya yüksek konsantrasyonlu bakır iyonların doğrudan indüksiyonuna dayanır. Bu dışsal ve radikal müdahale cuproptoz kavramını kanıtlayabilse de, fizyolojik korelasyon ve hedefleme eksikliği nedeniyle klinik dönüşüm olanakları sınırlıdır. Bu nedenle, GBM'nin kuproptozunu endojen ve doğru şekilde düzenleyebilecek ve üst akış sinyal mekanizmasını aydınlatabilecek doğal veya küçük moleküllü bileşiklerin araması, bu yeni mekanizma ile klinik tedavi arasında önemli bir köprü haline gelmiştir.

Çin tıbbı, anti-tümör ilaç araştırmaları için değerli bir kaynak olarak geniş çapta kabul edilmiştir. CUM, geleneksel Çin tıp zerdeçalından ekstraksiyona alınan polifenolik bir maddedir. Modern farmakoloji, antioksidasyon, antiinflamatuar ve antitümör işlevleri olduğunu doğrulamıştır. CUM'un birçok antitümör aktivitesi vardır. GBM hücrelerinin aktivitesini apoptoz, çok moleküler yol bozulması ve diğer mekanizmaları teşvik ederekazaltabilir. In vitro deneyler, düşük dozlu CUM'un ışınlanma ile birleştiğinde antiGBM proliferasyonunu sinerjik olarakartırabileceğini göstermiştir19. Ayrıca, CUM, GBM ile ilgili çekirdek yolları düzenleyebilir; bunlar arasında MAPK20 de bulunur. Geleneksel temozolomid (TMZ) kemoterapisine kıyasla CUM benzersiz terapötik avantajlar gösterir. Temozolomid'in etkinliği genellikle GBM'deki güçlü DNA onarım mekanizmalarıyla sınırlıdır ve bu da ilaç direncine yol açar; CUM'un mitokondriyalmetabolizmayı hedefleyerek cuproptozu neden oluşturduğu mekanizma TMZ'den bağımsızdır. CUM, sadece cuproptozla ilgili metabolik süreçleri düzenlemekle kalmaz, aynı zamanda GBM ilerlemesiyle ilgili birden fazla ana sinyal yoluna müdahale edebilir; bu da tek tedavilerin sınırlamalarını aşmak ve birleşik tedavi stratejileri geliştirmek için potansiyel yollar sunar. Bu çalışmada kullanılan CUM konsantrasyon aralığı (10-20 μM), preklinik tedavi çalışmalarında bildirilen etkili konsantrasyonlarlatutarlıdır 23. CUM'un doğal düşük ağız biyoyararlanımı ve kan-beyin bariyeri üzerinden ulaşım verimliliği pratik uygulamalarda temel zorluklar olsa da, ortaya çıkan nano-dağıtım sistemleri ve hedefe yönelik modifikasyon stratejileri bu darboğazı aşmak için umut vaat eden çözümlersunmuştur 24.

GBM'de CUM'un proapoptotik, antiproliferatif ve göçü engelleyen etkileri birçok çalışmadabildirilmiş olsa da mevcut araştırmaların çoğu, geleneksel apoptoz veya otofaji yolları üzerindeki etkilerine odaklanmıştır. Bu çalışma, CUM'un cuproptozu düzenleyerek GBM'nin kötü huylu ilerlemesini engelleyip engellemediğini netleştirmeyi amaçlamaktadır. CUM'un kısmen AKT/Wnt/β-katenin eksenini baskılayarak cuproptozu indükleyip oluşturup oluşturup GBM'yi bastırıp bastırmayacağını araştırdık. Buna dayanarak, bu çalışma GBM tedavisini iyileştirmek ve GBM tedavisinde yeni hedefler geliştirmek için CUM için deneysel temeller sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının insancıl bakımı ve kullanımı için belirlenmiş kurumsal standartlara uygun şekilde gerçekleştirildi ve kurumsal Hayvan Etik Komitesi tarafından resmi olarak onaylandı. Hayvanların rahatsızlık ve sıkıntısını mümkün olduğunca azaltmak için önlemler alındı.

Kimyasal bileşikler, boyalar ve biyolojik örneklerle ilgili çalışmalar, potansiyel riskleri azaltmak için yerleşik biyogüvenlik uygulamalarına uyuldu. Paraformaldehit, bakır bazlı reaktifler ve DHE dahil olmak üzere potansiyel tehlikeli maddeler, eldiven, yüz maskesi ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla ele alındı. Harcanmış reaktifler ve kirlenmiş tek kullanımlık ürünler gibi tüm atık malzemeler, belirlenmiş biyolojik tehlike kaplarına ayrılmış ve kurumsal ve çevresel güvenlik düzenlemelerine uygun olarak yetkili tehlikeli atık yönetim hizmetleri tarafından muamele edilmiştir. Genel deneysel tasarım Şekil 1'de özetlenmiştir.

Şekil 1
Şekil 1: Bu çalışmanın iş akışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre kültürü ve gruplanması
Normal insan beyni astrositleri (NHA) ve glioblastoma hücre hatları A172, U251, LN229 ve SHG-44 ( bkz. Materyal Tablosu), %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren DMEM ortamında kültürlendi ve %5 CO₂ ile 3 °C sıcaklıkta inkübatörde tutuldu. Medya her iki günde bir değiştirildi ve hücreler yaklaşık %80 birleşime ulaştıklarında geçiş yapıldı. CUM için uygun doz ve maruziyet süresi MTT testi kullanılarak belirlendi. NHA, A172, U251, LN229 ve SHG-44 hücreleri, sırasıyla 24, 48 ve 7 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda (0, 2.5, 5, 10, 20 ve 4 μM) CUM ile işlendi;bu da sırasıyla 23 oldu. Daha sonra 2 μL MTT çözeltisi eklendi. h sonrası, her kuyuya 15 μL dimetil sülfoksit eklenip nazikçe karıştırıldı. 45 nm'de optik yoğunluk (OD) mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Tüm deneylerde negatif kontrol olarak tedavi edilmemiş hücreler (Kontrol grubu) kullanıldı.

A172 ve U251 hücreleri tohumlanarak tedavi koşullarına göre Kontrol, CUM düşük dozlu (1 μM), CUM yüksek dozlu (2 μM), AKT inhibitörü (MK-2206), AKT inhibitörü + Wnt inhibitörü (MK-2206 + LGK974) ve Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂) tedavi koşullarına göre ayrıldı. CUM gruplarındaki hücreler 4 saat boyunca 10 veya 2 μM CUM ile tedavi edildi. MK-2206 grubundaki hücreler 2 saat boyunca 1 μM MK-2206 aldı. MK-2206 + LGK974 grubundaki hücreler, MK-2206 maruziyetinden sonra saat boyunca μM LGK974 ile tedavi edildi. Elsm-Cu grup hücreleri 100 nM Elesclomol ve μM CuCl₂ ile 4saat 14 boyunca tedavi edildi.

Akış sitometrisi
Her gruptaki kültürlenmiş A172 ve U251 hücreleri, 1 μg/mL PI boyama çözeltisi içeren PBS ile 1 dakika kuluçka edildi. Hücreler daha sonra %0,25 tripsin ile işlendi ve santrifüjle (20 × g, en oda sıcaklığında) toplandı. PI-pozitif hücreler, PE kanallı bir akış sitometresi kullanılarak (uyarılma 488 nm) tespit edildi ve hücre ölümoranı 27 hesaplandı.

Karboksifloressein süksinimidil amin ester (CFSE) testi
A172 ve U251 hücreleri, karanlıkta 1 dakika boyunca 3 °C'de μmol/L CellTrace CFSE boyası ile kuluçka edildi. Daha sonra ortam nötralize edildi ve hücreler oda sıcaklığında minimum 20 × g ile santrifüjlendi. Toplandıktan sonra hücreler gruplarına göre kültürlenip muamele edildi. CFSE floresans yoğunluğu, akış sitometrisi (488 nm'de uyarılma) kullanılarak analiz edildi27.

Hücre klon oluşum testi
Kültüre alınan A172 ve U251 hücreleri sindirildi, yeniden süzüldü ve sayıldı. Hazırlanan hücre süspansiyonundan iki mililitre eklendi. Nazik karıştırmadan sonra hücreler yaklaşık 14 gün kuluçka altına alındı. Hücreler daha sonra %4 paraformaldehit ile 3 dakika sabitlendi ve fiksatif atıldı. %0,1 kristal violet ile boyadıktan sonra. Koloni görüntüleri çekildi ve klon oluşumoranı 14 olarak hesaplandı.

Hücre çizik testi
A172 ve U251 hücreleri (1 × 106 hücre/kuyruk) %90 birleşimine ulaşana kadar kültürlendi. Hücre monotabakası, steril 2 μL uçla bir kez çizilerek yara oluşturuldu ve ardından h ve 48 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda CUM ile işlendi. Görüntüler mikroskop kullanılarak çekildi. Çizik iyileşme oranı ImageJ yazılımı kullanılarak değerlendirildi. Görüntüler 8 bit formatına dönüştürüldü, çizik alanını hücre alanından ayırt etmek için birleşik bir eşik belirlendi ve 0 saat ile 48 saatlik çizik alanları Parçacıkları Analiz Fonksiyonu kullanılarak hesaplandı. Çizik iyileşme oranı (%) = (0 saat mesafe − 48 saat mesafe) / 0 saat mesafe × %10023.

Transwell deneyi
A172 ve U251 hücreleri belirlenen işlemlere maruz kaldı, ardından enzimatik olarak ayrılarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g üzerinde santrifüj edildi. Hücreler serumsuz ortamda yeniden süspansiyona alındı. Matrijel, serumsuz ortamda 1:8 oranında seyreltildi, iyice karıştırıldı ve 5 μL Transwell insertinin üst odasına uygulandı, ardından 4 saat kuluçka yapıldı. Üst odaya toplamda 5 × 104 hücre kuyu başına eklenmiş, alt odaya ise %20 FBS takviyesi olan 60 μL ortam yerleştirilmiştir. 48 saatlik kuluçkadan sonra, hücreler paraformaldehit kullanılarak sabitlenip kristal menekşe ile boyandı. Her kuyunun merkezi ve çevresinden beş görsel alan seçildi. Hücreler mikroskop altında gözlemlenip görüntülendi. İnvaziv hücreler ImageJ kullanılarak hesaplandı. Görüntüler 8-bit formatına dönüştürüldü, lekelenmiş hücreleri arka plandan ayırt etmek için eşikler uygulandı ve Parçacıkları Analiz Etme fonksiyonumembrandan geçen hücreleri saydı 23.

Mitokondriyal zar potansiyeli (MMP) tespiti
Her gruptaki kültürlenmiş A172 ve U251 hücreleri, karanlıkta 30 dakika boyunca mL JC-1 çalışan çözeltisi ile inkübe edildi. Hücreler, önceden soğutulmuş JC-1 tamponu ile nazikçe yıkanmış, gözlemlenmiş ve floresans mikroskobu ile fotoğraflanmıştır. 488 nm uyarılma kullanılarak, JC-1 polimer ve monomer sinyalleri sırasıyla 590 nm ve 530 nm emisyon filtreleri kullanılarak toplandı. Kırmızı/yeşil floresans oranı (JC-1 agregaları monomerlere karşı) ImageJ yazılımı kullanılarak MMP değişikliklerini değerlendirmekiçin analiz edildi 28. Kırmızı ve yeşil kanalların görüntüleri ayrı ayrı çıkarıldı ve aynı bölgedeki ortalama floresans yoğunluğu nicelendirildi.

Oksijen tüketim oranı (OCR) tespiti
Kültüre alınmış A172 ve U251 hücreleri tohumlanmıştır. Plaka, adaptasyon için 3 °C sıcaklıkta önceden ısıtılmış bir analizöre yerleştirildi. Uyarlandıktan sonra, belirleme ortamı eklendi. Otomatik kalibrasyondan sonra, plaka 3 °C'de 15-2 dakika boyuncaCO2 olmadan dengelendi. Temel OCR ölçüldü ve analiz programı, mitokondriyal OCR'yi belirli aralıklarla kaydedecek şekilde ayarlandı. Veriler sonraki analiz için dışaaktarıldı 28.

MitoSOX floresan prob reaktif oksijen türlerinin (ROS) tespiti
A172 ve U251 hücreleri 1 ×10 4 hücre/mL yoğunluğuna ayarlandı ve her kuyu başına 1 mL konfokal tabağa tohumlandı, ardından ilaç müdahalesi gerçekleştirildi. Hücre süpernatantı atıldı ve 1 mL seyreltilmiş MitoSOX probu (1:1.000) eklendi. Hücreler karanlıkta 3 °C'de 1 dakika kuluçka altına alındı. Floresans sinyali, mitokondriyal ROSseviyeleri 29 değerlendirmek için floresans mikroskobu (uyarılma/emisyon: 510/580 nm) kullanılarak yakalanmıştır.

İmmünoflüoresans
Kapak kapakları bir kez DMEM kültür ortamıyla yıkandı. Daha sonra hücre tohumlanması ve ilaç müdahalesi için altı kuluklu plakalara yerleştirildi. 24 saat sonra, hücreler %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve ardından %5 sığır serum albümini (BSA) ile 30 dakika bloklandı. Bloklayıcı çözelti çıkarıldı, dihidrolipoamid asetiltransferaz (DLAT) ve β-katenin hedefleyen seyreltilmiş primer antikorlar uygulandı, ardından °C30'da gece boyunca kuluçka yapıldı. Fluoresans olarak işaretlenmiş ikincil antikorlar daha sonra 3 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. Hücre çekirdekleri DAPI ile karşı boyanmış ve slaytlar antifade reaktifiyle monte edilmiştir. Floresans görüntüleri floresans mikroskobu kullanılarak alındı ve sinyal yoğunluğu ImageJ yazılımıyla nicelendirildi. Görüntüler 8 bit formatına dönüştürüldü ve hedef sinyalleri arka plan gürültüsünden ayırt etmek için tutarlı bir eşik uygulandı. Dikdörtgen aracı istenen hücre bölgelerini seçmek için kullanıldı ve ortalama floresans yoğunluğu27 ölçüldü. Mitokondrileri görselleştirmek için hücreler 30 dakika boyunca 20 nM MitoTracker Red CMXRos ile işlendi ve ardından paraformaldehit30 ile sabitlendi.

TCF/LEF1 luciferase reporter kiti
A172 ve U251 hücrelerinde Wnt/β-katenin aktivasyonu, TCF/LEF1 lusiferaz raporlayıcı kiti kullanılarak değerlendirildi. TCF/LEF raporlayıcı vektör, bir TATA kutusu ve T hücre faktörü/lenfoid güçlendirici faktör (TCF/LEF) yanıt elemanları içerir; bu da yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonuyla β-katenin transkripsiyon aktivitesinin dolaylı olarak tespit edilmesini sağlar. Kültürlenmiş A172 ve U251 hücreleri, 5 ng TCF/LEF raporlayıcı vektörüyle ters transfekte edildi. Transfeksiyondan on altı saat sonra, floresans yoğunluğu mikroplaka okuyucu kullanılarak uyarılma ve emisyon ayarları sırasıyla 488 ve 51 nm (31) olarak kaydedildi.

Tümör taşıyan fareler
On erkek BALB/c çıplak fare (7 haftalık, 2 ± 2 g) belirli patojensiz koşullarda (2 °C, %65 nem) standart yemek ve suya sınırsız erişimle tutuldu. Tüm işlemler, Yangtze Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylandı (No 2023092; onay tarihi: 18.10.2023).

GBM ksenograft modeli oluşturmak için, A172 hücreleri (4 ×10 6 hücre/mL) serumsuz ortamda askıya alındı ve her farenin sağ yanına deri altı olarak 0,1 mL enjekte edildi. Hayvanlar rastgele olarak ya bir Kontrol grubuna ya da bir CUM tedavi grubuna (n = 5 kişi) atandı. CUM grubu oral garaj yoluyla günlük 60 mg/kg kurkumin alırken, Kontrol grubu eşit miktarda salin aldı. Tümör çapları vernier kaliper kullanılarak her 7 günde bir kaydedildi ve tümör hacmi 1/2 × uzunluğu ×genişliği 2 (mm3) formülü kullanılarak hesaplandı. 5 hafta sonra, fareler servikal dislokasyon ile ötenazi edildi ve tümörler steril koşullarda32 kilo ölçümü için alındı.

TUNEL testi
Tümör dokuları %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitlendi, etanolde kurutuldu, parafine gömülüp μm kalınlığında kesitlendi. Bölümler mumdan arındırıldı ve yeniden sıvılaştırıldı, PBS ile durulandı, antijen almak için 50 dakika boyunca proteinaz K ile işlendi ve %3 hidrojen peroksit ile kuluçka edildi. TUNEL reaksiyon karışımı 1 saat uygulandı, ardından antiifade reaktifiyle montaj yapıldı. Floresan görüntüleri mikroskopi ile alındı ve ImageJ yazılımı kullanılarak her alan başına TUNEL-pozitif hücreler nicelendirildi.

İmmünohistokimya
Parafinli tümör kesitleri 6 °C'de pişirildi, ksilenle mumdan arındırıldı ve derecelendirilmiş etanol serisi ile yeniden nemlendirildi. Antijen alımı, ısıtılmış EDTA tamponu kullanılarak gerçekleştirildi, ardından endojen peroksidaz aktivitesinin söndürülmesi yapıldı. Slaytlar, °C'de gece boyunca anti-Ki-67 birincil antikoru ile kuluçka edildi. İkincil bir antikorla 20 dakika kuluçka yapıldıktan sonra, bölümler 5 dakika diaminobenzidin (DAB) ile boyanmış ve hematoksilin ile karşı boyanmıştır. Susuz bırakıldıktan ve nötr reçine ile montaj yapıldıktan sonra, slaytlar mikroskop altında görüntülendi. Pozitif boyama kahverengi-sarı çökelti ile tanımlandı ve Ki-67 pozitif hücreler ImageJ27 kullanılarak nicelleştirildi.

Dihidroetidyum (DHE) floresans boyama
ROS seviyeleri DHE floresans boyama kullanılarak değerlendirildi. Donmuş tümör dokusu bölümleri PBS ile durulandı. Arka plan floresansı söndürüldü ve her bölüme 3 dakika boyunca μM DHE eklendi. PBS yıkamasından sonra bölümler karanlıkta kapandı. Floresans mikroskopla gözlemlendi (uyarılma/emisyon: 518/605 nm) ve her grup için beş rastgele görüntü toplandı. ImageJ ROS seviyelerini nicelendirmek için kullanıldı.

Cu2+ içerik algılama
GBM hücrelerinde ve tümör dokularındaki Cu2+ konsantrasyonu, kolorimetrik tespit kiti kullanılarak değerlendirildi. A172 ve U251 hücreleri, tedavi sonrası 1.500 × g'de 10 dakika °C'de santrifüj edildi. Hücre pelletleri 0. mL damıtılmış su, buz üzerinde soniklenerek tekrar santrifüjlendi. Tümör dokuları damıtılmış suda homojenleştirildi ve benzer şekilde 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edildi. Süpernatanlar (1 μL) 96 kuyu ölçüsünde bir plakaya aktarıldı, 23 μL kromojenik reaktifle karıştırıldı, kapatıldı ve 5 dakika kuluçka edildi. Optik yoğunluk (OD) mikroplaka okuyucu kullanılarak 58 nm olarak ölçüldü ve Cu2+ seviyeleri 14 olarak hesaplandı.

Western Blot (WB)
Proteinler, kültürlenmiş hücrelerden ve tümör dokularından izole edildi. Süpernatantlar, 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle elde edildi ve protein konsantrasyonları BCA testi kullanılarak nicelendirildi. Denatürasyondan sonra, örnekler SDS-PAGE ile ayrıldı, PVDF membranlarına aktarıldı ve 1 saat boyunca %5 yağsız sütle bloklandı. Zarlar TBST'de yıkanıp FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-katenin, p-β-katenin ve β-aktine karşı birincil antikorlarla °C'de gece boyunca inkübe edildi (bkz. Malzeme Tablosu)14,33. Ek TBST yıkamalarının ardından, zarlar 1 saat boyunca HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla kuluçka edildi, ECL reaktifi kullanılarak geliştirildi ve kemilyüminessans ile görselleştirildi. ImageJ yazılımı, Dikdörtgen seçim aracı ve Jels analiz fonksiyonu kullanarak sinyal yoğunluğunu nicelendirmek için kullanıldı. Göreli protein ekspresyonu, hedef bant gri değerinin iç kontrol (GAPDH) oranı olarak hesaplandı. A172 ve U251 hücrelerinden elde edilen nükleer özetler, nükleer protein çıkarma kiti kullanılarak hazırlanmıştır. β-katenin ve Lamin B1'in ekspresyonu değerlendirildi; Lamin B1 nükleer yükleme kontrol34 olarak hizmet verdi.

İstatistiksel analiz
Nicel sonuçlar, üç bağımsız replikasyonun ortalamasını yansıtır. Tüm veriler normal dağılım ve varyans homojenliği açısından değerlendirildi. Tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey'nin sonradan yaptığı test birden fazla grup arasında karşılaştırmalar için kullanıldı. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. 0.05'in altında olan bir P-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi. Bu prosedürler, verilerin güvenilirliğini sağlamak ve sonuçların güvenilirliğini desteklemek için kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GBM hücre canlılığının inhibisyonu ve indüklenmiş hücre ölümü
Birincisi, CUM müdahalesinden 2 saat, 48 saat ve 72 saat sonra NHA hücre canlılığında anlamlı bir değişiklik olmadı (Şekil 2A), bu da kullanılan CUM konsantrasyonlarının normal hücreler üzerinde toksik bir etkisi olmadığını gösteriyor. Buna karşılık, GBM hücre hatlarının (A172, U251, LN229 ve SHG-44) canlılığı 1 μM ≥ CUM konsantrasyonlarında (P < 0.05-0.001) anlamlı şekilde azalmıştır (Ş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

GBM'nin tekrarlanma oranı, kötü huylu biyolojik özellikleriyleilişkilidir 36. CUM, oksidatif stres, apoptoz, otofaji, metastaz, istila ve önemli moleküler hedefleri düzenleyerek anti-GBMetkileri uygular 37. Bu çalışmada, hücresel düzeyde deneyler, CUM'un GBM hücre ölümünü önemli ölçüde artırdığını ve çoğaltı, koloni oluşumu, göç ve istilayı engelleydiğini gösterdi — bu bulgular önceki raporlarlatutarlı 20.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, çıkar çatışmaları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Hiçbiri yok

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%0,1 kristal mor boyama çözeltisiServicebioG1014Etiketleme hücreleri
%4 paraformaldehitBeyotimeP0099Hücreleri veya dokuları düzeltin
AKT inhibitörü (MK-2206)Selleck.cn, Şanghay, ÇinS1078Özgül AKT inhibitörü
Antikorlar (birincil ve ikincil antikorlar)ABclonal Technology, Wuhan, Çin / abcam, Cambridge, Birleşik Krallık / Servicebio, Wuhan, Çin / Beyotime, Şanghay, Çin / Hücre Sinyalizasyonu, Danvers, MA, ABDA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Protein ifade seviyelerinin tespiti
Hücre apoptozu tespit kitiServicebio, Wuhan, ÇinG1021Apoptozun tespiti
Cell Trace CFSE boyasıInvitrogen, Carlsbad, CA, ABDC34570Hücre çorak algısı
Kemilyüminsans görüntüleme sistemiBio-Rad, Hercules, CA, ABDChemi Doc XRS+Proteinin ultra yüksek hassasiyetli tespiti
Cu2+ kolorimetrik test kitiElabscience, Wuhan, ÇinE-BC-K300-MTümör dokularında ve GBM hücrelerinde Cu2+ içeriğinin tespiti
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya751944Kuproptoz indükörü
Kurkumin (CUM)Şanghay kaynak sayfası, Şanghay, ÇinS19245Polifenolik bileşik
DHE tespit kitiBeyotime, Şanghay, ÇinS0063ROS seviyelerinin tespiti
Dimetil sülfoksit (DMSO)ServicebioG4101-2MTT testi için çözücü
ECL geliştiricisiServicebioG2161Western blot için kullanıldı
ElesclomolSelleck.cnS1052Kuproptoz indükörü
Akış sitometrisiBD Biosciences, New Jersey, ABDBD FACSAria IIIHücre ölümü ve CFSE testleri için kullanılır
Flüoresans mikroskobuOLYMPUS, Tokyo, JaponyaIX73İmmünoflüoresans, ROS, TUNEL, DHE ve MMP testleri için kullanılır
Glioblastoma hücre hatları A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) ve SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ÇinCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207İnsan glioblastoma hücre hatları
GraphPad Prism 9.0 yazılımıGraphPad Yazılımı, LLCSürüm 9.0İstatistiksel analiz
ImageJ 1.53k yazılımıUlusal Ruh Sağlığı EnstitüsüSürüm 1.53kİstatistiksel hesaplama
JC-1 çalışma çözümüSolarbio, Pekin, ÇinM8650MMP'nin Tespiti
Erkek BALB/c çıplak farelerSlack Kingda Laboratuvar Hayvan Şirketi, Ltd., Hunan, ÇinFare deneyi
Microplate okuyucuBio-Tek, Vermont, ABDELX-800OD450 nm değer ölçümü için
MikroskopOLYMPUSBX53Hücre çizik testi, Transwell deneyi ve immünohistokimya testleri için kullanılır
MitoSOX probuThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABDM36008ROS tespiti için kullanılıyor
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Canlı hücrelerde mitokondrilerin özel etiketlenmesi
MTT tespit kitiServicebioG4101-1Hücre yaşamının tespiti
Normal insan beyni astrositleri NHA hücreleri (RRID:CVCL_B0DK)Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ÇinHTX2408Kontrol deneyleri için hücre hattı
Nükleer protein çıkarma kitiBeyotimeP0027Nükleer protein ekstraksiyonu
Deniz atı hücresi enerji metabolizması analizörüAgilent,  Pekin, ÇinSeahorse XFOCR tespiti için kullanılıyor
TCF/LEF1 luciferase reporter kitiBiolab Technology Co., Ltd, Pekin, ÇinWnt/β-katenin sinyal yolunun aktivitesinin tespiti
TUNEL tespit kitiBeyotimeC1088Tümör dokularında apoptozun tespiti
Wnt inhibitörü (LGK974)Selleck.cnS7143Spesifik Wnt inhibitörü

Kaynaklar

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

KurkuminGlioblastomaAKT YolaWnt Beta KateninKuproptoz nd ksiyonuH cre ProliferasyonuH cre MigrasyonuMitokondriyal Oksidatif StresAk SitometrisiWestern BlotXenogreft Model

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.