Yöntem makalesi

Tavukta İlkel Germ Hücre Nakli Yoluyla Tohum Hattı Kimera Üretimi İçin Adım Adım Bir Prosedür

DOI:

10.3791/69704

⸱

5 Aralık 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alıcı embriyolara ilkel germ hücrelerinin (PGC) nakliyle üretilen kuş germ hattı kimeraları, transgenez, gen düzenleme ve tür koruma alanlarında uygulamalara olanak tanır. Bu protokol, PGC izolasyonu, in vitro genişleme, mikroenjeksiyon ve donör doğrulama prosedürlerini detaylandırarak, germline chimera üretimi ve kuş biyoteknolojisinin ilerlemesi için güvenilir bir platform sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuklarda ilkel germ hücrelerin (PGC) nakli yoluyla germ hattı kimeralarının üretilmesi, kuş transgenezi, genom düzenlemesi ve tür koruması için sağlam ve tekrarlanabilir bir platform sağlar. EGK aşama X embriyolarından blastodermal hücrelerin kullanıldığı geleneksel yaklaşımlar, erken hücre soyu ayrımcılığı nedeniyle düşük germ hattı iletim verimliliği nedeniyle sınırlıdır. Buna karşılık, PGC aracılı stratejiler, bu unipotent hücrelerin içsel germ hattı yetkinliğinden yararlanarak alıcı gonadlara güvenilir şekilde dahil edilmesini sağlar. Burada, HH evre 26-28 embriyolarından PGC'lerin izole edilmesi, in vitro olarak korunması ve genişletilmesi ile HH evre 14-17 alıcı embriyolarının dorsal aortasına nakledilmesi için adımlı bir protokol sunuyoruz. Kısa süreli naklet, PKH26 gibi floresan belirteçlerle izlenirken, alıcı gonadların PCR analiziyle uzun vadeli germline katkısı doğrulanır. Bu yaklaşım, donör PGC'lerin yaşamlılığını ve işlevsel yetkinliğini korurken germ hattı kimeralarının tutarlı üretimini sağlar. Ayrıca, yöntem CRISPR/Cas9 gibi genom düzenleme araçları ve transpozon tabanlı vektörlerle uyumludur ve transjenik ve gen düzenlemeli kuş modellerinin üretilmesini mümkün kılar. Temel araştırmaların ötesinde, bu strateji türler arası germ hattı iletimi ve genetik kaynak koruma yoluyla koruma çabalarını destekler. Genel olarak, bu protokol kuş germ hattını manipüle etmek için kapsamlı ve güvenilir bir çerçeve sunar ve kümes hayvanı biyoteknolojisinde hem temel hem de uygulamalı çalışmalar için çok yönlü bir platform sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlkel germ hücre (PGC) aracılı germ hattı iletimi, genetik bilgiyi kuşlarda bir sonraki nesle aktarmak içinen verimli yöntemdir 1,2,3. Germline kimeralar, hem donör hem de konak köklü germ hücreleri taşıyan bireyler olarak tanımlanır; donör genetik materyalin yavrulara aktarılmasına olanak tanır ve transgenez, fonksiyonel genomik ve nesli tükenmekte olan türlerin korunmasında uygulamaları destekler 4,5,6,7,8. Blastodermal hücrelere dayanan yaklaşımların aksine, PGC aracılı stratejiler daha yüksek germ hattı iletim verimliliği ve tekrarlanabilirlik sağlar; bu da onları hassas genetik manipülasyon için çok uygun kılar.

Kuş türlerinde, PGC'ler blastodermin merkezi pellucida bölgesinde Eyal-Giladi ve Kochav (EGK) X9 aşamasında başlar ve ardından Hamburger ile Hamilton (HH) 410 evresi ile germinal hilala göç ederler. HH evreleri 9 ile 12 arasında, PGC'ler embriyonik kan damarları aracılığıyla dolaşır ve ardından gonadalsırt 11,12,13'te yerleşir. Bu belirgin göç desenleri, germinal hilal, dolaşımdaki kan ve gonadlar dahil olmak üzere PGC'lerin birden fazla aşamada izole edilmesinisağlar 14. Özellikle, HH 26-28 evre gonadlarından alınan ve HH evre 14-17 alıcı embriyolarına nakil edilen PGC'ler, optimal germ hattı yetkinliği ve aşılanma verimliliği sergilemiş olup, bu protokolün standartlaştırılmış uygulanması için pratik bir çerçeve sağlamıştır.

PGC'ler, germ hattı kimliği ve iletim yeteneğini korurken in vitro olarak korunabilir ve genişletilebilir, böylece kararlı genetik modifikasyon için kullanılmalarını sağlar. PGC aracılı germ hattı kimera üretimi, rekombinant proteinleri ifade eden transjenik kuşlar üretmek, germ hattını izlemek, cinsiyet belirleme yollarını manipüle etmek ve enfeksiyonhastalıklarına direnç sağlamak için kullanılmıştır 6,15,16,17,18,19. Ayrıca, PGC nakli, nesli tükenmekte olan kuş germplazması 7,8,20,21,22,23'ün türler arası germ hattı iletimini ve korunmasını kolaylaştırır; PGC kriyo-koruması ise uzun vadeli genetik kaynak korunmasını sağlar 24,25.

Embriyonik kök hücreler (ESC)26,27,28,29 dahil olmak üzere diğer kök hücre tipleri, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler)30,31,32 ve spermatogonyal kök hücreler (SSC'ler)33,34 kuş germ hattı modifikasyonu için araştırılmış olsa da, bu imir hattı iletim verimliliği şu anda en yüksek kabul edilen PGC tabanlı sistemlere göre daha düşük germ hattı yetkinliğine sahip hücrelerin güvenilir kaynağı.

Germline chimera çalışmalarında, donör ırkının seçimi, donör kaynaklı germ hücreleri konak köklü hücrelerden ayırt etmek için kritiktir. Kore Ogye Tavuğu (KOC), siyah deri ve tüylerden sorumlu resesif i/i allele sahiptir; bu, baskın I/Ialleli 35,36'yı taşıyan Beyaz Leghorn hattından kolayca ayırt edilebilir. Bu görünür fark, germ hattı iletim analizi sırasında donör köklü yavruların kesin olarak tanımlanmasını sağlarken, KOC'un yerli genetik değeri nedeniyle biyolojik çeşitliliğin korunmasını destekler.

Genel olarak, PGC aracılı germline chimera üretimi, kuş biyoteknolojisi için sağlam bir platform sağlar (Şekil 1). Optimal donör (HH26-28) ve alıcı (HH14-17) aşamalarını belirleyerek ve tanımlanmış kültür ile doğrulama adımlarını dahil ederek, bu protokol verimli germ hattı iletimini sağlar ve transgenik ve genom düzenlenmiş kuşların üretimi ile değerli kuş genetik kaynaklarının korunması için pratik bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuklarla ilgili tüm işlemler, Güney Kore'deki Seul Ulusal Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Kaynakları Enstitüsü tarafından onaylandı (IACUC onay numarası: SNU-250226-4). Hayvanlar, sterilize edilmiş su ve yem sağlanarak kontrollü ve hijyenik koşullar altında tutuldu. Ayrıca, işlemler sırasında oluşan tüm kimyasal ve biyolojik atıklar, tripsin/EDTA çözeltileri, PKH26 etiketli hücreler ve embriyonik veya gonadal dokular dahil, Seul Ulusal Üniversitesi'nin kurumsal biyogüvenlik ve tehlikeli atık yönetimi yönergelerine uygun olarak işlenmiş ve bertaraf edilmiştir. Bu protokolte kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Donör embriyolardan alınan gonad örneklemesi ve hücre kültürü için kullanılan PGC'ler ve reaktifler steril olmalıdır.

1. Tavuk PGC'lerinin izolasyonu

  1. Taze döllenmiş tavuk yumurtalarını Eyal-Giladi ve Kochav (EGK) X aşamasında 37 °C'de 5,5 gün boyunca kuluçka yapın, embriyolar HH 26-28 aşamalarına ulaşana kadar.
    NOT: Embriyonik gelişimin normal olmasını sağlamak için nemi %60-65 arasında tutun.
  2. Embriyoları HH 26-28 evrelerinde steril forseps kullanarak yumurtalardan dikkatlice izole edin.
  3. Embriyoları 1× PBS ile yıkayın, sonra embriyoyu kömür tabakasına yerleştirin ve böcek iğneleriyle sabitleyin. Stereomikroskop kullanarak, çift embriyonik gonadları keskin forsepslerle dikkatlice disseksiye edin.
    NOT: Hasarı önlemek ve gonadların doğru izole edilmesini sağlamak için dokuları nazikçe ele alın. HH evreleri 26-28'de mezonefrik böbreğe yakın olmaları nedeniyle, az miktarda böbrek dokusu istemeden toplanabilir; ancak, stereomikroskop altında dikkatli diseksiyon ve seçici kültür koşulları, sadece PGC'lerin çok sayıda olmasını ve saflığın korunmasını sağlar.
  4. Üç embriyodan toplanan eşleştirilmiş gonadları, %0,05 tripsin/EDTA içeren 500 μL içeren 1,5 mL tüpte aktarın ve hücreleri ayırmak için 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  5. Tripsini inaktive etmek için 50 μL FBS ekleyin.
  6. Oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 °C) 200 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı hücre pelletini rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın.
  7. Dissosiyasyon yapmış gonadal hücreleri 1 mL 1× PBS ile yeniden süspansiyona alın.

2. Tavuk PGC'lerinin in vitro çoğaltması

  1. PGC kültür ortamı (%20 FBS, %2 tavuk serumu, nukleozidler, GlutaMAX, MEM temel olmayan amino asitler, 2-merkaptoetanol, 10 mM sodyum piruvat, antibiyotik-antimikotik, 10 ng/mL bFGF) hazırlayın ve ortamı 37 °C'ye kadar ısıtın.
  2. HH evreleri 26-28'de üç embriyodan toplanan dissosiyasyon gonadal hücreleri (embriyo başına yaklaşık 100-150 PGC37,38) her kuyu başına 1 mL önceden ısıtılmış kültür ortamına ekleyin ve hücreleri 12 delikli bir kültür plakasına yerleştirin.
  3. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı nazikçe sallayın.
  4. PGC'leri %5 CO₂ ile 37 °C'de tutun, morfolojisini ve hücre yoğunluğunu günlük olarak izleyin. PGC'ler yuvarlak, kırıcı ve genellikle yüzer kalırken, somatik hücreler yapışkandır (Şekil 2A).
    NOT: Kültür koşulları seçici olarak PGC'lerin çoğalmasını destekler, böylece PGC'ler genişlemeye ve somatik hücreler kademeli olarak eliminasyona girer.
  5. 12 kuyu bir plakada kültürlenen PGC'ler, optimal proliferasyon ve canlılığı desteklemek için kültür ortamı her 3-4 günde bir değiştirilerek korunur (Şekil 2B).
  6. Isteğe bağlı olarak, saflığı doğrulamak ve cinsiyet belirlemesini PCR ile yapmak için PGC'ye özgü işaretleyiciler (örneğin CVH, DAZL, NANOG ve POUV) kullanın (Tablo 1).
    1. Üreticinin talimatlarına göre RNA Miniprep Sistemi kullanılarak RNA çıkarımı için PGC örnekleri hazırlanın.
    2. Standartprotokoller 39'a (Şekil 2C,D) göre RT-PCR (örneğin, CVH, DAZL, NANOG ve POUV) veya PGC-spesifik belirteçler (SSEA1 ve DAZL) kullanılarak immünboyama işlemi yapılabilir.
    3. Standartprotokollere göre cinsiyet belirleme PCR analizi yapılabilir (Şekil 2E).

3. PKH26 etiketleme kullanılarak kültürlenmiş PGC'lerin germ hattı yetkinliğinin doğrulanması

  1. PGC'ler, genellikle 12 kuyuyla yaklaşık 1-5 × 10-5 hücre yoğunluğunda, kütük büyüme fazına ulaştıklarında hasat edilir.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 °C) 5 dakika boyunca 200 × g santrifüjle geçirin, 1× PBS ile tekrar süzülün ve tripan mavisi kullanılarak canlılığı değerlendirin.
  3. Genel hücre zarı etiketlemesi için PKH26 Kırmızı Floresan Hücre Linker Kit'inden Sulandırıcı C hazırlayın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 °C) dengeleyin.
  4. PKH26 boyasını yeniden yapılandırın ve yaklaşık 1-2 μM nihai konsantrasyonda Seyrelti C içinde çalışma bir çözelti hazırlayın.
  5. PGC pelletini 1 mL Sulandırıcı C'de yeniden askıya alın. Hızlıca 1 mL PKH26 çözeltisi (1:1 oranı) ekleyin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 °C) 2-5 dakika kuluçka yapın.
  6. Hücre süspansiyonuna hızlıca 1 mL PKH26 çalışma çözeltisi ekleyin (1:1 oranı), pipetle nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20-25 °C) 2-5 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Önerilen kuluçka süresini aşmayın.
  7. Lekelenmeyi durdurun, FBS'nin 2-4 katı veya PBS'de %1-5 BSA ekleyin.
  8. Santrifüj 200 × g'de, oda sıcaklığında 5 dakika (yaklaşık 20-25 °C); PGC kültür ortamı veya 1× PBS + %0,1 BSA ile üç kez yıkayın.
  9. Hücreleri enjeksiyon tamponu içinde (PGC kültür ortamı veya 1× PBS + %0,1 BSA) 1-5 × 104 ila 1 × 105 hücre/μL konsantrasyonda yeniden süzülün. Canlı kalmak için kısa süre buzda tutulun.
  10. Enjeksiyondan önce etiketleme floresan mikroskopu altında doğrulanmalıdır (Şekil 3A).
  11. HH evre 14-17 embriyolarına tripan mavisi kullanılarak sayılan 3.000'den fazla canlı etiketlenmiş PGC enjekte edin ve 6. güne kadar kuluçka yapın (Şekil 3B).
  12. 6. güne kadar alıcı gonadların kolonileşmesini doğrulayın (Şekil 3C).

4. Donör PGC'lerin alıcı embriyonik kan damarına nakli

  1. Alıcı yumurtaları HH aşaması 14-17'ye (37 °C, %60-70 nem, her saat 45° sallanma) inkübe edin.
  2. Borosilikat cam boru kullanarak cam bir kapiler mikropipet hazırlayın (dış çapı 1,0 mm, iç çapı 0,5-0,75 mm). Mikropipet çekicisi ile kapilleri çekip ucunu yaklaşık 10-20 μm iç çapa cilalayın.
  3. Yumurtanın sivri ucunda küçük bir pencere (yaklaşık 0,5 cm × 0,5 cm) oluşturularak embriyoya zarar vermeyi en aza indirmek için mikroenjeksiyon erişimi sağlanır.
    NOT: Pencereyi açmadan önce yumurta kabuğu yüzeyini %70 etanol ile sterilize ederek kontaminasyonu önleyin.
  4. Stereomikroskop altında dorsal aortaya 1× PBS veya HBSS içeren 3.000'den fazla PGC içeren 2 μL süspansiyon enjekte edin.
    NOT: Enjeksiyonu embriyoya veya kan damarlarına zarar vermemek için stereomikroskop altında yapın ve mikroenjeksiyon iğnesini dikkatlice manipüle ederek yaralanmayı önleyin.
  5. Yumurta penceresini parafin filmiyle kapatın; Yumurta ucu aşağıya doğru konumlandırılır ve 37,5 °C sıcaklıkta, %60-70 nemde çıkana kadar kuluçka yapın, her saat 45°'de sallanın.
    NOT: Embriyonun canlı kalmasını ve başarılı gelişimini sağlamak için uygun sıcaklık ve nemi koruyun.

5. Germline kimerasının doğrulanması

  1. G0 yavrudan yumurtalık çıktıktan sonra testis veya yumurtalığı toplayın.
  2. Toplanan gonadal dokulardan genomik DNA çıkararak germ hattı kimera oluşumunu doğrulayın. Toplanan gonadal dokulardan genomik DNA çıkarımı aşağıdaki şekilde gerçekleştirilir:
    1. Testis veya yumurtalık dokusunu toplayın, 300 μl lizis tamponu (2 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, %1 SDS) içinde 1,5 μL proteinaz K içeren bir şekilde homojenize edin ve tam lizis sağlanması için 60 °C'de kuluçka yapın.
    2. 100 μL protein çökeltme çözeltisi (7 M amonyum asetat) ekleyin, iyice karıştırın ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Süpernatantı (sulu faz) yeni bir tüpe aktarın, DNA'yı çökeltmek için 500 μL izopropanol ekleyin ve 12.000 × g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Üst yüzeyi at, 1 mL %70 etanol ekleyin ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika santrifüj yapın.
    5. Etanolü çıkarın, DNA pelletini oda sıcaklığında 10 dakika hava ile kurutun.
    6. DNA'yı 50 μL RNazsız su ile elüasyon yapın ve spektrofotometre (A 260/A280 ≈ 1.8) kullanılarak DNA konsantrasyonu ve saflığını ölçün.
    7. PCR reaksiyonu başına DNA'yı 10-5 ng'e ayarlayın.
  3. Türe özgü primerlerle PCR amplifikasyonu yapın (Tablo 1) aşağıdaki koşullarda tasarlandı: 3 dakika 94 °C, ardından 30 saniye için 94 °C, 30 saniye için 68 °C ve 30 saniye 72 °C ile 5 dakika (Şekil 4A).
  4. Cinsel olarak olgun G0 erkeklerden sperm toplayın, aynı protokolle sperm DNA'sı alın ve türe özgü primerlerle PCR yapın (Şekil 4B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuk PGC'lerinin in vitro çoğaltılması ve karakterizasyonu
PGC içeren tam gonadal hücreler, HH evreleri 26-28'de embriyolardan izole edildi ve tanımlanmış PGC kültür koşulları altında kültürlendi. Zamanla, gonadal stromal hücreler ya kültür yüzeyine yapıştı ya da bozulmaya uğradı, oysa PGC'ler askıda kaldı ve aktif olarak çoğalmaya başladı (Şekil 2A). Yaklaşık iki haftalık kültür sonrası, PGC popülasyonu 1 × 105hücreden fazla genişlem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kültürlenmiş ilkel germ hücrelerinin (PGC) alıcı embriyolara nakli, tavuklarda germ çizgisi kimeralarının üretimi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu protokol, PGC'lerin içsel germ hattı potansiyelinden yararlanır ve mozaiklik ve gelişimsel değişkenliğe yatkın geleneksel blastoderm tabanlı sistemlere kıyasla deneysel tutarlılığı artırır. Bu yöntemin kritik avantajlarından biri, PGC'lerin tanımlanmış kültür koşullarında seçici in vitro genişlemesidir ve bu da onların germ kimliğ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) bursu [RS-2024-00418297] ve Kore Kırsal Kalkınma İdaresi'nden Tarım Bilimi ve Teknolojisi Geliştirme için Kooperatif Araştırma Programı [RS-2025-02213489] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 kez PBS HycloneSH30256
2-MerkaptoetanolGibco21985023
Antibiyotik Antimikotik Çözeltisi (100X)Gibco15240062
Anti-DAZL antikoruAbcamAB215718
Tavuk Serumu SterilRocklandD102-00-0500
Deoksiribonukleaz I, sığır pankreasından,Sigma aldrich9003-98-9
Drummond Microcaps Tek Kullanımlık Mikropipetler Drummond Bilimsel Şirketi1-000-0500
EmbryoMax Nukleozidler (100X)MerckES-008-D
FBS (Fetal Bovine Seurm Karakterized, ABD kaynaklı, 500ml)HycloneSH30919
GlutaMAX TakviyesiGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
MEM Temel Olmayan Amino Asitler ÇözeltisiGibco11140050
Parafilm M Laboratuvar FilmiAmcorPM996 
PKH26 Genel Hücre Zarı Etiketleme için Kırmızı Floresan Hücre Linker KitiSigma aldrichPKH26GL-1KT
Arıtılmış anti-fare/insan CD15 (SSEA-1) AntikoruBiolegend125602
Rekombinant İnsan FGF temel/FGF2/bFGF (146 aa) Protein R& D sistemleri  233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep SistemleriPromegaZ6011
Sodyum Piruvat (100 mM)Gibco11360070
Tripan mavi çözeltisiSigmaT8154-100ML
Tripsin-EDTA (%0,5), fenol kırmızı yokGibco™15400054

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primordial Germ H creleriPGC TransplantasyonuAvian TransgenezGenom D zenlemeTavuk EmbriyolarT rler Aras Germ Hatt Aktar mCRISPR Cas9Floresan Mark rlerGonad PCR Analizi

İlgili makaleler