Nijmegen Hemostaz Testi: Tek bir Kuyiyada Trombin ve Plazmin Üretiminin Eşzamanlı Florojenik Ölçümü

Özet

Bu protokol, trombin ve plazmin üretiminin eşzamanlı ve zaman çözümlü ölçümünü mümkün kılan Nijmegen Hemostaz Testini tanımlar; böylece pıhtılaşma ve fibrinolizin entegre bir değerlendirmesi sağlanır. Test, geleneksel hemostatik testlerin kapsamının ötesinde araştırma ve klinik ortamlarda hemostatik dengenin karakterizasyonunu iyileştirmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Trombin ve plazmin, hemostazda merkezi bir rol oynar; sırasıyla pıhtılaşma ve fibrinolizi düzenler. Geleneksel hemostatik testler genellikle izole bileşenlere veya sınırlı hemostaz evrelerine odaklanır; Örneğin, aktif kısmi tromboplastin zamanı ve protrombin zamanı yalnızca fibrin oluşumunun başlanmasını değerlendirirken, faktör aktivite testleri bireysel pıhtılaşma faktörlerinin işlevini değerlendirir. Değerli olmalarına rağmen, bu testler ikincil hemostaz ve fibrinolizi sürecinin genel olarak zaman içinde dinamik olarak ortaya çıktığını kapsamlı bir şekilde görmemektedir. Nijmegen Hemostaz Testi (NHA), trombin ve plazmin üretiminin tek bir mikroplaka kuyusunda eşzamanlı ve zaman çözünürlüğüyle ölçülmesini mümkün kılarak bu sınırlamayı giderir. Farklı uyarılma ve emisyon spektrumlarına sahip ve çapraz reaktivite olmadan iki sentetik florojenik alt kullanılarak yapılan test, her iki enzimin paralel olarak doğru nicelendirilmesini sağlar. Hemostaz, trombositten yoksun, doku faktörü, kalsiyum ve doku tipi plazminojen aktivatörü kullanılarak başlatılır ve floresans 70 dakika boyunca 37 °C'de her 30 saniyede bir kaydedilir. Enzim aktivite eğrileri, lag süresi, trombin potansiyeli, fibrin lizisi zamanı ve plazmin zirve yüksekliği gibi parametrelerin türetildiği kalibrasyon standartları kullanılarak oluşturulur. Test, aynı anda trombin ve plazmin üretimini iyi bir iç ve ara analiz hassasiyetiyle güvenilir şekilde yakalar ve heparin, aktive protein C ve epsilon-aminokaproik asit gibi efektörler tarafından pıhtılaşma ve fibrinoliz modülasyonunu tespit eder. Klinik örneklerde, pıhtılaşma faktörü eksiklikleri olan hastalarda trombin oluşumunun anlamlı azalması, fibrinolitik bozuklukları olan hastalarda ise plazmin üretim profillerinin yükseldiği görüldü. Trombin ve plazmin üretim ölçümlerini birleştirerek, NHA geleneksel testlerin ötesinde hemostatik dengeye kapsamlı bir bakış sunar. Bu entegre yaklaşım, hemostatik fenotiplerin karakterizasyonu, kanama ve trombotik riskin değerlendirilmesi ve hedefli terapötik müdahalelerin izlenmesi gibi araştırma ve klinik uygulamalar için umut vaat etmektedir. Bu protokol, hemostatik dengenin anlaşılmasını ve değerlendirilmesini artırmayı amaçlayan NHA prosedürünü özetlemektedir.

Giriş

Hemostaz, pıhtılaşma ve fibrinoliz arasındaki dinamik bir dengenin sonucudur. Trombin ve plazmin bu süreçleri yönlendiren ana enzimlerdir: Trombin fibrinojen'i fibrine dönüştürürken, plazmin fibrini parçalayarak pıhtıları çözür. Bu dengenin bozulması kanamaya veya trombotik olaylara yol^{açabilir 1,2}. Ancak, klinik uygulamada hemostazı değerlendirmek için kullanılan laboratuvar testleri genellikle izole koagülasyon veya fibrinoliz adımlarına odaklanır ve genel hemostatik denge hakkında sınırlı bir bilgi sağlar. Kanama eğilimi şüpheli hastalarda, protrombin zamanı (PT) ve aktif kısmi tromboplastin zamanı (aPTT) gibi rutin tarama testleri genellikle pıhtılaşma faktörü eksikliklerini taramak için kullanılır. Ancak, bu testler fibrin oluşumunun başlangıcını ölçer ve trombin oluşumunu en fazla fizyolojik olarak önemli trombin aktivitesinin gerçekleştiği pıhtı başlangıcından sonra^{yakalamaz; 1,2,3}. Sonuç olarak, hafif pıhtılaşma faktörü eksiklikleri olan^{hastalarda normal sonuçlar verebilirler} 3,4,5,6,7,8. Bu spesifik eksiklikleri belirlemek için koagulasyon faktörü aktivite testleri kullanılır. Tanı için bilgilendirici olsa da, bu testler bireysel proteinleri izole olarak değerlendirir ve genel hemostatik dengeyi yansıtmaz. Sonuç olarak, hafif eksiklikleri olan hastalarda faktör seviyeleri genellikle kanama^{fenotipi 9,10} ile kötü korelasyonludur. Bu durum, klinik risk değerlendirmesini ve tedavi zamanlaması ve dozu dahil olmak üzere hasta yönetiminin optimizasyonunu ve trombotik veya şiddetli hemorajik olaylara yanıt olarak yapılan müdahaleleri karmaşıklaştırır. Bu sınırlamalar, hemostatik sürecin zaman içinde daha kapsamlı bir görünümü sunan ve laboratuvar sonuçları ile klinik sunum arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olabilecek testlere olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Nijmegen Hemostaz Testi (NHA), trombositten yoksun plazma ^8,9'da trombin ve plazmin üretiminin eşzamanlı ve zamanla çözülebilir ölçümünü mümkün kılarak bu sınırlamaları gidermek için geliştirilmiştir. Her iki enzimi çapraz reaktivite olmadan aynı mikroplakada iyi bir şekilde niceliklendirmek için farklı uyarılma ve emisyon spektrumlarına sahip iki sentetik florojenik substrat kullanır. Enzim üretim eğrileri, ikincil pıhtılaşma ve fibrinoliz dinamiklerini yansıtan nicel parametrelerin türetilmesine olanak tanır; bunlar arasında gecikme süresi, trombin zirve yüksekliği, fibrin lizis zamanı ve plazmin zirve yüksekliği bulunur. NHA, mevcut trombin üretim testlerine göre çeşitli avantajlar sunar; örneğin, Kalibreli Otomatik Trombogram (CAT), Ceveron s100 ve ST Genesia; bunlar trombin dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar ancak fibrinolitik^{aktiviteyi 10,11,12,13} değerlendirmez. Pıhtı lizis testleri ise fibrinolizinin bazı yönlerini yakalar, ancak trombin^{nesli 14} hakkında bilgi eksikliği gösterir. Bu, genel hemostatik dengeyi belirleyen karmaşık etkileşimlerin değerlendirilmesinde faydalarını sınırlar. Bazı laboratuvar tabanlı yaklaşımlar trombin ve plazmin üretim ölçümlerini birleştirmiş olsa da, bunlar genellikle ayrı kuyular veya paralel testler gerektirir ve zamansal hizalanmayı ve^{verimliliği sınırlar 15}. Tromboelastografi (TEG) ve rotasyonel tromboelastometri (ROTEM) gibi küresel testler, birincil hemostaz, ikincil pıhtılaşma ve fibrinolizi^16,17 yakalayarak tamamlayıcı bilgi sağlar. Akış odası sistemleri, akış koşullarında toplam hemostazı değerlendirmek için ortaya çıkan ve deneysel bir başka^{yaklaşımı temsil eder 18}. Bu küresel testler daha geniş bir fizyolojik bağlam sunsa da, genellikle hafif kanama bozukluklarına karşı daha az hassastır 19,20,21. Aynı reaksiyon kuyusunda trombin ve plazmin üretimini aynı anda ölçerek, NHA geleneksel TGA'ların hassasiyetini küresel testlerin entegre görünümüyle birleştirerek ikincil hemostaz, fibrinoliz ve etkileşimlerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Trombin üretim testleri, bireysel kanama ve trombotik risk profili ile tedavi izleme gibi translasyonel uygulamalar için önemli umut vaat etmiştir ^22,23,24,25. Klinik araştırmalarda, NHA hemofili A, hemofili B ve nadir koagulasyon faktörü eksiklikleri olan hastalarda trombin üretiminin azaldığını, ayrıca α2-antiplazmin eksikliği gibi hiperfibrinolitik durumlarda^{plazmin üretiminin arttığını göstermiştir} 26,27,28,29. Her iki yolda da farklılıklar, hem kanama hem de tromboz riskinin artmasıyla ilişkili olan hipofibrinojenemi hastalarında gözlemlenmiştir. Bu popülasyonda, düşük fibrinojen seviyeleri, muhtemelen plazminojen bağlanma noktalarının eksikliğinden kaynaklanan azalmış plazmin üretimiyle ilişkili olurken, tromboz öyküsü olan hastalarda trombin^{üretimi 30} arttı. Ayrıca, test antikoagülantlar, prokoagülanlar ve antifibrinolitikler dahil olmak üzere terapötik ajanların^{etkilerini tespit eder 8}. Daha önceki bir çalışmada, tekrarlanabilirliği artırmak ve sonuçların koşular ile laboratuvarlar arasında karşılaştırılmasını mümkün kılmak için standartlaştırma ve normalizasyon yaklaşımı önermiştik; bu, klinik uygulamaya doğru önemli bir^adımdır. Bu protokol, NHA'nın klinik araştırma veya translasyon ortamlarında uygulanması için tam prosedürünü ve analitik yaklaşımını özetlemektedir.

Protokol

İnsan plazma örneklerini içeren tüm prosedürler kurumsal yönergelere uygun olarak yürütüldü ve Arnhem-Nijmegen tıbbi etik komitesi tarafından onaylandı. Örnek toplamadan önce tüm bağışçılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Tamponlar, reaktifler ve plazma örneklerinin hazırlanması

1. Tampon çözeltileri hazırla
   1. 1.2 g Tris (p.a.) ağırlığında ve %0,9 NaCl olan 180 mL içinde çözünür.
   2. HCl ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
   3. Son hacmi %0,9 NaCl ile 200 mL'ye getirerek 50 mM Tris-150 mM NaCl tamponu (TBS) elde edin.
   4. TBS'yi iki 50 mL tüpe al.
   5. Kalan 100 mL TBS kalsiyum içeren tamponu hazırlamak için kullanın. 7.34 g CaCl₂·2H₂O silesini 100 mL TBS'de çözerek Tris-NaCl-CaCl₂ tamponu elde edilir (TBS-Ca, pH 7.4).
   6. TBS-Ca'yı iki 50 mL'lik tüpe al.
   7. Her iki tamponu da 4 °C'de saklayıp bir hafta içinde kullanın.
2. Florojenik substratlar hazırlayın
   1. 53,2 mg trombin substratını (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) 4 mL Tris-NaCl tamponunda çözer.
      NOT: Kutuda analiz sertifikası içeren bir broşür bulunmaktadır. Eklenecek tampon hacmi belirtilen konsantrasyona bağlıdır ve 120 μL reaktifide eklenen 1 μL insan trombini ile nihai konsantrasyon 76 nmol/L olacak şekilde ayarlanmalıdır.
   2. Aliquot 100 μL Eppendorf tüplerinde ve −80 °C'de depolanıyor.
   3. Kullanımdan önce oda sıcaklığında trombin spesifik florojenik substrattan bir aliquot eritin. Vortex ve deney sırasında buzda kal.
   4. Bir plazmin substratı şişesinin (CBZ-L-Phe-Arg-rhodamin) içeriğini 1.955 μL DMSO'da çözür.
      NOT: Kutuda analiz sertifikası içeren bir broşür bulunmaktadır. Eklenecek tampon hacmi belirtilen konsantrasyona bağlıdır ve 120 μL reaktifte eklenen 1 μL insan plazmini ile nihai konsantrasyon 200 nmol/L olacak şekilde ayarlanmalıdır.
   5. Aliquot 60 μL Eppendorf tüplerinde ve −80 °C'de depolanıyor.
   6. Kullanımdan önce plazmine özgü florojenik substrat alkotu oda sıcaklığında 10 dakika eritin. Vortex ve deney sırasında oda sıcaklığında tutun.
      NOT: Bu substrat dimetilsülfüksitte (DMSO) çözünür ve çökelmeyi önlemek için soğutulmamalıdır.
3. Tetikleyici reaktifleri hazırla
   1. Liyofilize sefalini 1 mL damıtılmış su ekleyerek yeniden oluşturmak gerekir. Girdabı iyice çözerek tamamen çözülene kadar.
      NOT: Sefalin, çoklu koagulasyon reaksiyonlarını katalize etmek için gerekli olan fosfolipidler sağlamak için yeniden oluşturulmuştur; bu reaksiyonlar, fizyolojik olarak önemli koagülasyonu mümkün kılmak için gereklidir.
   2. Eppendorf tüplerinde 60 μL (20 kuyu için yeterli) ve −20 °C'de depolan.
   3. Bir aliquotu kullanmadan önce eritin ve buzda tutun. Pipetlemeden önce kısa bir girdap vardı.
   4. Rekombinant insan dokusu faktörünün (TF) bir şişesinin içeriğini 4 mL damıtılmış suda yeniden oluşturun.
   5. Aliquot 60 μL Eppendorf tüplerinde ve −80 °C'de depolanıyor.
   6. Kısa süreliğine TF ve vortex'in bir aliquotunu erit.
   7. TF'nin ardışık seyreltmesiyle 1:500 derecesinde bir seyreltme hazırlayın:
      1. 54 μL TBS tamponuna 6 μL TF ekleyin. Vortex.
      2. Bu seyreltmeden 6 μL alın ve 54 μL TBS ekleyin. Vortex.
      3. Bu ikinci seyreltmeden 20 μL alın ve 80 μL TBS ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 0,28 pM'e ulaşılır. Vortex.
   8. Bir şişe (20 mg) doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) içeriğini 20 mL damıtılmış suda yeniden yapılandırarak nihai konsantrasyon 580.000 IU/mL elde edilir (partiye özgü konsantrasyonu doğrulayın).
   9. Aliquot 50 μL Eppendorf tüplerinde ve −80 °C'de depolan.
   10. Kısa bir süre için tPA ve vortex aliquotunu erit.
   11. 1:50 tPA seyreltmesi için 20 μL tPA ekleyerek 980 μL Tris-NaCl tamponuna ulaşın; böylece nihai konsantrasyon 11.600 IU/mL elde edilir. Vortex.
4. Plazma örnekleri hazırlayın
   1. Venöz kanı %3,2 sitrat içeren 3 mL sitrat tüplerine toplayın, böylece en az 2,7 mL (%90 dolgu) toplandığından emin olun.
   2. Venipunkturisten sonra ilk tüpü kullanmayın; doku faktöründen kaynaklanan aktivasyondan kaçınmak için onu atın.
   3. Tüpü topladıktan hemen sonra en az 10 kez ters çevirin.
   4. Oda sıcaklığında 2 saat içinde santrifüj yapın; önce 2.500 × g 5 dakika, ardından 10.000 × g 10 dakika sürer.
   5. Plazmayı hücre tabakasının hemen üzerinde toplamak için tek kullanımlık pipet kullanın.
   6. Plazmayı etiketli kriyoviallere alıp sıvı azotta dondurur ve −80 °C'de depolar.
      NOT: Numunenin pıhtısız olduğundan emin olun. Sadece taze veya bir kez çözülmüş plazma kullanın. Bir CTAD tüpü tekrarlayıcı analiz için yeterlidir.

2. Enstrüman hazırlığı ve yazılım kurulumu

1. Floresans plaka okuyucusunu hazırlayın
   1. Plaka okuyucuyu açın ve 37 °C'ye kadar dengelenmesini sağlayın.
   2. Aşağıdaki temel parametreleri ayarlayın:
      1. Greiner 96-well, düz taban, siyah.
      2. Genel ayarlar: Konumlandırma gecikmesi: 0.1 saniye; Kinetik pencere sayısı: 1.
      3. Kinetik pencere: Döngü sayısı: 140; Ölçüm başlangıç süresi: 0.0 s; Her döngüde kuyu başına flaş sayısı: 10; Döngü süresi: 30 s.
      4. Optik: Üst optik
      5. Filtre ayarları: Monokromatik sayısı: 2. Uyarılma filtresi: Trombin için 355 nm; Plazmin için 485 nm. Emisyon filtresi: Trombin için 460 nm, plazmin için 520 nm. Kazanç: 600.
   3. Plaka başına maksimum 20 kuyuyu ile düzeni tanımlayın.
   4. Konsantrasyonlar/Hacimler/Titreme bölümlerine gidin ve aşağıdaki ayarları onaylayın. Pompa 1 = 20 μL; Pompa 2 = 0 μL; Hız = 420 μL/s.
2. Enjeksiyon sistemini hazırlayın
   1. Enjeksiyon iğnelerini çıkarıp tampon içeren bir kapta durulayın.
   2. Durulama hacmini 2.500 μL olarak ayarlayın ve pompaları 37 °C Tris/NaCl tampon ile durulayın.
   3. Durulama hacmini 500 μL'ye sıfırlayın.

3. Mikroplaka formatında test kurulumu

1. Microplate shaker kurulumu
   1. Mikroplaka çalkalayıcıyı 37 °C'ye ayarlayın ve kullanmadan önce sıcaklığı doğrulayın.
   2. Titreme yoğunluğunu 1100 rpm'ye ayarlayın.
   3. Bu silkeleyiciyi, homojen reaktiv dağılımını ve tutarlı enzimatik aktiviteyi sağlamak için testteki tüm karıştırma adımlarında kullanın.
2. Kuyular içine reaktifler ekleyin
   1. Hasta plazmasını ve normal birikmiş plazmayı (NPP) 37 °C'lik su banyosunda 10 dakikaya kadar eritin.
   2. İyice karıştırın ve tam çözüldüğünü doğrulayın (kriyopresipitat yok).
   3. Önceden seçilmiş kuyulara 80 μL hasta plazması veya NPP ekleyin. Her örnek için taze bir pipet ucu kullanın.
      NOT: Her test çalışmasında bir NPP örneği ekleyin, böylece çalışma arası değişkenliği hesaba alın (bkz. adım 5.6).
   4. 2 μL sefalin ekleyin.
   5. 2 μL doku faktörü ekleyin (1:500 seyreltme). Kısa bir süre tabaklı bir çalkalayıcı ile karıştırın.
   6. 10 μL Tris-NaCl buffer ekleyin. Kısa bir süre tabaklı bir çalkalayıcı ile karıştırın.
   7. 4 μL trombin substratı ekleyin.
   8. 2 μL plazmin substratı ekleyin. Kısa bir süre tabaklı bir çalkalayıcı ile karıştırın.
3. Kuluçka öncesi
   1. Mikroplakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
   2. Plakanın 37 °C'de birkaç dakika dengelenmesine izin verin.

4. Başlangıç reaktifinin hazırlanması ve enjeksiyonu

1. Pompa 1 için reaktifi hazırlayın
   1. 672 μL Tris/NaCl tampon, 192 μL Tris/NaCl/CaCl₂ tampon ve 96 μL tPA (adım 1.2.5'ten itibaren) birleştirin. Vortex'i iyice kontrol edin.
   2. Reaktif tüpünün kapağında iki delik aç.
   3. Pompa borusunu bir delikten tüpün altına yerleştirin.
2. Hazırlayın ve testi başlatın
   1. Yazılımı kullanarak pompayı 500 μL reaktif ile astarlayın.
   2. Enjeksiyon iğnelerini belirlenen pozisyonlarına yeniden yerleştirin.
   3. Hemen floresans ölçümüne başlayın.
3. Testin manuel başlatılması
   NOT: Bu manuel başlatma prosedürü, 2.2, 4.1 ve 4.2. adımlarda tanımlanan otomatik enjeksiyon iş akışına alternatif sunar.
   1. Başlatma reaktifini 4.1.1'de tarif edildiği gibi hemen kullanmadan önce hazırlayın.
   2. Mikroplakayı plaka okuyucudan çıkarın ve hızlıca işlem için kalibre edilmiş pipet veya çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 20 μL başlatma reaktifini manuel olarak ekleyin.
   3. Plakayı hemen okuyucuya geri getirin ve gecikmeden floresans ölçümüne başlayın.
      NOT: Değişkenliği azaltmak için reaktif ekleme ile ölçüm başlangıcı arasındaki süreyi (
4. Kinetik okuma
   1. Her 30 saniyede bir 70 dakika boyunca floresansı kaydedin.
   2. Ölçüm sırasında plakayı 37 °C'de tutun.

5. Veri analizi

1. Verileri analiz için hazırlayın
   1. Plaka okuyucudan kinetik floresans verilerini, kuyu başına zaman noktaları ve floresans değerleriyle bir tablo olarak dışa aktarın.
   2. Ham floresans verilerini Excel veya başka bir programla ilk türevi hesaplayarak enzim üretim eğrilerine dönüştürebilirsiniz.
   3. Her kuyu için enzim üretim eğrilerini çizerek enzimatik reaksiyonu görselleştirin.
      NOT: Bu eğriler, trombin veya plazmin oluşumunun zaman içindeki hızını temsil eder ve şekillerde gösterilen grafiksel çıktıya karşılık gelir.
2. Trombin üretim eğrilerini analiz edin
   1. Trombin üretim eğrisinden aşağıdaki parametreleri belirleyin ( bkz. Şekil 1):
      1. Gecikme süresi: Trombin üretim eğrisinin tutarlı şekilde yükseldiği ve trombin zirve yüksekliğinin %8'ine ulaştığı zaman noktası.
      2. Trombin zirve yüksekliği: Y eksenindeki maksimum sinyal değeri (yani maksimum trombin üretim hızı).
      3. Trombin Zirve Zamanı: Testin başlangıcından trombin zirvesi yüksekliğine kadar olan süre.
      4. Trombin potansiyeli (trombin üretim eğrisinin altındaki alan): Gecikme süresinden trombin sinyalinin temel seviyeye dönmesine kadar olan eğri altındaki alan.
         NOT: Trombin potansiyeli, test koşulları altında örnekin toplam trombin üretim kapasitesini yansıtır.
3. Plazmin üretim eğrilerini analiz edin
   1. Plazmin üretim eğrisinden aşağıdaki parametreleri belirleyin ( bkz. Şekil 2):
      1. Fibrin lizis süresi: Plazmin üretiminin başlangıcından (yani, plazmin üretim eğrisinin tutarlı şekilde yükselip plazmin zirvesinin %8'ine ulaştığı zaman noktası) plazmin zirvesine ulaştığı noktaya kadar olan süre.
      2. Plazmin zirve yüksekliği: Eğrideki ilk belirgin maksimum, plazmin üretimindeki ilk patlamaya karşılık gelir ve plazmin üretim eğrisinin ikinci türevinin (üç dakikalık hareketli ortalamaya dayanarak) plazmin üretiminin başlamasından sonra sıfıra ulaştığı noktada belirlenir.
      3. Plazmin potansiyeli (plazmin üretim eğrisinin altındaki alan): Plazmin üretiminin başlangıcından plazmin zirvesi zamanına kadar olan eğrinin altındaki alan.
         NOT: Sinyal dalgalanmaları ilk plazmin zirvesinden sonra gerçekleşir ve plazmin üretim parametrelerinin analizine dahil edilmez.
4. Parametreleri manuel olarak veya özel yazılım kullanarak çıkarın
   1. Microsoft Excel, GraphPad Prism veya özel bir betik (örneğin, Python veya R'de) kullanarak kinetik parametreleri çıkarın.
   2. Ham verileri, çizilmiş eğrileri ve hesaplanan parametreleri arşivleme ve gelecekteki referans için yapılandırılmış bir formatta kaydedin.
      NOT: Makro kullanıyorsanız, otomatik çıktıya güvenmeden önce tüm parametrelerin doğruluğunu görsel ve manuel olarak doğrulayın. Veri dönüşümü için makromuz talep üzerine mevcuttur.
5. Standartlaştırma ve normalizasyon
   1. Sağlıklı bağışçılardan alınan 40 bireysel örnek normalizasyon için kullanılan NPP örneğiyle paralel olarak ölçülerek fizyolojik bir referans oluşturun. Bu adımı her NPP partisi için bir kez yapın.
   2. Sağlıklı bağışçıların ortalama trombin ve plazmin üretim parametre değerlerini hesaplayın ve aynı koşuda elde edilen karşılık gelen NPP değerlerine oranlarını belirleyin.
   3. Belirli bir denemedeki her hasta örneği için, önce aynı denemede ölçülen NPP değerine trombin veya plazmin üretim parametresi normalleştirilmelidir.
   4. Bu sonucu aynı AES partisi için önceden belirlenen sağlıklı bağışçı-NPP oranına böl (bkz. adım 5.6.2). Bu, ortalama sağlıklı bireye göre normalize edilmiş göreceli bir değer elde eder ve NPP kullanılarak sıralar arası varyasyon için standartlaştırma sağlanır.
   5. Parametre değerlerini, sağlıklı bireylerin ortalama değerine göre yüzde olarak ifade edin (%100 olarak tanımlanır). Hasta örnek sonuçlarını buna göre sunun.
      NOT: Her bireysel hasta örneği için göreli parametre değerleri aşağıdaki formülle hesaplanır; burada a testi hasta örneğinin ölçüm koşusuna, run b ise sağlıklı donör örneklerinin aynı NPP partisiyle paralel ölçülmesine işaret eder. Veri normalizasyonu hesaplamalarını içeren Excel dosyamız, talep üzerine mevcuttur.
      

6. Kalibrasyon eğrilerinin oluşturulması

1. Trombin kalibrasyon eğrisini hazırlayın
   1. Üreticinin veri sayfasında talimatlara göre liyofilize insan α-trombinini yeniden yapılandırın.
      NOT: Örneğin, veri sayfası 100 μL suda 3,34 mg/mL verimini sağlamak için yeniden yapılandırılmayı belirtiyorsa, bu 100 μL'de 0,334 mg'a karşılık gelir.
   2. Yeniden oluşturulmuş trombini Tris/NaCl tamponu içinde 1:10 oranında seyreltin.
      NOT: Bu, 36.700 g/mol moleküler ağırlığına dayanarak yaklaşık 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL) stok konsantrasyonu elde eder.
   3. Tris/NaCl tamponu içinde bir seyreltme serisi hazırlayarak testteki nihai trombin konsantrasyonlarını 0 ile 152 nmol/L arasında ölçemek için hazırlanır.
   4. Pipet trombinini zaten tampon içeren seçilmiş kuyulara göndererek her kuyu başına toplam 100 μL hacme ulaşılır.
   5. Pompa 1 için substrat çözeltisini, 1.2.2. adımdan 300 μL Tris/NaCl tamponu ile 200 μL trombin substratı karıştırarak hazırlayın.
   6. Bu çözeltiyi 400 μL karışım ile 360 μL Tris/NaCl tamponu birleştirerek daha da seyreltmek için kullanılır.
   7. Her kalibrasyon kuyusuna bu substrat karışımından 20 μL eklenir, böylece toplam test hacmi 120 μL'ye çıkarılır.
   8. Plakayı nazikçe karıştırın ve plaka okuyucuya yerleştirin. Kinetik testi 25 döngü boyunca, bölüm 2'de tanımlanan aynı floresan ayarlarıyla çalıştırın.
   9. Ham floresans verilerini dışa aktarın ve her trombin konsantrasyonu için GraphPad Prism veya eşdeğer yazılım kullanarak başlangıç eğimini (döngü başına floresans artış hızı) belirleyin.
   10. Başlangıç eğimi ve trombin konsantrasyonunu çizerek standart bir eğri oluşturun.
       NOT: Tüm tamponların 37 °C'ye kadar önceden ısıtıldığından emin olun ve buz üzerinde enzimleri işleyin. Her zaman taze seyreltmeler hazırlayın ve iyice karıştırın. Ortaya çıkan standart eğri, bölüm 5'te tanımlanan makro kullanılarak bilinmeyen örneklerdeki göreli trombin aktivitesini hesaplamak için kullanılır.
2. Plazmin kalibrasyon eğrisinin hazırlanması
   1. Üreticinin talimatlarına göre damıtılmış suda (örneğin, 0,543 mL) liyofilize plazmin yeniden oluşturulur.
      NOT: Plazminin moleküler ağırlığı 75.400 g/mol'dur. Ortaya çıkan stok konsantrasyonu yaklaşık 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL) olup, 1 mg içinde 0,543 mL varsayılmaktadır.
   2. Tris/NaCl tamponunda bir seyreltme serisi hazırlayarak testteki nihai plazmin konsantrasyonlarını 66 ila 532 nmol/L arasında elde edin.
   3. Pipet plazmini Tris/NaCl tamponu içeren kuyulara göndererek kuyu başına 100 μL nihai hacme ulaşılır.
   4. Pompa 1 için substrat çözeltisini, 1.2.5. adımdan itibaren 680 μL Tris/NaCl tamponu ile 80 μL plazmin/rodamin substratı (gerekirse önceden seyreltilmiş 1:1) karıştırarak hazırlayın.
   5. Her kalibrasyon kuyusuna bu substrat çözeltisinden 20 μL eklenir ve toplam hacim 120 μL'ye ulaşır.
   6. Plakayı nazikçe karıştırın ve plaka okuyucuya yerleştirin. Kinetik testi, Bölüm 2'de açıklanan aynı floresans ayarlarıyla 25 döngü boyunca çalıştırın.
   7. Ham floresans verilerini dışa aktarın ve her plazmin konsantrasyonu için floresans artışının başlangıç eğimini, GraphPad Prism veya eşdeğer yazılım kullanarak kinetik eğrinin lineer fazına doğrusal regresyon uygulayarak belirleyin.
   8. Başlangıç eğimi ve plazmin konsantrasyonunu çizerek standart bir eğri oluşturun.
      NOT: Partiden partiye plazmin aktivitesinde değişiklik olduğundan, kalibrasyon her yeni partide tekrarlanmalıdır. Beklenmedik yüksek bir aktivite gözlemlenirse, kalibrasyon serisi hazırlanmadan önce stokun 1:2 seyreltilmesi önerilir.
3. Nicel için kalibrasyon eğrisini kullanın
   1. Bölüm 6'da oluşturulan kalibrasyon eğrilerini kullanarak floresans eğimi değerlerini göreceli enzim aktivitesine dönüştürebilirsiniz.
   2. Bilinmeyen örnekleri interpolasyon için kalibrasyon eğrisinin yalnızca doğrusal kısmını kullanın.

Sonuçlar

Nijmegen Hemostaz Testi (NHA) ile elde edilen temsili trombin ve plazmin üretim eğrileri Şekil 3'te gösterilmiştir. Her eğrinin sinyal yoğunluğu, eşzamanlı ölçülen normal havuzlu plazma (NPP) örneğine göre yüzde olarak ifade edilir. Her çalışmada NPP içeren bir örnek, analiz geçerliliğini doğrulamak ve karşılaştırma yapılabilirliğini sağlamak için iç kontrol olarak dahil edilir.

Şekil 3A,B

Tartışma

Nijmegen Hemostaz Testi (NHA), trombositten yoksun plazmada trombin ve plazmin üretiminin eşzamanlı ve zaman çözünürcesiyle ölçülmesini sağlayan çift enzimli bir florojenik testtir. Her iki süreci tek bir kuyuda yakalayarak, yöntem ikincil hemostaz ve fibrinolizin yüksek çözünürlüklü kinetik analizini kolaylaştırır. Bu çift okuma, geleneksel testlere göre belirgin metodolojik avantajlar sunar ve koagulasyon faktör eksiklikleri, hiperfibrinolitik durumlar ve diğer hemostatik denge bozuklu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Malzemeler
Kalsiyum kloridihidrat (CaCl2.2H2O)	Merck	1.02382
Sefalin (C.K. Prest 5 APTT reaktif kiti)	Stago	00847	6 ay boyunca -20 & derece C derecesinde stabil;
Distile su			Açılış tarihini kaydet. İlk açıldıktan sonra 1 gün içinde kullanın.
Dimetilsülfoksit (DMSO)	Merck	1.02950.0500
İnsan alfa-trombini	Enzim Araştırma Laboratuvarları	HT 1002a	Kutuda analiz sertifikası içeren bir broşür bulunur. Eklenecek tampon hacmi belirtilen konsantrasyona bağlıdır ve 1 µ 120 ve mikro içinde eklenen insan trombini L; L reaktif, nihai konsantrasyon olarak 76 nmol/L verir.
İnsan plazmini	Enzim Araştırma Laboratuvarları	HPlas	Kutuda analiz sertifikası içeren bir broşür bulunur. Eklenecek tampon hacmi belirtilen konsantrasyona bağlıdır ve 1 µ 120 ve mikro maddede eklenen insan plazmini L; L reaktif, nihai konsantrasyon 200 nmol/L olur.
Normal birikmiş plazma	Şirket içi hazırlık	Geçerli değil	Buzda tutulursa donurken 3 saat stabil kalıyor.
Hasta plazması	Geçerli değil	Geçerli değil
Plazmin substratı (CBZ-L-fenilalanil-L-arginin amid)-rodamin-morfolino üre	Symeres		6 ay boyunca -80 & derece C.  ile stabil;
Rekombinant insan dokusu faktörü (TF): Innovin	Dade Behring	B4212	6 ay boyunca -80 & derece C.  ile stabil;
Rekombinant doku tipi plazminogen aktivatörü (tPA): Alteplaz/Actilyse	Boehringer Ingelheim		12 ay boyunca -80 & derece C derecesinde stabil;
Tris(hidroksilemetil)aminometan (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Tris-NaCl tamponu, pH 7,4 (TBS)	Şirket içi hazırlık	Geçerli değil
Tris-NaCl-CaCl2 tampon, pH 7,4 (TBS-Ca)	Şirket içi hazırlık	Geçerli değil
Trombin substratı Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-metilkomarin	Symeres		6 ay boyunca -80 & derece C.  ile stabil;
Ekipman
Fluostar Optima florimetre / mikroplaka okuyucu, sıcaklık kontrolü ve reaktif enjektörleri ile	BMG Labtech
96 kuyu mikrotiter plakası, polistiren, düz tabanlı, siyah, orta bağlanma yüzeyi (Microlon eşdeğeri)	Greiner BIO-ONE	655076
Analitik denge (üstten yükleme dengesi)
Mavi pipet uçları (100-1000 ve mikro; L)
Sitrat Kan Toplama Tüpleri 3mL (%3,2 Sitrat)	BD Vacutainer
Buz kovası
Buz makinesi
İnkübatör / mikroplaka çalkalayıcı
Manyetik karıştırıcı
Mikrosantrifüj tüplü rafı
Mikrosantrifüj tüpleri, kapanabilir
pH metre
Pipet uçları 0.1-10 ve mikro; L, steril olmayan
Pipetler (2, 10, 20, 100 ve 1000 & mikro; L)
Tornavida (prob olarak kullanılıyor)
Tüp mikser
Su banyosu
Sarı pipet uçları (20-200 ve mikro; L)