Method Article

Değiştirilmiş İsviçre Roll Tekniği Kullanarak Fare Mide Kası Katmanlarının Geliştirilmiş Mekansal Haritalanması

DOI:

10.3791/69673

⸱

November 25th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare bağırsağı için geliştirilen "Swiss roll" tekniğinden modifiye edilmiş tüm mide bağışıklık boyama yöntemini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekânsal "omik" teknolojileri, mide nöromüsküler cihazının bireysel hücrelerinin doğal doku ortamlarında biyolojisini ve etkileşimlerini incelemek için eşi benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Ancak, bu yaklaşımların başarılı uygulanması ve fundus, korpus ile antrum üzerindeki yapısal ve moleküler farklılıkların değerlendirilmesi için tutarlı örnekleme ve doku yönelimi gereklidir. Burada, fare midesine özel olarak tasarlanmış modifiye edilmiş bir "Swiss roll" tekniğini rapor ediyoruz; bu teknik, tüm ana anatomik bölgelerin tek bir kriyoseksiyonda yerleştirilip görselleştirilmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, tekrarlanabilir yönelim ve kaliteye sahip kesitler oluşturmak için düz fiksasyon ve dikkatli konumlandırmayı vurgular. Bu çalışma ayrıca hücresel belirteçlerin yüksek kaliteli görselleştirilmesini sağlamak için immünoflüoresans boyama koşullarını optimize etti. Bu protokol, mide bölgelerinin kapsamlı ve yan yana karşılaştırılmasını sağlarken, doku kaybı ve deneysel değişkenliği en aza indirir. Doku korumasını ve mekansal yönelimi artırarak, bu yöntem hem fizyolojik hem de patolojik bağlamlarda mide biyolojisi inceleyen araştırmacılar için pratik ve ölçeklenebilir bir araç sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mide, özofagusu onikili1'e bağlayan karmaşık, J şeklinde bir organdır. Üç ana anatomik bölgeye ayrılır: fundus, korpus ve antrum1. Mide tunika muscularis'in her bölgesi, konaklama, uyum, gıda triturasyonu ve boşaltma gibi temel mide fonksiyonlarına katkıda bulunan farklı bir fizyolojik roloynar 1,2. Mide fizyolojisi ve patolojisindeki değişiklikleri incelemek, bu bölgelerin ve hücresel mimarilerinin ayrıntılı analizini gerektirir.

Büyük doku alanlarını görselleştirmek için, araştırmacılar genellikle farebağırsağı 3,4,5,6 için geliştirilen "İsviçre rulo" tekniğini uyarlar. Bu çalışma, sare midesinde kullanılmak üzere İsviçre roll tekniğini değiştirerek yeni bir protokol oluşturdu. Mide önce anatomik bölgelerine ayrılır ve düz bir konumda sabitlenir. Daha sonra doku dikkatlice rulonlanıp kriyobölümleme için işlenir. Yanlış İsveçre yuvarlanması, özellikle bağırsaktaki hassas epitel yapılarına zarar verebilir ve bu da bağışıklık boyama için kötü doku kalitesine yol açabilir. İyi sabitlenmiş, doğru yönlendirilmiş dokuların, sağlam hücresel yapılara sahip korunması, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için gereklidir. Bu çalışma, tek bir kriyoblok içindeki tüm mide bölgelerini içeren yeni bir İsviçre rulo oluşturma yöntemi sunmaktadır. Ayrıca, mide tunika muscularis için optimize edilmiş bir immünfloresan boyama protokolü tanımlanmıştır ve bu da mide fonksiyonunun ayrıntılı değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol, mide dokusunun dikkatli hazırlanması, İsveçre rulo işleme ve boyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüleri elde etmek için kapsamlı bir rehber sunar. Mide tunika muscularis'in karmaşık morfolojisini koruyarak, bu yöntem hem sağlık hem de hastalık açısından yapısı ve işlevinin daha derinlemesine anlaşılmasını sağlar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi'nde belirtilen yönergeler kullanılarak gerçekleştirildi. Protokoller, Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (A48315-15) tarafından onaylandı. Mayo Clinic'in hayvan bakım ve kullanım programları ile tesisleri, Laboratuvar Hayvan Bakımı Uluslararası Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından incelenmiş ve tam olarak akredite edilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Paraformaldehit (PFA) sabit mide kriyoseksiyonları için İsviçre roll tekniği

  1. C57BL/6J faresini (8-10 haftalık) karbondioksit (CO₂) solumasıyla en az 3 dakika anestezi edin, ardından servikal dislokasyon uygulanarak ötenazi sağlanması sağlanır (kurumsal onaylı protokollere uygun olarak).
  2. Yemek borusu, onikili kodenum ve ventral ile dorsal mezogastriyanı keserek mideyi çıkarın.
  3. Mideyi, soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) silikon kaplı bir kaba yerleştirin. Özofagus, fundus, korpus ve onikizili koseni yönlendirme referansları olarak sabitleyin (Şekil 1A). Kesme yönü, Şekil 1A'da kırmızı kesik çizgiyle gösterilmiştir.
  4. Yapışan yağları dübel makas ve penss ile dikkatlice çıkarın.
  5. Onikili çapın ventral mezenterisi ve mide boyunca korpustaki iğneye kadar kesin, ardından dokunun nazikçe düzleştirilmesi (Şekil 1B).
  6. PBS ile doldurulmuş bir transfer pipeti kullanarak mide lümeninden kalan yiyecekleri temizleyin.
  7. Açık karnını nazikçe gererek düz bir konum elde edin (Şekil 1C).
    DIKKAT: Doku mimarisini korumak için aşırı germelerden (yani orijinal boyutların %110'undan fazlası) kaçının.
  8. Mideyi soğuk %4 PFA'ya daldırarak dokunun hafifçe sabitlenmesi ve yuvarlanmayı kolaylaştırması için 2 dakika bekletin.
  9. Kısa fiksasyondan sonra dokuyu tekrar düzleştirin.
  10. Karın, kesik çizgi boyunca kesik çizgi boyunca keserek yuvarlanmaya uygun bir düzgün bir şekil elde edin (Şekil 1C).
  11. Kesilen mide dokusunu PBS nemli filtre kağıdına yerleştirin (Şekil 1D).
  12. Dokuyu Swiss roll konfigürasyonuna getirin ve ortadan bir kürdan geçirerek sabitleyin.
    DIKKAT: Sarma işlemi sırasında mukoza tarafının yukarıya baktığından emin olun. Yayımlanan yöntemlerin küçük değişikliklerini takip ederek bir elinizde pensiyle onikili ucu tutarken, diğer elinizle kürdanı yönlendirin.
  13. Sarmalandıktan sonra, şeklini sabitlemek için 30 G'lik bir iğne yerleştirin ve 90° açı ile bükülerek yuvarlanan mideyi stabilize edin (Şekil 1E).
  14. Rulo dokuyu %4 PFA'da 4 °C'de 6 saat sabitleyin.
  15. Sabit dokuyu PBS'de %30 sukroza aktarın ve kriyokoruma ile buz kristali oluşumunu önlemek için 4 °C'de 12-16 saat kuluçka yapın.
  16. Stabilizator iğneyi nazikçe çıkarın.
  17. Dokuyu optimal kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğine tek kullanımlık baz kalıpları kullanarak gömül, ardından kuru buzda dondurun (Şekil 1F).
  18. Tamamen dondurulduktan sonra kalıp -80 °C'de saklanır.
    DIKKAT: O.C.T.'de, özellikle doku çevresinde, hava kabarcıklarından kaçının, çünkü bunlar kesitlere müdahale eder. Doku blokları en az bir yıl boyunca -80 °C sıcaklıkta saklanabilir.
  19. Kesitlemeden önce, bloğu en az 1 saat boyunca -20 °C'de dengeleyin.
  20. Dokuyu 5 μm kalınlıkta kriostat kullanarak kesitleyin.
    DIKKAT: 5-12 μm kalınlık, genellikle fare midekesitleri 7,8 için uygundur ve deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir. Bölümler -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.

2. Mide kası dokusunun immünofluoresan boyaması

  1. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, mikroskop slaytındaki her doku kesitinin etrafına su itici bir bariyer çizin.
  2. Bölümleri soğuk PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın ve kalan O.C.T. bileşiği çözülür.
  3. Oda sıcaklığında (RT; 21-23 °C) PBS'de %1 sığır serum albümini (BSA) ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
  4. %1 BSA'yı emiş ile çıkarın, ardından bölümleri soğuk PBS ile üç kez, RT'de (21-23 °C) 10 dakika boyunca yıkayın.
  5. Ayrıca, bölümleri 1 saat boyunca RT'de (21-23 °C) fare IgG bloklama çözeltisiyle inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin; bu, endojen IgG'nin bağlanmasını azaltır ve fare antikoru IgG kullanıldığında özgüllüğü artırır.
  6. Bloklayıcı çözeltiyi emiş kullanarak çıkarın, ardından bölümleri soğuk PBS ile üç kez, RT (21-23 °C) sıcaklığında 10 dakika boyunca yıkar.
  7. BSA bloklamasını RT (21-23 °C) 1 saat boyunca tekrarlayın.
  8. Kesitleri primer antikorlarla kuluçka edin. Anoktamin-1 (ANO1), KIT, beta-tubulin sınıfı III (TUBB3) soğuk %1 BSA ile %0,3 Triton X-100 ile seyreltilmiştir. Ayrı bir deneyde, miyozin ağır zincir 11 (MYH11), E-cadherin ve KIT kullanın. Gece boyunca (12-16 saat) 4 °C'de kuluçka yapın.
  9. Birincil antikor çözeltisini nazik emiş kullanarak çıkarın. Bölümleri soğuk PBS ile üç kez, her biri 10 dakika boyunca RT (21-23 °C) sıcaklıkta yıkar.
  10. Bölümleri ikincil antikorlarla kuluçka edin. Alexa Fluor (AF) 488 anti-tavşan IgG, AF555 anti-fare IgG ve AF647 anti-keçi IgG (hepsi 5 μg/mL; 1:400) 1 saat RT (21-23 °C) boyunca 1% BSA'da.
  11. İkincil antikor çözeltisini emiş kullanarak çıkarın, ardından bölümleri RT'de (21-23 °C) 10 dakika boyunca soğuk PBS ile üç kez yıkayın.
  12. Bölümleri 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:300 seyreltmede) ile RT (21°-23 °C) sıcaklığında 1 saat boyunca boyandırın.
    DIKKAT: Nöronal çekirdekler genellikle diğer GI hücre tiplerine göre daha zayıf DAPI sinyalleri gösterir; Optimal görselleştirme için en az 1 saat süren kuluçka önerilmektedir.
  13. Parçaları bir kez ultra saf suyla durulayın, kalan tuzları çıkarın.
  14. Slaytları Antifade Mountant ile monte edin.
  15. Örtü kıvırının köşelerini floresan olmayan lak oje ile kapatın. Fazla montaj ortamını nazik emiş ile çıkarın. Sonra, örtü kağızının tüm çevresini kapatın.

3. Konfokal mikroskopla immünofluoresans görüntüleme

  1. DAPI, AF488, AF555 ve AF647 için lazerler ve dedektörler yapılandırılarak konfokal görüntüleme yazılımında çok kanallı Z-stack edinimi kurun, böylece spektral ayrım sağlanır ve sinyal doygunluğunu önlenir.
    DIKKAT: Her florofor için lazer gücünü ve pozlama süresini ayrı ayrı ayarlayarak çapraz takılmayı önleyin ve sinyalin tüm kanallarda dinamik aralıkta kalmasını sağlayacak (Şekil 2A).
  2. Konfokal görüntüleme yazılımında piksel doygunluğunu önlemek ve yüksek yoğunluklu bölgelerde sinyal detaylarını korumak için pozlama parametreleri ayarlanabilir (Şekil 2B).
    DIKKAT: Tüm kanallardaki sinyallerin dinamik aralık içinde kalmasını ve doygunluğa ulaşmamasını sağlayın.
  3. Tüm mide rulonunu yakalamak için büyük bir görüntü alma ayarı kullanın (örneğin, 6 × 6 alan) (Şekil 2C); ancak bu ayar, rulo dokunun genel boyutuna ve sıkılığına göre ayarlanmalıdır.
  4. Konfokal görüntüleme yazılımında Z-serisi alım kullanarak 3D görüntüler elde edin. N-boyutlu (ND) edinim için ayrıntılı iş akışı Şekil 2D'de gösterilmiştir.
  5. Z-serisi görüntülemeyi etkinleştirmek için Z-stack seçeneğini seçin.
  6. Z-aralığını, tüm midenin tam kalınlığını kapsayan üst ve alt odak pozisyonlarını ayarlayarak tanımlayın.
  7. Karnının üst kısmını netleştirin ve üst Z sınırını ayarlamak için Üst butona tıklayın.
  8. Odağı mide kasının altına ayarlayın ve alt Z-limitini ayarlamak için Alt düğmeye tıklayın.
  9. Z-stack adımlarının sayısını mide kasının tam derinliğini kapsayacak şekilde 8'e ayarlayın.
  10. Z-stack görüntü edinimini başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
  11. Bireysel ve birleşik floresan kanalları için maksimum yoğunlukta projeksiyonlar üreterek üç boyutlu verileri iki boyutlu bir görüntüde görselleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni yöntemle, fare mide ruloları midenin üç ana bölgesini de içeriyordu: fundus, korpus ve antrum, ayrıca yemek borusunun küçük bir kısmı ve onikili komi, tek bir bölümde yer alıyordu. Tüm midenin tek bir bölüme dahil edilmesi, kapsamlı bölgesel analizi mümkün kılmaktadır (Şekil 1). Mide rulonlarının tam görüntülerinin hematoksilin ve eozin (H&E) boyaması, tüm bölgelerde iyi korunmuş mide mimarisini göstererek mukozal tabakalar, submukozal ve muscularis katmanlarının net görselleştirilmesini sağlamıştır (Şekil 3). Şekil 4, Cajal (ICC; fazik bağırsak hareketliliğinin altında ritmik yavaş dalgalar üreten kalp pili hücreleri; KIT ve ANO1 ile tanımlanmıştır), enterik nöronların (gastrointestinal hareketliliği koordine eden enterik sinir sistemi nöronları; TUBB3 immünboyama ile tanımlanmıştır) ve çekirdeklerin (DAPI) interstisiel hücrelerinin temsili immünofluoresan boyamasını göstermektedir. Mide mukozasında, KIT, daha öncebildirildiği gibi Paneth ve kadeh hücrelerinde de eksprese edilir 9,10,11. ANO1 ayrıca özellikle fundusun sütunvari epitel hücrelerinde mide epitelinde yüksek derecede ekspreslenir; bu, klorür taşınımı ve mukozal salgılanmadakirolüyle uyumludur 11. Ayrıca, İnsan Protein Atlas12,13 verilerine göre, TUBB3 belirli mide endokrin hücrelerinde ve mukus salgılayan hücrelerde de ekspresyona geçmektedir. Şekil 5, MYH11 ile etiketlenen düz kas hücrelerinin temsil immünofluoresan boyamalarını, E-kadherin ile işaretlenen mide mukoza epitelyal hücrelerini ve KIT ile işaretlenen ICC'yi göstermektedir. MYH11 ayrıca daha önce bildirildiği gibi mide mukozasındaki miyofibroblastlarda da ekspreseedilir 14. Bu immünoflüoresans sonuçları birlikte, protokolümüzün doku mimarisini koruduğunu doğrular.

Şekil 1
Şekil 1: Fare midesinin kriyobölümleme için "İsviçre rulosu"nun hazırlanması. (A) Tüm mide, doku bütünlüğünü korumak için çıkardıktan hemen sonra soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) doldurulmuş siyah silikon kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirilir. (B) Mide, onikili çapın ortasında açılır. (C) Karın nazikçe gerilir ve tabakta sabitlenir, böylece aşırı gerginlik uygulanmadan düz yatacaktır. Doku boyunca kırmızı çizgi çizgi çizilir ve yuvarlanmayı kolaylaştırmak için nerede kesilmesi gerektiğini belirtir. (D) Açık ve sabit mide, kompakt bir konfigürasyona dönüşmek üzere PBS nemlendirilmiş filtre kağıdına konur. Kırmızı ok, karnının yuvarlanma yönünü gösterir. (E) Doku parçaları, kriyokesirleme için hazırlanmak üzere optimal kesme sıcaklığı (O.C.T.) bileşiğine gömülür ve kuru buzda dondurulur. (F) Donmuş bloklar −80 °C'de depolanır ve 5 μm kalınlıkta kriyoseksiyon yapılır ve sonraki analiz için yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Z-stack görüntüleme sırasında ND Acquisition kurulumu ve doygunluk görselleştirmesi. (A) Çok kanallı spektral görüntüleme için konfokal görüntüleme yazılımında konfigüre edilmiş lazer ve detektör ayarları. Dört florofor kullanılır: 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) ve Alexa Fluor 647 (AF647), her biri ilgili uyarılma lazerler ve emisyon dedektörleriyle eşleştirilir. Spektral grafik, uyarılma ve emisyon eğrilerini gösterir; böylece çapraz konuşmayı en aza indirmek ve sinyal algılamayı optimize etmek için ayarlama yapılabilir. (B) Her florofor için pozlama ayarları, piksel doygunluğunu önlemek ve yüksek yoğunluklu bölgelerde detayları korumak için ayrı ayrı ayarlanır. (C) Büyük görüntü alma ayarı (örneğin, 6 × 6 alan) tüm mide rulonunun görselleştirilmesini sağlar; Görüntü alanı boyutu, rulo dokunun boyutuna ve kompaktlığına göre ayarlanmalıdır. (D) Z-stack parametre ayarlarını gösteren ND Acquisition penceresi. Z aralığı, mide kasının üst ve alt pozisyonlarının seçilmesiyle tanımlanır ve dokunun tam derinliğini üç boyutlu (3D) analiz için yakalanacak sekiz adım yapılandırılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: Hematoksilin ve eozin lekeli fare mide rulonunun görüntüsü. Fayans taraması, 8 haftalık bir dişi C57BL/6J farenin tüm mide rulosunu görselleştirme yeteneğini gösteriyor. Ana anatomik bölgeler belirtilmiştir; bunlar arasında özofagus (kırmızı noktalı çizgi), alt özofagus sfinkteri (mor noktalı çizgi), fundus (siyah noktalı çizgi), corpus (mavi noktalı çizgi), antrum (yeşil noktalı çizgi) ve onikili komili (turuncu noktalı çizgi) yer alır. Ölçek çubuğu: 1000 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: İsviçre rulonunun konfokal görüntüleri: ANO1, KIT, TUBB3. Üst paneller: 8 haftalık dişi C57BL/6J faresinden alınan mide ekilmiş bir Swiss roll'un temsil eden konfokal görüntüleri, ANO1 (yeşil), KIT (mavi), TUBB3 (sarı) ve çekirdekler (mavi) için bağışıklık boyama gösteriliyor. Fundus, korpus ve antrum dahil olmak üzere tüm yuvarlanan mide görselleştirilir. Ölçek çizgileri: 1000 μm. Alt paneller: Üst panellerdeki beyaz çizgi çizgili kutu ile gösterilen bölgenin büyütülmüş görüntüleri, Cajal'ın interstisial hücrelerinin (ANO1+ ve KIT+; sarı oklar) ve enterik nöronların (TUBB3⁺; kırmızı oklar) hücresel detaylarını vurgular. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5
Şekil 5: İsviçre rulonunun konfokal tüm bir fare midesinin görüntüleri: MYH11, KIT, E-cadherin. Üst paneller: 8 haftalık dişi C57BL/6J faresinden alınan mide köklü bir Sviçre rulonunun temsilci dikişli konfokal görüntüleri, MYH11 (yeşil), KIT (siyani), E-kadherin (sarı) ve çekirdekler (mavi) için immünboyama gösteriliyor. Fundus, korpus ve antrum dahil olmak üzere tüm yuvarlanan mide görselleştirilir. Ölçek çubukları: 1000 μm. Alt paneller: Üst panellerdeki beyaz kesik kutu ile sınırlandırılan bölgenin büyütülmüş görüntüleri. Beyaz noktalı çizgiler, mukozal epitelini (E-kadherin) ve kas tabakasını (MYH11) ayırt eder. Beyaz oklar, Cajal'ın KIT+ ara hücrelerini (ICC) gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni optimize edilmiş gastrik İsviçre roll yöntemi kullanılarak, midenin üç segmenti (fundus, korpus ve antrum), yemek borusu ve onikibarı ile birlikte tek bir slayt üzerinde yer alır. Bu kapsamlı gömme, araştırmacıların tüm mide boyunca yapısal ve moleküler değişiklikleri analiz etmesini sağlar ve reaktiflerin kesimlenme ve boyama maliyetlerini azaltır (Şekil 1).

İmmünboyama sırasında tüm mide bölgelerinin aynı boyama çözeltilerine aynı anda maruz kalmak, tutarlılığı sağlar ve doğruluğu artırır. Mide rulolarının bağışıklık boyaması, mide duvarının belirgin katmanlarını açıkça ortaya koyar. Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterildiği gibi, bu yöntem mide segmentleri arasındaki morfolojik farklılıkların görselleştirilmesini sağlar ve ICC (KIT ve ANO1)10, nöronlar (TUBB3)15, düz kas hücreleri (MYH11), mukozal epitel hücreleri (E-kadherin) ve çekirdeklerin tespit edilmesini sağlar.

Doku durumu ve araştırma amacına bağlı olarak küçük değişiklikler yapılabilir. Örneğin, fazla yapışkan yağın çıkarılması, fiksasyon sırasında rulonun şeklini korumaya yardımcı olabilir. Kesit kalınlığının ayarlanması da doku yapısının korunmasına veya slayta yapışmasını iyileştirmeye yardımcı olabilir. Bir diğer potansiyel iyileştirme, bağırsak İsveçreruloları 16'da olduğu gibi daha tutarlı kesim için metal bir kalıp kullanmaktır. Bu protokol kriyoseksiyonlara odaklansa da, parafinli gömülü dokular için uyarlanabilir. Parafin gömülmesi doku yapısal bütünlüğünü korurken, kriyoseksiyon daha hızlı işleme ve daha iyi antijen koruma sağlar, böylece immünoflüoresans için daha uygun hale gelir.

Bu yöntemin sınırlamaları vardır. İltihaplanma, obezite, diyabet veya yaşlanma gibi durumlarda yaygın olarak görülen büyümüş, fibrotik veya kalsifikasyon olan bir mide, yuvarlanması daha zor olabilir ve optimal boyama için zorluklaryaratabilir 17,18,19,20. Bu sınırlamaya rağmen, bu teknik geleneksel bölgeye özgü gömme yöntemine göre büyük avantajlar sunar. Tüm mide bölgelerinin aynı koşullarda işlenmesi tutarlılığı artırır, değişkenliği azaltır ve hem zamanı hem de reaktifleri korur.

Bu yaklaşım, bölgeye özgü değişim çalışmaları için özellikle faydalıdır. Ayrıca birden fazla hücre tipinin mekansal analizini destekler ve görüntü tabanlı nicelendirme ile eşleştirilebilir. Genel olarak, bu yeni optimize edilmiş mide Swiss-roll yöntemi, sağlık ve hastalıklarda kapsamlı mide dokusu analizi için pratik ve ölçeklenebilir bir platform sunmaktadır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.) ve P30 DK084567 (Epigenomik ve Mekansal Biyoloji Merkezi, Mayo Clinic Gastroenterolojide Hücre Sinyalizleme Merkezi) hibeleriyle desteklendi. Finansman kuruluşlarının çalışma tasarımı, veri analizi veya makale hazırlama konusunda hiçbir rolü yoktu. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır. Dr. Darren J. Baker ve Dr. Baker Laboratuvarı üyelerine (Mayo Clinic, Rochester, MN, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü) H&E boyama için laboratuvar kaynaklarını ve teknik desteğini paylaştıkları için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#5SF PensetlerİYI BILIM ARAÇLARI11252-00
Sığır serumu albumin SIGMA-ALDRICHA7906
ColdVision MC-LS LED ışık kaynağıSCHOTTMC-LS
Konfokal yazılım NikonNikon NIS-Elements Görüntüleme Yazılımı
Cryoseal XYLEpredida9312-4
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilaktit)Thermo Fisher ScientificD3571
Büyük Diseksiyon TabaklarıYaşayan Sistemler  EnstrümantasyonSKU: DD-90
Eşek anti-keçi AF647 pAbYaşam TeknolojileriA21447Lot: 1739289 RRID:AB_2535864
Eşek anti-fare AF555 pAbYaşam TeknolojileriA31570Lot: 1774719 RRID:AB_2536180
Eşek anti-tavşan AF488 pAbYaşam TeknolojileriA21206Lot: 2668665 RRID:AB_2535792
E-cadharin (1:400 seyreltme)BD Bioscience610181parsel: 25510 RRID:AB_397580
EosinELITechGroup$SS-071C
Epoksi Kaplamalı PensetlerİYI BILIM ARAÇLARI11210-10
EtanolSIGMA-ALDRICH459828-4L
FLEX TUBE 1.5 mLEppendorf22364111
Gazlı Bez SüngerleriFisherscientific22-362-178
Sertleştirilmiş İnce MakasİYI BILIM ARAÇLARI14090-09
HematoksilinEpredia7211
KIT (0.2 & mikro; g/mL; 1:1000 seyreltme)R& D SistemleriAF1356Lot: IEO0217101 RRID: AB_354750
LENS TEMİZLEME ÇÖZÜMÜ 1 OZ SPREY ŞIŞESINikon77013066
Mikroskop Kapak CamıFisher Scientific12541016
Mikroskop SlaytlarıCardinalHealthM6133A
Küçük PinlerİYI BILIM ARAÇLARI26002-20
MYH11 (1:400 seyreltme)Biyomedikal TeknolojilerBT-562RRID:AB_10013421
OjeGÜNAHKAR RENKLER7.33855E+11
İğne 30 G x 1/2 inç;BD Bioscience305106
ParaformaldehitSIGMA-ALDRICH158127-500G
Personna Tek Kenarlı BıçaklarJilet Bıçak Şirketi.76247-652
ReadyProbes Fare-Üzerinde IgG Engelleme Çözümü (30x)Thermo Fisher ScientificR37621Lot: 3226230
SlowFade Diamond Antifade Mountant (Montaj medyası)Thermo Fisher ScientificS36972
StainTray 10 sürgü boyama sistemiSimport ScientificM918-2
Stereo mikroskop 0.8x-5xNikonSMZ645
Sucrose SIGMA-ALDRICHS9378-1KG
Yüzey Amplifikatörleri X-100 (Triton X)Thermo Fisher Scientific28314
TMEM16A (ANO1: 1:400 seyreltme)Abcamab53212 Lot: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Transfer PipitiFalcon357575
TUBB3 (1:400 seyreltme)Hücre sinyal teknolojisi4466Lot: 5 RRID: AB_1904176
Xylenes Fisher ScientificX3P-1GALÇOK 206238

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

Related Articles