Optofluidik Analizle Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin Multimodal Fonksiyonelliğinin Tek Hücre Çözünürlükte Değerlendirilmesi

Summary

CAR-T hücreleriyle yapılan adoptive T hücre tedavisi, kan kanserlerinin tedavisinde umut vaat ediyor, ancak kalıcı yanıtlar tutarsız kalıyor. Polifonksiyonel T hücreleri remisyon dayanıklılığıyla korelasyonludur, ancak standart testler anahtar alt popülasyonları gizler. Daha ileri çalışmalar için yüksek işlevsel CAR-T hücrelerini tespit edip izole etmek amacıyla optofluidik platformu kullanarak tek hücreli bir iş akışını sunuyoruz.

Abstract

Benimseyen T hücresi terapisi, otolog T hücrelerinin genetik olarak modifiye edilip, tümör hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) ifade edilmesi için ex vivo genişleme ve hastaya yeniden infuzyon edilmesi için yeni bir tedavi paradigmasıdır. İlerlemiş hematolojik maligniteleri olan hastalarda anti-tümör etkisinin dikkat çekici gösterilmesine rağmen, vakaların önemli bir kısmında uzun süreli yanıtlar ortaya çıkmaz. Klinik sonuçlardaki değişkenliğe birkaç kendine özgü faktör katkıda bulunabilse de, pre-infüzyon CAR-T hücre ürünündeki polifonksiyonel T hücrelerinin oranının kanser remisyonunun dayanıklılığı ile güçlü bir şekilde ilişkilendirildiğine dair giderek artan kanıtlar bulunmaktadır. Ne yazık ki, CAR-T hücre ürünlerinin standart değerlendirmeleri şu anda toplu popülasyon ölçümlerine veya terminal testlere dayanmakta, işlevsel özelliklerin arttığı alt popülasyonları izole etme ve inceleme imkanını sınırlamaktadır. Burada, optofluidik platformdan yararlanarak hem sitokin salgılanma profilini hem de bireysel CAR-T hücrelerinin CD137 ekspresyonuyla aktivasyonunu değerlendiren bir iş akışını gösteriyoruz; bu da isteğe bağlı olarak sitotoksik aktivite değerlendirmesiyle birleştirilebilir. En yüksek çoklu modal işlevselliğe sahip hücreler, yeni nesil CAR-T hücre tedavilerinin tasarımını bilgilendirmek için ek analizler için izole edilebilir.

Introduction

Kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden T hücreleri, ileri hematolojik maligniteleri olan hastalarda dikkat çekici anti-tümör etkisi^{göstermiştir 1,2}. Ancak, tedavi edilen hastaların önemli bir kısmı sonunda nükslere geri dönmek, daha büyük fonksiyonel kalıcı CAR-T hücre ürünlerinin^{geliştirilmesi ihtiyacını ortaya koymaktadır} 3,4,5,6. Birçok kendine özgü faktör klinik sonuçlardaki değişkenliğe katkıda bulunabilse de, pre-infüzyon CAR-T hücre ürünündeki polifonksiyonel T hücrelerinin oranının kanser remisyonunun dayanıklılığı ile güçlü şekilde ilişkili olduğuna dair giderek artan kanıtlar bulunmaktadır. Böylece, CAR-T hücrelerini daha yüksek polifonksiyonel olarak zenginleştirme veya mühendislik stratejileri, uzun süreli klinik yanıtları artırma potansiyeline sahip terapötik ürünler ^{üretebilir 6,7,8}. Ne yazık ki, CAR-T hücre fonksiyonlarını karakterize etmek için mevcut yöntemler büyük ölçüde toplu popülasyon ölçümlerine veya terminal testlere dayanmaktadır. Bunlar, çok işlevli özelliklere sahip belirli alt popülasyonları izole etme ve inceleme yeteneğini sınırlar. Örneğin, sitokin salgılanması genellikle toplu süpernatantlardan veya hücre içi boyama yoluyla değerlendirilir. İkincisi, tek hücre^{seviyesi 9'daki} bilgi karşılığında hücre fiksasyonunu gerektirir. Benzer şekilde, sitotoksik potansiyel en yaygın olarak toplu CAR-T hücre popülasyonları için, T-hücre/hedef hücre ortak^{kültürü 10} sonrası hedef-hücre canlılığının kaybının nicelendirilmesiyle değerlendirilir. Canlı CAR-T hücrelerinin sitokin salgılanması, aktivasyonu ve sitolitik aktivitesinin tek hücre çözünürlüğünde değerlendirebilme yeteneği, daha dayanıklı anti-tümör etkinliğine sahip terapötik ürünlerin geliştirilmesini teşvik edebilir.

Burada, optofluidik tek hücreli platformla çoklu modal işlevsellik için bireysel CAR-T hücrelerinin eşzamanlı profilini sunan bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Sistem, sitokin yakalama boncuklarını ve bireysel hücreleri mekânsal olarak ayrılmış penallara taşımak için opto-elektriksel konumlandırma (OEP) kullanır ve böylece tek CAR-T hücrelerinin fonksiyonel değerlendirmelerini mümkün kılar (Şekil 2A). Bu protokolde, viral olmayan gen transferiyle CAR-T hücreleri üretmeyi ve antijen ekspresyon ve antijen negatif hedef hücrelerle birlikte kültür sırasında bireysel CAR-T hücrelerinin CD137 yoluyla sitokin salgılanmasını ve aktivasyonunu değerlendiriyoruz (Şekil 3 ve Şekil 4)¹¹. Değiştirilmiş hücre ürünleri arasında sitokin ve aktivasyon profillerini ayırt etme potansiyeli, standart CAR-T hücrelerinin c-Jun aşırı eksprese eden hücrelerle karşılaştırılması^{ile örneklenir 6}. Tek hedef hücrelere karşı sitotoksik aktivite, optofluidik platformda kaspaze veya floresans tabanlı okumalar kullanılarak da değerlendirilebilir (Şekil 2B). Ancak, etkileşim kinetiklerini belirlemek için zaman geçişi analizi gereklidir ve bu durum her CAR yapısı ve deneyi için önemli ölçüde değişebilir. Benzer şekilde, kronik uyarıyı taklit eden tekrarlayan öldürme testleri alternatif bir iş akışı gerektirir. Bu nedenle, bu makalede sitotoksisite değerlendirmesinin temel prosedürünü açıklıyoruz ancak ayrıntılı uygulamalarını tartışmıyoruz.

Seçilen değerlendirme ve hedef özelliklere dayanarak, en yüksek çoklu modal işlevselliğe sahip canlı CAR-T hücreleri cihazdan boşaltılıp, 96 kuyuyla plaka(lar)daki bireysel kuyulara daha fazla inceleme için aktarılabilir (Şekil 2C).

Protocol

NOT: Buffer ve ortam hazırlığı Tablo 1'de verilmiştir.

1. CD8 T hücresinin lökosit indirgeme sistemi konilerinden izolasyonu

NOT: Tüm adımları steril, aseptik teknikle doku kültürü biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin. Sulandırma, yıkama ve yeniden süspansiyon için tüm maddeler işlem boyunca 4 °C'de tutulmalıdır.

1. İki 50 mL'lik konik tüpün (ayırma tüpün) her birine 15 mL hücre ayırma ortamı (yoğunluk 1.077 g/mL) ekleyin.
2. Lökosit indirgem sistemi (LRS) konik tarafı aşağı, kapalı olmayan 50 mL konik bir tüpün üzerinde tutun. Sterilize edilmiş makas kullanarak, LRS konusunun altına uzanan plastik boruyu kesin. LRS konisini açık 50 mL'lik konik tüpün üstüne koyup yukarıdaki plastik boruyu kesin. 50 mL konik tüpten yaklaşık 8-10 mL kan toplayın.
3. 50 mL konik tüpü PBS + EDTA ile 50 mL'ye doldurun (madde ve tampon listesinde belirtildiği gibi hazırlanır) ve seyreltilmiş kanı karıştırmak için pipet yapın. Sulandırılmış kanı iki ayırma tüpü arasında eşit olarak böl.
4. Ayırma tüplerini seyreltilmiş kanla 750 x g ile oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca santrifüj edin; 9'u hızlandırma, 2'si yavaşlama olarak kullanın.
5. 10 mL serolojik pipet kullanarak, her ayrım borusundan buffy tabakayı dikkatlice toplayıp taze 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
6. Her 50 mL konik tüpü 40 mL'ye kadar PBS + EDTA ile doldurun ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için tekrar askıya alın. Tek hücreli süspansiyonları 300 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst natantı aspire edin.
7. Hücre pelletlerini 40 mL PBS + EDTA ile yeniden süsküp birleştirin. Tek hücreli süspansiyonu 300 x g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendirin. Üst natantı aspire edin.
8. Hücre pelletini PBS + EDTA ile yeniden süzüldürün ve periferik kan mononükleer hücre (PBMC) süspansiyonunun canlı hücre yoğunluğunu Trypan Blue boyama ile belirleyin.
   NOT: Trypan Blue, DNA'yı boyayan canlı hücre geçirimsiz bir boyadır. Böylece, hem canlı PBMC'ler hem de çekirdeksiz hücreler (yani kırmızı kan hücreleri) lekesiz kalacaktır. Canlı PBMC yoğunluğunu belirlerken küçük hücrelerin (örneğin kırmızı kan hücreleri) dışlanması önemlidir.
9. İstenen PBMC sayısını CD8⁺ T hücrelerinin manyetik zenginleştirmesi için yeni 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Manyetik zenginleştirme için gereken başlangıç PBMC miktarı olarak istenen CD8⁺ T hücre sayısının 10 katı tahmin edilmesi. İşlem sırasında reaktifleri soğuk tutun.
10. PBMC hücre süspansiyonunu 300 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın. Üst natantı aspire edin. Hücre pelletini 1 x 107^{hücre başına} 40 μL MACS Buffer'da (medya ve tamponlar listesinde belirtildiği gibi hazırlanmış) tekrar askıya alın.
11. 1 x 10⁷ hücre başına 10 μL CD8⁺ T hücresi Biotin-Ab Kokteyli ekleyin. Pipotle karıştırın ve 4 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
12. 1 x 10⁷ hücre başına 30 μL MACS Buffer ekleyin. 1 x 10⁷ hücre başına 20 μL CD8⁺ T hücre mikroboncuk ekleyin. Pipotle karıştırın ve 4 °C'de 10 dakika kuluçka yapın.
13. Önceden soğutulan LS kolonlarını mıknatısın üzerine yerleştirin. Sıvı akışını toplamak için altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin. Her LS sütununu 3 mL MACS Buffer ile dengeleyin.
14. Toplama tüpü ile aynı 15 mL konik tüpü kullanarak, hücre süspansiyonunu dengelenmiş LS kolonuna uygular. Kolonu 1 mL MACS Buffer ile 3 kez yıkayın. Her 1 mL yıkamanın LS kolonundan tamamen geçmesine izin verin, ardından bir sonraki yıkamayı uygulayın.
15. Toplanan hücreleri dikkatlice yeniden askıya alın ve zenginleştirilmiş CD8⁺ T hücre süspansiyonunun uygulanabilir hücre yoğunluğunu Trypan Blue boyama ile belirleyin.

2. CD8⁺ T hücrelerinin boncuk bazlı aktivasyonu

1. T hücreleri:boncukların 1:1 oranında insan CD3/CD28 boncuk sayısını hesaplayın. Aktivasyon boncuk stokunda 25 μL başına 1 x 10⁶ boncuk bulunur.
2. Aktivasyon boncuklarını en az 30 saniye nazikçe girdabla girdabla tutun, ardından hesaplanan boncuk süspansiyon hacmini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Boncukları ve girdapları en az 5 saniye yıkamak için eşit hacimde ortam ekleyin.
3. 15 mL'lik konik tüpü ilgili mıknatısa 1 dakika boyunca yerleştirerek borunun yanlarındaki boncukları toplayın. Süpernatantı aspire edin ve atın.
4. Nihai T hücresi konsantrasyonu için gereken ortam hacmini 1 x 10⁶ T hücre/mL hesaplayın. 15 mL'lik konik tüpü mıknatıstan çıkarın ve hesaplanan kültür ortamı hacminde tekrar süzülün. Rekombinant insan IL-2'sini 50 U/mL nihai konsantrasyona ekleyin.
5. Tam takviyeli ortamı T hücrelerini içeren tüpe aktarın ve yeniden süspansiyona alın. Hücre süspansiyonunu uygun bir hücre kültürü formatına (örneğin, 48 kuyu plakalarında 1 mL, 24 kuyu plakalarında 2 mL) tohumlayın ve 40 saat kuluçka yapın.

3. Nükleofeksiyon yoluyla viral olmayan gen transferiyle CAR-T hücresi üretimi

NOT: Ortamın (37 °C), reaktiflerin (RT) ve santrifüjün (RT) önceden ısıtılması, yüksek gen transfer verimliliği sağlamak için kritiktir.

1. Her nükleofeksiyon durumu için 1 mL hücre kültürü ortamı içeren 48 kuyruklu bir plaka hazırlayın ve etiketleyin. Plakayı en az 30 dakika kuluçka edin, böylece fizyolojik pH'a sahip sıcak ve CO₂ ayarlı bir ortam sağlanır.
2. Nükleofektörü açın ve 16 kuyu şeridi içinde çekirdeklenecek pozisyonları seçin. Uygun programı seçin (örneğin, yüksek verimlilik için FI-115 veya daha yüksek kullanılabilirlik için EO-115).
3. T hücreleriyle birlikte hücre kültür plakasını inkübatörden çıkarıp mikroskopla hücrelerin görsel görünümünü kontrol edin; böylece aktivasyonun başarılı olup olmadığına dair ilk izlenim alın. Başarıyla aktive edilen T hücreleri eşit kümelenme ve büyümüş hücre şekli göstermelidir. Taze ortamdan hafif turuncu tona ayrılan orta renk, aktivasyonun daha aktif bir metabolik duruma yol açtığını gösterir ve iyi bir işaret olarak kabul edilir. Bu noktada, erken aktivasyon belirteçleri CD25 ve CD69'un akış-sitometrik analizi aktivasyonu doğrulayabilir.
4. Aktive edilmiş T hücrelerini yeniden askıya almak, hasat etmek ve saymak. Şart başına 1.2 ila 2 x 10⁶ T hücresi dikkate alınarak gereken T hücre sayısını hesaplayın. Hesaplanan hacmi yeni 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve RT'de 10 dakika boyunca 200 x g oranında santrifüj yapın.
5. Süpernatan solu ve 10 mL sıcak PBS ile T hücrelerini aspire edin ve atın. RT'de 10 dakika boyunca 200 x g santrifüj yapın. Santrifüj süresini, genellikle 1 μg/μL DNA konsantrasyonundan oluşan CAR kodlayan plazmidleri eritmek için kullanın. Transpozaz kodlayan (SB100x) plazmid (1,0 μg) veya minicircle (0,5 μg) ile birlikte CAR kodlayan plazmid (1,0 μg) veya minicircle (0,6 μg) ile birlikte, nükleofeksiyon koşulu başına bireysel DNAssız 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
6. Yeterli miktarda P3 Nükleofektor Çözeltisi ve ek olarak hazırlanın (şart şartı: 16,4 μL Nükleofektör Çözeltisi + 3,6 μL Takviye).
7. T hücrelerini içeren 15 mL konik tüpü santrifüjden çıkarın, aspirasyon süperatını ve 200 x g hassasiyetinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece altta kalıntı sıvı toplanın. 200 μL'lik bir pipet alarak hücre pelletine dokunmadan mümkün olduğunca çok tamponu dikkatlice çıkarın.
8. Hemen koşul başına 20 μL P3 tamponunda T hücresi peletinin yeniden süspansiyonuna devam edin (materyal listesinde belirtildiği gibi). P3 tamponunda 20 μL hücre süspansiyonunu ilgili yapıları içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın, hava girmeden nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonunu 16 delikli nükleofeksiyon şeridine aktarın. Kuyunun dibinden havayı nazikçe çıkarın.
9. 16 kuyu şeridi 4-D Nükleofektor Sistemine yerleştirin ve nükleofeksiyon işlemine başlayın. Başarılı nükleofeksiyondan sonra, her seçilmiş kuyu için ekranda yeşil bir haç görünmelidir.
10. Hazırlanmış 48 kuyu tabaktan hemen 100 μL önceden ısıtılmış ortam ekleyin, ardından 16 kuyruklu şeridi kuluçka aşamasında 10 dakika kuluçka yapın.
11. Dikkatlice 2 ila 3 kez tekrar süzül, hücre süspansiyonunu hazırlanmış 48 kuyu plakaya aktarın ve tekrar kuluçka makinesine yerleştirin.
12. 4-5 saat sonra, her kuyudan dikkatlice 500 μL çıkarın ve 500 μL taze ve önceden ısıtılmış kültür ortamı ile 50 U/mL rekombinant insan IL-2 ile dikkatlice ekleyin.
13. Hücreleri genişletmek için her iki günde bir düzenli madde değişimi yapın; hücre yoğunluğunu 0,5 ile 2 x 10⁶ T hücre/mL arasında koruyun.
14. 6. günde, CD3/CD28 aktivasyon boncuklarını çıkarın. T hücrelerini 10 kat nazikçe yeniden süspansiyon ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktararak hasat edin. 15 mL'lik konik tüpü ilgili mıknatısa 1 dakika yerleştirin.
15. Hücre süspansiyonu aspire edilir, taze bir kültür plakasına aktarılır ve hücreleri IL-2 ile takviye edilmiş taze hücre kültür ortamıyla 50 U/mL nihai konsantrasyona besler. Boncuklar, mıknatıstaki kalan 15 mL'lik konik tüpün yan duvarlarında görünür kalmalıdır.
16. 7. gün gen transfer verimliliğini, ilgili CAR veya vekil belirteç ifadesinin akış-sitometrik analiziyle analiz edin, ardından 8. gün transgen pozitif CAR T hücrelerinin manyetik sıralamasına geçin ( Ek Şekil 1'de Gating Strategy).

4. Transgen pozitif T hücrelerinin manyetik zenginlenmesi

NOT: Tüm adımları steril, aseptik teknikle doku kültürü biyogüvenlik dolabında gerçekleştirin. Sulandırma, yıkama ve yeniden süspansiyon için tüm maddeler işlem boyunca 4 °C'de tutulmalıdır.

1. T hücrelerini nazikçe yeniden süspansiyon ve 15 mL konik tüplere aktararak hasat edin. T hücrelerini sayın, manyetik olarak zenginleştirilecek hücrelerin sayısını alın ve 300 x g seviyesinde 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
2. Süpernatantı aspire edip atıp 10 mL MACS tamponunda tekrar süzülerek yıkayın. Santrifüj 10 dakika boyunca 300 x g boyutunda kullanın. Aspirasyon ve üst örtüyünü at.
3. Taşıyıcı belirteçte (örneğin, tEGFR) karşı yönlendirilen biyotinillenmiş antikor miktarını hesaplayın. Genellikle, antikor 1 x 10⁶ hücre başına 1 μL olarak titrlenmelidir.
4. T hücrelerini 1 x 10⁷ hücre/mL yoğunlukta yeniden süzülme ve hesaplanan biyotinile antikor miktarını ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
5. 10 mL MACS tamponu ekleyerek yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 x g oranında santrifüj yapın. Aspirasyon ve üst örtüyünü at.
6. T hücrelerini 80 μL MACS tamponunda 1 x 10⁷ hücre olarak yeniden askıya alın. 1 x 10⁷ hücre başına 20 μL hacimde antibiyotin mikroboncukları ekleyin. İyi karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
7. 10 mL MACS tamponu ekleyerek yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 x g oranında santrifüj yapın. Aspirasyon ve üst örtüyünü at. 500 μL MACS tamponunda hücreleri yeniden süzülür.
8. Önceden soğutulan LS kolonlarını mıknatısın üzerine yerleştirin. Sıvı akışını toplamak için altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin.
9. Her LS sütununu 3 mL MACS Buffer ile dengeleyin. Toplama tüpü ile aynı 15 mL konik tüpü kullanarak, hücre süspansiyonunu dengelenmiş LS kolonuna uygular.
10. Kolonu 1 mL MACS Buffer ile 3 kez yıkayın. Her 1 mL yıkamanın LS kolonundan tamamen geçmesine izin verin, ardından bir sonraki yıkamayı uygulayın.
11. Transgen pozitif hücreleri toplamak için, LS sütununu mıknatıstan alıp yeni 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. 5 mL MACS tamponu ekleyin ve sıvıyı kolondan nazikçe dışarı itin.
12. İzole hücreleri sayın ve 300 x g hassasiyetinde 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Transgen pozitif hücreleri uygun bir hacimde IL-2 takviyesi altında yeniden süspansiyona alın ve fonksiyonel ve/veya fenotipik değerlendirmeler yapılana kadar kuluçka yapın. İş akışına başlamadan önce CAR veya vekil transdüksiyon belirteci için boyama ile saflık kontrolü yapın (Ek Şekil 2).

5. Sistem hazırlığı

1. Cihazı açın ve Cell Analysis Suite (CAS) yazılımını açın. Atık toplama konteynerinin boş olduğundan emin olun. Nem verici kolonunda su olduğundan emin olun.
2. İş akışları paneline gidin. Sistem kurulumu sırasında önceden yüklenen Full Clean iş akışını açın.
   NOT: Tam Temizlik iş akışının, enstrümanda bir deneye başladıktan sonraki 72 saat içinde çalıştırılması önerilir.
3. Tüm kontrolleri yapın ve Başlat'a tıklayarak devam edin. Istendiğinde, her bir reaktif yuvasındaki konik tüpleri ve reaktif şişelerini BLI temizleme çözeltisi olan yeni kaplarla değiştirin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
4. Yönlendirildiğinde, her bir reaktif yuvasındaki konik tüpleri ve reaktif şişelerini steril suyla taze kaplarla değiştirin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
5. Uçuş öncesi kontrol iş akışını açın (sistem kurulumu sırasında önceden yüklenmiş). Tüm kontrolleri yapın ve Başlat'a tıklayarak devam edin.
6. 50 mL konik bir tüp ve 2 mL ıslatıcı çözelti hazırlayın. 39,6 mL 1x DPBS ve 400 μL ıslatıcı katkı içeren ayrı bir 50 mL konik tüp hazırlayın.
7. Sorulduğunda, Flush çipini optofluidik çip ile değiştirin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın. Yuvaları kapatmadan önce optofluidik çipin yüzeyini ve yuva ferrullarını %70 etanol ile dikkatlice temizleyin.
8. Istendiğinde, her bir reaktif yuvasındaki konik tüpleri ve reaktif şişelerini, uygun çözeltileri içeren yeni kaplarla değiştirin.

6. Analiz iş akışı oluşturma

1. İş akışları paneline gidin. Yeni iş akışı yarat (+) seçeneğini seçin, Opto T hücresi profilini seçin, ardından açılır menüden MCA ve Sitotoksisite Testi seçin.
2. Multiplex Cytokine Bead Load'a çift tıklayarak boncuk yükleme listesini genişletin. Eğer 3'ten az sitokin hedefi analiz ediliyorsa, X tuşuna tıklayarak boncuk yükleme listesinden sitokin boncuklarını silinsin.
3. Her alanı uygun boncuk türü, sitokin hedefi ve aktarma konumuyla güncelleyin.
   NOT: CAS yazılımı, boncuk yükleme girişlerinin nasıl düzenlendiğine bakılmaksızın, her sitokin yakalama boncukunu Cy5 parlaklığının azalma sırasına göre otomatik olarak yükler.
4. Hedef-hücre yük listesini genişletmek için Öncelikli APC Yükü ve Kontrol'e çift tıklayın. Birden fazla kontrol hedef hücresi ve 1 örnek hedef hücre hattı analiz edilirse, ek hücre yükleme adımları ekleyin.
5. Her alanı, istenen hedef-hücre satırı adı, istenen görüş alanı (FOV'lar) ile pen ve APC seçim kriterleriyle (hedef kalem seçimi (TPS) şablon dosyasını belirterek) güncelleyin.
6. T Hücre Yük Konfigürasyonu ve Çoklu Hücre Hatları seçeneğini seçin. Öncelikli T hücresi yük listesini genişletmek için Öncelikli T hücresi yükü'ne çift tıklayın.
7. Her alanı istenen T-hücre hat adı, istenen FOV'ları pen olarak ve T-hücre seçim kriterleriyle güncelledin (TPS şablon dosyasını belirterek).
8. Sitotoksisite testi ayarlarını genişletmek için Sitotoksisite Testi çift tıklayın. İş akışına özgü Görüntüleme Ayarları alanlarını istenen Analiz Süresi (h) ile güncelleyin.
9. Sitokin salgılanması testi için boyama protokolünü genişletmek için Fenotip ve Sitokin Testlerini çift tıklayın.
10. On Chip Boyama alanlarını, birincil ve ikincil lekeler için uygun ithalat konumuyla güncelleyin.
11. T Cell Unload tuşuna çift tıklayın ve boşaltma listesini genişletin. Çip başına # Dışa Aktarma (boşluklar dahil) alanını istenen ihracat sayısına güncelleyin. Yeni oluşturulan iş akışını kaydedip açın.

7. Sitokin yakalama boncuk yükü

1. Her boncuk şişesini sonikle ve/veya vortex ile birleştirerek yakalama boncuklarını tamamen yeniden askıya alın. Boncuk konsantrasyonunu hücre sayacı aracılığıyla belirleyin.
2. Boncuk yoğunluklarını 30 μL boncuk seyreltme tamponu içinde 4,5 x 10⁶ boncuk/mL (Tip A boncuklar) veya 4 x 10⁶ boncuk/mL (Tip B boncuklar) olarak ayarlayın.
3. Boncuk süspansiyonlarını örnek yükleme yuvasına yüklenmesi için uyarılana kadar 4 °C'de sakla. Tüm kontrolleri yapın ve Başlat'a tıklayarak devam edin.
4. Istendiğinde, sitokin boncuk süspansiyonunu 20 μL pipetle karıştırın ve boncuk süspansiyonunu uygun ithalat noktasına yükleyin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
5. Sorulduğunda, birkaç FOV'u görsel olarak inceleyerek yakalama boncuklarının akışkan kanallar arasında uygun yoğunlukta eşit dağılımla yüklendiğini doğrulayın. Yükleme dağılımı ve/veya yoğunluk optimal değilse, boncuk yüklemeyi yeniden denemek için Flush ve Import seçeneklerini seçin. Yük dağılımı ve yoğunluğu yeterliyse, boncukları yazmaya başlamak için Devam et.
6. Her sitokin yakalama boncukluğu için 7.3. adımı tekrarlayın.

8. Hedef hücre yükü

1. Her hedef hücre hattının canlı hücre yoğunluğunu Trypan Blue boyama ile belirleyin.
   NOT: Bu iş akışı, hedef hücrelerin aktif kültürlerden alındığını varsayar. Eğer kriyokonserve hücreler kullanılacaksa, hücrelerin en az bir geçiş sonrası kültüre sahip olduğundan ve en az %90 canlı olduğundan emin olun.
2. 1 x 10⁶ hedef hücreyi 1.7 mL mikrofüj tüpüne toplayın. 300 x g ile 5 dakika RT pozisyonunda santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin.
3. Her hedef hücre pelletini 100 μL Annexin V boyama çözeltisiyle yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika kuluçka, ışıktan korunur.
4. 400 μL 1x Annexin V Bağlama Tamponu ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın. 300 x g ile 5 dakika RT pozisyonunda santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin.
5. Her hedef hücre pelletini 250 μL Yükleme Medyası + CaCl_2'de yeniden askıya alın. Hedef hücre süspansiyonlarını örnek yükleme bölmesine yüklenmesi istenene kadar 4 °C'de sakla.
6. Yönlendirildiğinde, hedef hücreleri 200 μL pipetle yeniden askıya alın ve hedef hücre süspansiyonunu uygun ithalat konumuna yükleyin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
7. Sorulduğunda, hedef hücrelerin akışkanlık kanalları arasında uygun yoğunlukta eşit dağılımla yüklendiğini doğrulamak için birkaç FOV'u görsel olarak inceleyin. Yükleme dağılımı ve/veya yoğunluk optimal değilse, hedef hücre yüklemesini yeniden denemek için Flush ve Import seçeneklerini seçin. Yük dağılımı ve yoğunluğu yeterliyse, TPS kapı bağlamaya başlamak için Devam et.
8. Istendiğinde Manuel İşlemler'e gidin, ardından TPS'ye tıklayın ve istenen TPS şablonunu yükleyin.
9. TPS kapılarını tanımlamak için görüntülenecek optik filtre(ler) ve FOV'ları belirtin, ardından görüntü alımı başlatmak için Sadece Yakalama seçeneğine tıklayın.
10. Gating Yapılandırma Düzenleyicisini açın, Annexin için kontrol kutusuna tıklayın ve X Parametresi için Annexin V boyama için uygun kanalı seçin. Açılır menüden Log (Delta Median Brightness) seçeneğini seçin. Y parametresi için OEP'yi seçin. Açılır menüden En Yakın Komşu'yu seçin.
11. Çıkan kapının köşelerini sürükleyerek Annexin V^hi ve En Yakın^{Komşu düşük} hücrelerini hariç tutun, ardından dosya adını değiştirmeden TPS şablonunu kaydedin.
12. İş Akışları'na geri dönüp Devam et'e tıklayarak yazmaya devam edin. Her hedef hücre hattı için 8.7-8.11 adımlarını tekrarlayın.

9. T-hücre yükü

1. Her T-hücre hattının canlı hücre yoğunluğunu Trypan Blue boyama yoluyla belirleyin.
   NOT: Bu iş akışı, T hücrelerinin aktif kültürlerden elde edildiğini varsayar. Eğer kriyokonsertif hücreler kullanılacaksa, hücrelerin erime sonrasında gece boyunca kültürlendiğinden ve en az %90 canlı olduğundan emin olun.
2. 1 x 10^{adet 6} T hücresini 1.7 mL mikrofuge tüpüne toplayın. 300 x g ile 5 dakika RT pozisyonunda santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin.
3. Her hedef hücre pelletini 100 μL Annexin V boyama çözeltisiyle yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika kuluçka, ışıktan korunur.
4. 400 μL 1x Annexin V Bağlama Tamponu ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın. 300 x g ile 5 dakika RT pozisyonunda santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin.
5. Her T hücresi peletini 250 μL Yükleme Ortamı + CaCl_2'ye yeniden süsküyünüz. T-hücre süspansiyonlarını örnek yükleme yuvasına yüklenmesi istenene kadar 4 °C'de sakla.
6. Istendiğinde, hedef hücreleri 200 μL pipetle yeniden askıya alın ve T-hücre süspansiyonunu uygun ithalat noktasına yükleyin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
7. Sorulduğunda, birkaç FOV'u görsel olarak inceleyerek T hücrelerinin akışkanlık kanalları arasında uygun yoğunlukta eşit bir dağılımla yüklendiğini doğrulayın. Yükleme dağılımı ve/veya yoğunluk optimal değilse, T-hücre yüklemesini yeniden denemek için Flush ve Import seçeneklerini seçin. Yük dağılımı ve yoğunluğu yeterliyse, TPS kapı bağlamaya başlamak için Devam et.
8. Istendiğinde Manuel İşlemler'e gidin, ardından TPS'ye tıklayın ve istenen TPS şablonunu yükleyin.
9. TPS kapılarını tanımlamak için görüntülenecek optik filtre(ler) ve FOV'ları belirtin, ardından görüntü alımı başlatmak için Sadece Yakalama seçeneğine tıklayın.
10. Gating Yapılandırma Düzenleyicisini açın, Annexin için kontrol kutusuna tıklayın ve X Parametresi için Annexin V boyama için uygun kanalı seçin. Açılır menüden Log (Delta Median Brightness) seçeneğini seçin. Y parametresi için OEP'yi seçin. Açılır menüden En Yakın Komşu'yu seçin.
11. Çıkan kapının köşelerini sürükleyerek Annexin V^hi ve En Yakın^{Komşu düşük} hücrelerini hariç tutun, ardından dosya adını değiştirmeden TPS şablonunu kaydedin.
12. İş Akışları'na geri dönüp Devam et'e tıklayarak yazmaya devam edin. Her T hücre hattı için 9.7-9.11 adımlarını tekrarlayın.

10. Sitotoksisite testi

1. Perfüzyon medyası, 20 mL T-hücre ortamına 100 μL önceden çözülmüş NucView 530 Caspase-3 reaktifini ekleyerek 50 mL konik bir tüpte hazırlayın (stok konsantrasyonu 1 mM, nihai konsantrasyon 5 μM).
2. Istendiğinde, reaktif yuvalarındaki uygun konik tüpü, Perfüzyon Medyası içeren hazırlanmış konik tüple değiştirin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
   NOT: 20 mL Perfüzyon Ortamı, tek bir optofluidik çipi 24 saat perfüze etmek için yeterlidir. Sitotoksisite testi 24 saatten daha uzun sürecekse ek Perfüzyon ortamı hazırlayın.
3. İsterseniz, kalan sitotoksisite testi görüntüleme adımlarını 14 saat geçtikten sonra TPS görüntülemenin kalanını atlatma seçeneğine tıklayarak sonlandırın ve iş akışına devam edin.

11. Fenotip ve sitokin testi

1. Birincil boyama çözeltisi, 76 μL çoklu İnsan CD8/NK Panel Algılama Antikorları ve 4 μL anti-CD137_BV421 karıştırarak 1.7 mL mikrofuge tüpünde hazırlanır.
2. Pipotle karıştırın ve yükleme istenene kadar 4 °C'de saklayın. Istendiğinde, birincil boyama çözeltisini 20 μL pipetle karıştırın ve uygun ithalat yerine yükleyin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.
3. İkincil boyama çözeltisi, 72 μL 1x DPBS ile 8 μL çoklu üretim kiti SA-PE karıştırarak ayrı bir 1,7 mL mikrofuge tüpünde hazırlanır.
   NOT: İkincil boyama çözeltisi önceden hazırlanmalıdır, böylece birincil boyama tamamlanır tamamlanmaz yüklenmeye hazır olur.
4. Pipotle karıştırın ve yükleme istenene kadar 4 °C'de saklayın. Istendiğinde, ikincil boyama çözeltisini 20 μL'lik bir pipetle karıştırın ve uygun ithalat noktasına yükleyin. Devam etmek için Run simgesine tıklayın.

12. Test analizi

1. Masaüstüne gidin ve Assay Analyzer yazılımını açın. Assay Analyzer'ı seçin, Workflows'u seçin, ardından analiz edilecek iş akışı türünü seçin.
2. Boşaltma için ilgi çekici kalemleri tanımlamak için istenen herhangi bir kriterleri kullanın. İstenilen kriterlere göre boşaltma listesini oluşturun, ardından CAS yazılımına geri dönüp Seçilmiş iş akışına devam et.
3. Assay Analyzer ile [optofluidics Chip ID] için Ihracat Oluştur listesi için işaret kutusunun işaretlendiğini doğrulayın.

13. Boşaltma

1. Her kuyu başına 50 μL T-hücreli bir madde içeren 96 kuyuyluklu yuvarlak tabanlı bir plaka hazırlayın. Hücre boşaltmasına devam etmek için Devam et.
2. Istendiğinde, çip yükleme yuvasını açın, yuva kapağını açın ve optofluidik çipi çıkarın. Çipi steril bir Petri kabına yerleştirin; optofluidik çipin üst kenarı hücrelerin kalemlerden çıkmasını önlemek için >1° yükseltilsin. Sonraki yıkama aşamasında steril doku kültürü kuluçka makinesinde saklanın.
3. Boş yuvaya steril bir Flush çipi yerleştirin, yuva kapağını kapatın, ardından cips yuvasını kapatın. Bitti'ye tıklayın ve sonra Devam et.
4. Istendiğinde, çip yükleme yuvasını açın, yuva kapağını açın ve Flush çipini çıkarın. Optofluidik çipi boş yuvaya yerleştirin, yuva kapağını kapatın, ardından çip yuvasını kapatın. Devam etmek için koşma simgesine tıklayın.
5. Istendiğinde, Load/Unload Plate menüsünü göstermek için Open seçeneğini seçin. Önceki plakayı çıkarmak için Boşaltma tuşuna tıklayın. Kuyu plakası kimliğini ve kuyu plaka tipini güncelleyin, Yükle'yi seçin, ardından Bitti'ni seçin.
6. Hücre boşaltmasına devam etmek için Devam et. İstenilen tüm kalemler boşaldıktan sonra, Manuel İşlemler'e gidin ve çip yuvasını açın, ilgilenilen hücreleri içeren plakayı alın.

Results

Tarif edilen protokolü kullanarak, bireysel sahte nükleofekt, CAR ve c-Jun-aşırı eksprese CAR T hücrelerini antijen-negatif veya antijen-pozitif Şekil 3 K562 tümör hücreleriyle zorladık ya da uyarılmamış bıraktık (sadece T-hücresi). Hedef hücreler, tekrarlanabilir sonuçlar için önkoşul olarak antijenin homojen ekspresyonu açısından değerlendirildi (Ek Şekil 3). Tek nanopenlerde izole olmaları nedeniyle, bu hücrelerin sitokin ifade profillerini, test edilen duruma bağlı olarak tek, çift veya üçlü üretici olarak karakterize edebildik (Şekil 3). Bu sonuçlar, sitokin tespiti için yerleşik bir yöntem olarak ELISA kullanılarak doğrulandı (Ek Şekil 4).

Beklendiği gibi, ölçülen üç sitokinin (TNF-α, IFN-γ ve IL-2) tamamı için sahte nükleteofektli T hücrelerinin çoğu negatif kaldı. Standart CAR T hücreleri arasında, çift, üçlü ve tek pozitif IFN-γ sitokin üreten ve TNF-α– ve IL-2–salgılayan hücrelerin küçük oranları antijen meydan okuması sırasında tespit edildi; antijen negatif tümör hücrelerine maruz kalma ise çok hücreli sitokin salgılanmasını tetiklemedi. İlginç bir şekilde, c-Jun'un aşırı ekspresyonu çift ve üçlü sitokin üreten hücrelerin oranını ve tek sitokin salgılayan hücrelerin oranını hedef karşılaşmada artırdı ve böylece standart CAR T hücrelerine kıyasla sitokin negatif hücrelerin genel oranını azalttı. Bu sonuçlar, CAR T hücrelerinin bu transkripsiyon^{faktörünün zorunlu ekspresyonuyla tanımlanmasını anlatan önceki raporlarla tutarlıdır 6}. Özellikle, sadece T-hücre grubunda, antijen-negatif tümör hücre grubuna göre IFN-γ-pozitif hücrelerin daha fazla oranı gözlemledik; bu da o durumda analiz edilen hücre sayısının daha az olmasından kaynaklanabilir.

T-hücre aktivasyonunu daha fazla incelemek için, yukarıda açıklandığı gibi ele alınan bireysel sahte nükleofektli, CAR ve c-Jun-aşırı eksprese CAR T T hücrelerinde CD137'nin ekspresyonunu değerlendirdik (Şekil 4 ve Ek Tablo 1). CAR T hücrelerinin antijen ekspresyon eden K562 hedef hücreleriyle zorlanması, sahte nükleofektli hücrelere kıyasla CD137 ekspresyonunun artmasına yol açtı. Ayrıca, c-Jun-aşırı eksprese eden CAR T hücreleri arasında standart CAR ürününe kıyasla CD137 pozitif hücrelerin biraz daha yüksek bir oranına doğru bir eğilim gözlemledik.

Sonuç olarak, tanımlanan protokol, tek hücre düzeyinde sitokin salgılanması ve CAR T hücrelerinin aktivasyonunun değerlendirilmesini mümkün kıldı; böylece tek ve çok hücreli sitokin üreticilerinin tanımlanması ve daha önce toplu^{seviye 6'da} tanımlanan fenotipik eğilimlerin tekrarlanması mümkün oldu.

Şekil 1: Optofluidik platformu üzerinden multimodal profilleme için şematik iş akışı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farklı optofluidik platform özelliklerinin temsilci görüntüleri. (A) Tek parçacıkların dizisini OEP ile bireysel kalemlere aktarmak. Görüntülerin sol kısmındaki kalemler önceki dizide yüklenmiştir. (B) Zaman içinde üç bireysel kalemde öldürülme olayları, GFP eksprese eden antijen eksprese eden tümör hücrelerini göstermek. (C) Bir kalemden OEP ile bireysel bir hücrenin dışına aktarılması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Tek hücre düzeyinde sitokin salgısı profillerinin temsil analizi. Bireysel sahte nükleofektli T hücreleri veya CAR-T hücreleri, TNF-α, IL-2 ve IFN-γ için sitokin yakalama boncukları içeren nanopenlerde antijen negatif veya antijen pozitif K562 tümör hücrelerinin varlığı veya yokluğunda kültürlendi. Pie charts, analiz edilen bireysel olarak yazılmış CAR-T hücrelerinin 24 saat boyunca ko-kültür (son nokta analizi) sonrası belirtilen sitokin salgısı profiline sahip oranlarını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: CD137 ekspresyonunun tek hücre düzeyinde temsil analizi. Bireysel sahte nükleofektli T hücreleri veya CAR-T hücreleri, antijen-negatif veya antijen-pozitif K562 tümör hücrelerinin varlığı veya yokluğunda kültürden 24 saat sonra, optofluidik çipte CD137 yüzey ekspresyonu için boyandı. Keman grafikleri, 24 saat kültür sonrası sahte nükleofektli T hücreleri ve CAR-T hücrelerinde CD137 ekspresyonunun floresans yoğunluğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

T hücreli ortam bileşenleri (0.22μM Vakum Filtre Üniteleri kullanılarak steril filtrelenmiş)	Hacim (nihai konsantrasyon)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penisillin/Streptomisin (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Merkaptoetanol (50mM)	0.5 mL (45μM)
İnsan Serumu (ısıyla inaktif değil)	50 mL (%9)
GlutaMAX Takviyesi (100 kat)	5mL (0.9x)
Tümör hücre ortamı bileşenleri	Hacim (nihai konsantrasyon)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penisillin/Streptomisin (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Fetal Baldır Serumu (ısıyla inaktive edilmiş)	50 mL (%9)
MACS tampon bileşenleri	Hacim (nihai konsantrasyon)
DPBS (Mg2+-serbest, Ca2+-serbest)	500 mL
Fetal Baldır Serumu (ısıyla inaktive edilmiş)	2,5 mL (%0,5)
EDTA (0.5 M)	2 mL (2 mM)
PBS/EDTA tampon bileşenleri	Hacim (nihai konsantrasyon)
DPBS	500 mL
EDTA (0.5 M)	2 mL (2 mM)
Medya bileşenlerinin yüklenmesi	Hacim (nihai konsantrasyon)
T hücreli ortam	18 mL
Yükleme Reaktifi	2 mL
Medya+CaCl2 bileşenleri yükleniyor	Hacim (nihai konsantrasyon)
Medya Yükleme	499 μL
CaCl2	1.25 μL
Perfüzyon ortamı+Kaspaz substratı	Hacim (nihai konsantrasyon)
T hücreli ortam	20 mL
NucView 530 Kaspaz-3 Substratı (1 mM DMSO)	100 μL
Bead Dilution buffer bileşenleri	Hacim (nihai konsantrasyon)
DPBS	800 μL
BSA (%2 v/gıcır)	100 μL (%0,2 w/v)
Tween-20 (%10 v/kızıl)	10 μL (%0,1 w/v)

Tablo 1: Medya ve tampon hazırlığı.

Ek Şekil 1. Manyetik zenginleştirmeden önce gen transfer verimliliğini değerlendirmek için örnek bir kapı kapatma stratejisi. Örnek kontur ve histogram grafikleri, gen transferi yapıldıktan sonra CAR ekspresyonu yapan (tEGFR-pozitif) CAR T hücrelerini tespit etmek için kapı stratejisini yansıtmaktadır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Sıralama sonrası saflık kontrolü. Örnek kontur grafikleri, manyetik sıralama yapıldıktan sonra CAR ekspresyonu yapan (tEGFR-pozitif) CAR T hücrelerinin bir kısmını gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3. Hedef tümör hücrelerinde antijen ekspresyonu. Temsilci histogram grafikleri, WT K562 tümör hücrelerini gösterir veya akış sitometrisi yoluyla izotip veya ROR1 hedefleyen antikorlarla boyanmış ROR1 ifade etmek üzere tasarlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4. Standart ELISA kullanılarak sitokin tespiti. CAR ile CAR+cJ T hücreleri arasında ELISA ile ölçüldüğünde, K562^ROR1 tümör hücreleriyle birlikte kültürün 24 saatlik ko-kültüründen sonra 4:1 oranında süpernatantta IL-2 ve IFN-γ konsantrasyonları. *P≤ 0.05, **P≤ 0.01, ***P≤ 0.001, ****P≤ 0.0001 ile eşleştirilmemiş t-testi ile belirlenen istatistiksel anlamlılık. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Analiz edilen hücreler. Tablo, her duruma göre analiz edilen bireysel hücre sayısını gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Gösterilen iş akışı, antijen pozitif ve antijen negatif hedef hücrelerle birlikte kültür sırasında bireysel CAR-T hücrelerinin sitokin salgılanması ve aktivasyon profilinin değerlendirilmesini sağlar; bu profil isteğe bağlı olarak sitolitik aktivite değerlendirmesiyle birleştirilebilir. Tek hücre çözünürlükte çoklu modal fonksiyonel veri yakalama yeteneği, CAR T-hücre performansını eşi benzeri görülmemiş bir hassasiyetle analiz etmenin bir yolunu sunarken, ölçümlerin ölçülebilirliği, OEP teknolojisinin her kaleme aynı sayıda sitokin yakalama boncuk, hedef hücre ve CAR-T hücresini yüklemedeki doğruluğuna büyük ölçüde bağlıdır. Bu nedenle, her reaktif veya hücre örneğinin yükleme yoğunluğu ve TPS kriterlerinin optimize edilmesi kritik öneme sahiptir; böylece her kalemde tek boncuk ve/veya tek hücre yüklemesi mümkün olur. Akışkanik kanallardaki boncuk veya hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu uyarlamak yeterli kalem yüklemesini mümkün kılabilirken, platformun Flush ve Import seçenekleri yükleme sürecini yeniden denemek için ek bir strateji olarak hizmet eder.

Optofluidik çip tasarımının avantajlı bir özelliği, kalem düzeninin 22 farklı FOV'a ayrılmasıdır. Farklı CAR yapılarıyla tasarlanmış T hücrelerini optofluidik çip içindeki farklı FOV'lara yükleyerek, c-Jun aşırı ekspresyonunu zorunlu kılan alternatif bir yapının standart bir CAR yapısına kıyasla multimodal işlevselliğe sahip CAR-T hücrelerinin üretimini artırıp artırmayacağını da değerlendirebildik (Şekil 3 ve Şekil 4). Bu şekilde, optofluidik platformu, CAR-T hücresi kaynaklı kanser remisyonunun dayanıklılığını artırma potansiyeline sahip aday CAR yapılarını hızla belirleme imkanı sağlar. Dikkat çekici bir nokta olarak, hedef ve efektör hücreler arasındaki etkileşimin tek hücre düzeyinde analizi, tümör hücrelerindeki hedef antijen ekspresyonunun heterojenliği ve CAR-T hücre popülasyonunun saflığı gibi önemli parametrelerin kritik kontrolünü gerektirir (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3).

IL-2, TNF-α ve IFN-γ salgısını değerlendirmeye odaklanmış olsak da, ticari olarak mevcut çoklu sitokin yakalama panelleriyle tespit edilebilen çözünür analitlerin geniş yelpazesi, iş akışının önemli ölçüde özelleştirilmesine olanak tanır. Son gelişmeler, alanın aynı zamanda yüksek boyutlu akış sitometrisi yönünde ilerlediğini ve farklı bağışıklık hücre tiplerinin fonksiyonel profillenmesiyle sinerji için yeni olanaklar açtığını^{ortaya koymaktadır 12,13}. Örneğin, gelecekteki uygulamalar, polifonksiyonel CAR eksprese eden düzenleyici T hücrelerini (Tregs) belirlemek için tarama kampanyalarını içerebilir. Bunlar, TGF-β ve^{IL-10 14} gibi birden fazla anti-inflamatuar sitokin salgılar. Dolayısıyla, optofluidik sistemin uyum sağlayabileceği, hücresel immünoterapilerin malign olmayan hastalıkların tedavisinde yeni sınırlara ulaşmasıyla kritik içgörülerin yolunu açabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-D Nükleofektör	Lonza
Anti-Biotin Mikroboncuklar	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
CD8+ T hücre izolasyon kiti	Miltenyi Biotec	130-096-495
CELLSTAR 15 ml konik tüpler (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
CELLSTAR 50 ml konik tüpler (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm & sup2; U Şeklinde, Eğik Boyun Hücre Kültürü Şölesi, Tıkaç Mühürlü Kapağı	Corning	430720U
Costar 24 kuyuyla şeffaf TC ile işlenmiş çoklu kuyu plakaları, tek tek sarılmış, steril	Corning	3526
Costar 48-Well Şeffaf TC ile İşlenmiş Çoklu Kuyu Plakaları, Tek Tek Sarılı, Steril	Corning	3548
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 Mıknatıs	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	Kendi içinde çekim (biotin) için
EGFR Antikor (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Fetal Sığır Serumu, Değeri	Thermo Fisher	A5256801
GlutaMAX Takviyesi (100 kat)	Thermo Fisher	35050038
İnsan IL-2 IS, birinci sınıf	Miltenyi Biotec	130-097-748
İnsan Serumu	Deutsches Rotes Kreuz (DRK) / Alman Kızılhaç (GRC)	Yok
MACS Hücre ayırma kolonu, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti	Lonza	V4XP-3032
Pancoll insan, Yoğunluk: 1.077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
PE Annexin V Apoptoz Tespit Kiti I	BD Biosciences	559763
Penisillin-Streptomisin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Pierce Hücre Yüzeyi Biyotinilasyon ve İzolasyon Kiti	Thermo Fisher	A44390
QuadroMACS Başlangıç Kiti (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, Glutamax Takviyesi, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Serolojik pipetler 2, 5, 10, 25 ve 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Lekesi (%0,4)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Merkaptoetanol (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Beacon reaktifleri
96 kuyulu levha yuvarlak tabanlı	Corning	3799
Beacon Plastik Flush Chip		500-00030
BLI Temizleme Çözeltisi, Sodyum Hipokloit, %0,825	Bruker	520-08000
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Brilliant Violet 421 insan karşıtı CD137 (4-1BB) Antikor	Biolegend	309820
Kalsiyum Klorür (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex İnsan IFN-γ Yakalama boncukları B3, 13X	Biolegend	740545
LEGENDplex İnsan IL-2 Yakalama Boncuk A5, 13X	Biolegend	740934
LEGENDplex İnsan Th Panel Algılama Antikorları V02	Biolegend	741041
LEGENDplex İnsan TNF-α Yakalama Boncuk B7, 13X	Biolegend	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegend	740452
NucView 530 Caspase-3 Substratı, 1 mM DMSO	Hö Lzel	B-10406
OptoSelect Çipi 3500	Bruker	500-12001
Sodyum Azid	Sigma-Aldrich	S2002
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379
Vegan İhracat Tamponu	Bruker	520-00040
VWR Media Şişeleri, Kare Şekilli, PETG, 125ml	VWR	216-2265
VWR Media Şişeleri, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Islatma Katkısı	Bruker	520-08016
Islatma Çözeltisi	Bruker	520-00009