Steicococcus spp suşlarında Otomatik Sistem Tarafından Teicoplanin Direnci Tespit Edilir mi?

Özet

Burada, Stafilokokk izolalarında teikoplanin hassasiyetini buluşturma mikrodilütasyonu (BMD) ile karşılaştırarak belirlemek için otomatik bir sistemin (VITEK 2) güvenilirliğini değerlendirmek için bir protokol sunulmakta; bu protokol direnç doğrulama ve uygun antimikrobiyal tedaviyi yönlendirme uygulamaları uygulanmaktadır.

Özet

Haziran 2022 ile Aralık 2024 arasında toplanan toplam 467 Staphylococcus aureus (S. aureus) ve 66 koagülaz negatif Staphylococcus (CoNS) izolat bu çalışmaya dahil edilmiştir. Teicoplanin hassasiyet testi, otomatik antimikrobiyal duyarlılık testi sistemi, et suyu mikro seyreltme (BMD) ve gradyan test yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Metisilin direnci S. aureus izolatlarının %71,7'sinde ve tüm CoNS izolatlarında tespit edilmiştir. Bu çalışmada, otomatik duyarlılık test sistemi ile 13 S. aureus izolatı ve 4 CoNS izolatı teikoplanine dirençli olarak tanımlanmıştır. Tüm 13 S. aureus izoletinin hem gradyan testi hem de BMD ile teicoplanin'e duyarlı olduğu bulundu. Dört CoNS izolasyonu da gradyan testiyle hassas olarak tanımlanırken, BMD iki izoleyi duyarlı, ikisini dirençli olarak sınıflandırdı. BMD ile CoNS izolatları arasında dört suşta [S. capitis (n = 1) ve S. haemolyticus (n = 3)] teikoplanin direnci tespit edilmiştir. BMD tarafından tanımlanan dört teikoplanin dirençli CoNS suşu kan kültürlerinden izole edildi; üçü pediatrik hastalardan, biri ise yetişkin hastadan alındı. Genel olarak, metisiline dirençli S. aureus (MRSA) oranı çalışmada nispeten yüksekti ve tüm CoNS izolatları metisiline dirençliydi. Ayrıca, otomatik sistemlerin teikoplanin direncini belirlemede güvenilir olmadığı tespit edildi ve dirençli olarak tanımlanan izolasyonlar BMD tarafından doğrulanmalıdır. Teicoplanin'in MRSA ve metisiline dirençli CoNS gibi patojenleri tedavi etmek için son çare olarak kullanılan bir antibiyotik olduğundan, yatkınlığı yakından izlenmelidir.

Giriş

Staphylococcus aureus (S. aureus), geniş virülans faktörleri ve çeşitli doku ile organlarda ciddi enfeksiyonlara yol açma yeteneği nedeniyle klinik olarak en önemli Staphylococcus türlerinden biridir. Cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları, derin doku enfeksiyonları, solunum yolu enfeksiyonları, idrar yolu enfeksiyonları ve kan dolaşımı enfeksiyonlarından sorumludur ve hastane ortamlarında en önemli patojenlerden^{biri olarak kalmaktadır 1,2}. Özellikle, metisiline dirençli S. aureus (MRSA), dünya genelinde sağlık hizmetleriyle ilişkili enfeksiyonların başlıca nedenlerinden biridir ve ameliyat sonrası yara enfeksiyonlarının önde gelen nedenlerinden^{biri olmaya devam etmektedir 2,3}. Koagülaz-negatif stafilokoklar (CoNS), normal cilt florasının bir parçası olmasına rağmen, son yıllarda hem lokal hem de sistemik enfeksiyonlarda giderek daha fazla rol oynamaktadır. Bu artış, antimikrobiyal duyarlılık testlerinin daha sık yapılmasına ve bunun sonucunda teikoplanin⁴ gibi glikopeptid antibiyotiklere karşı direnç tespit edilmesinin artmasına yol açmıştır.

S. aureus ve CoNS suşları genellikle β-laktam antibiyotiklere direnç gösterdiğinden, bu enfeksiyonların tedavisinde öncelikle vankomisin ve teikoplanin olmak üzere glikopeptid antibiyotikler yaygın olarak kullanılmaktadır5. Dirençli gram-pozitif nozokomial patojenlerin artan yaygınlığı, glikopeptidlerin kullanımının artmasına yol açmış ve bu da bu ajanlara karşı bakteriyel hassasiyetin azalmasına katkıda^{bulunmuştur 5,6}. Vancomycin ve teicoplanin benzer antimikrobiyal etkililiğe sahiptir; Ancak, birçok çalışma teikoplaninin daha az yan etki ile ilişkili olduğunu, özellikle de azalan nefrotoksisitenin^(7,8) olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, teikoplanin genellikle nötropeni, bakteriemi veya böbrek fonksiyonu^{bozulmuş 9,10} hasta popülasyonlarında vankomisine uygun bir alternatif olarak kabul edilir.

Glikopeptit hassasiyetinin hızlı ve doğru belirlenmesi, bu ajanların metisiline dirençli Stafilokokk enfeksiyonlarında yaygın kullanımı ve glikopeptide dirençli suşların artan raporları nedeniyle önemlidir¹¹. Staphylococcus türlerinde glikopeptid hassasiyetini değerlendirmek için agar seyreltme, gradyan testleri, et suyu mikrodilütasyonu (BMD) ve otomatik antimikrobiyal duyarlılık test sistemleri dahil olmak üzere çeşitli laboratuvar^{yöntemleri mevcuttur.} Önceki çalışmalar, Staphylococcus ^{türü 4,11'de} özellikle teikoplanin olmak üzere glikopeptidlere karşı azalmış hassasiyet veya direnç tespit etmede otomatik sistemler ile referans yöntemleri arasında tutarsızlıklar bildirilmiştir.

Mevcut çalışma, Staphylococcus izolalarında teikoplanin hassasiyetini belirlemede otomatik antimikrobiyal duyarlılık test sisteminin güvenilirliğini, referans standart olan et suyu mikro sulandırma yöntemiyle karşılaştırmayı amaçladı. Otomatik sistemin performans özelliklerinin değerlendirilmesi, klinik laboratuvarların klinik uygulamada glikopeptid hassasiyetinin rutin tespiti için uygunluğunu değerlendirmesine yardımcı olabilir.

Protokol

Çalışma, yerel etik komitesi tarafından 27 Ocak 2025'te onaylandı (protokol numarası: HRU/25.02.03). Çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür.

1. Çalışma tasarımı

Bu retrospektif çalışma, Staphylococcus türlerinde teikoplanin hassasiyetini belirlemek için otomatik antimikrobiyal duyarlılık test sisteminin performansını değerlendirerek, sonuçları bulşu mikro sulandırma (BMD) referans yöntemi ve gradyan test yöntemiyle karşılaştırdı.

2. İzole seçimi

1. Klinik izolatların toplanması
   1. Haziran 2022 ile Aralık 2024 arasında çeşitli klinik örneklerden elde edilen toplam 467 S. aureus ve 66 koagülaz negatif Stafilokokk (CoNS) izolasyonunu dahil etmektedir.
   2. Tüm klinik örnekleri tanı laboratuvarında rutin mikrobiyolojik prosedürlere göre işliyor.
   3. Analizde hasta başına sadece bir izolat ekleyin. Aynı hastadan alınan farklı örneklerden alınan tekrarlayan izolasyonları hariç tutun.
2. İlk tanımlama ve tarama
   1. Tüm izolasyonları tür düzeyinde matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu-uçuş kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) kullanılarak tanımlayın.
   2. S. aureus ve CoNS, otomatik duyarlılık testi sistemiyle VITEK 2 AST-P664 kartları kullanılarak metisicillin direnci ve teikoplanin hassasiyeti için test edilir.
   3. Otomatik duyarlılık test sistemi tarafından oluşturulan minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) değerlerini kaydederek sonraki karşılaştırma için kaydedin.
3. İzole depolama ve alt kültür
   1. İzolasyonları, otomatik duyarlılık testi sistemiyle %20 gliserol takviyeli triptik soya çorbasında −80 °C'de depolayın.
   2. Referans testinden önce, oda sıcaklığında eritme izolasyonu yapılır ve %5 koyun kanı agari üzerinde iki kez alt kültüre edilir.
   3. Her geçişten sonra saflık ve kullanılabilirlik için plakaları 37 °C'de 24 saat kuluçka altına alın.

3. Antimikrobiyal duyarlılık testi

1. Et suyu mikro seyreltme (BMD)
   1. Teicoplanin çözeltilerinin hazırlanması
      1. Katyonla ayarlanmış Mueller-Hinton çorbasında (CAMHB) 2560 mg/L konsantrasyonda teikoplanin tozu stok çözeltisi hazırlayın.
   2. Et suyu mikro seyreltme prosedürü
      1. Steril 96 kuyu U-bottom mikroplakaları kullanarak et suyu mikro seyreltme testi yapın.
      2. Her kuyuya 100 μL CAMHB dağıtın. Teikoplanin stok çözeltisini on kat seyreldin ve ilk kuyuya 100 μL ekleyin.
      3. 1–10 kuyu boyunca iki kat seri seyreltme hazırlayarak 64 ila 0,125 μg/mL arasında nihai antibiyotik konsantrasyonları elde edin.
      4. CAMHB ve bakteriyel inokulum içeren büyüme kontrolü olarak well 11'i kullanın. Negatif kontrol olarak 12 kuyunu, sadece CAMHB¹² içeren bir kontrol olarak kullanın.
   3. Aşı hazırlığı ve kuluçka
      1. Saf bakteriyel kolonileri steril salinette askıya alın ve süspansiyonu 0,5 McFarland standardına eşdeğer bulanıklığa ayarlayın.
      2. CAMHB'de 1:100 sulandırma hazırlayın ve 1–11 kuyularına 100 μL bakteriyel süspansiyon ekleyerek yaklaşık 5 × 10⁵ CFU/mL nihai aşı konsantrasyonu elde edin.
      3. Mikroplakaları 37 °C'de, ortam atmosfer koşullarında 24 saat boyunca kuluçka¹².
   4. MIC belirleme ve yorumlama
      1. Minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC), kuluçkadan sonra görünür bakteri büyümesini tamamen engelleyen en düşük teikoplanin konsantrasyonu olarak tanımlayın.
      2. MIC değerlerini Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi'nin (EUCAST) sürüm 14.0 yönergelerine^{göre yorumlayın 13}.

4. Kalite kontrolü

1. Kalite kontrol sürünü olarak Staphylococcus aureus ATCC 29213 kullanın; teicoplanin MIC referans aralığı 0,25–1 mg/L arasındadır.

5. İstatistiksel analiz

1. Yöntem karşılaştırması
   1. Otomatik duyarlılık testi sistemi kullanılarak elde edilen teicoplanin MIC sonuçlarını, BMD referans yöntemiyle elde edilenlerle karşılaştırın.
   2. Kategorik uyumu (CA), iki yöntem arasında uyumlu hassas veya dirençli sonuçlar olarak tanımlayın.
2. Hata sınıflandırması
   1. Çok büyük hataları (VME) otomatik duyarlılık test sistemi tarafından hassas olarak kategorize edilen ancak BMD tarafından dirençli izolasyonlar olarak tanımlayın.
   2. Büyük hataları (ME) otomatik duyarlılık testi sistemi tarafından dirençli olarak kategorize edilen ancak BMD tarafından hassas olan izolasyonlar olarak tanımlayın.
3. Performans kriterleri
   1. Kategorik uyum %≥90 ve VME ile ME oranları %≤3 olduğunda, yayımlanmış değerlendirme^kriterleri 14,15'e uygun olarak yöntem performansını kabul edilebilir olarak kabul edilebilir olarak kabul edin.

Sonuçlar

Analize 2,5 yıl boyunca klinik örneklerden elde edilen toplam 533 izolat dahil edildi. Tüm metisiline dirençli CoNS (MR-CoNS) izoleleri ve S. aureus izolatılarının %71,7'si metisiline dirençli bulundu. Yara sürüntüsü örnekleri en yaygın klinik örnekler olarak S. aureus izolatıları verirken, MR-CoNS izolatları en sık kan kültürlerinden elde edildi (Şekil 1).

Tartışma

Antimikrobiyal direnç, küresel halk sağlığı için en önemli tehditlerden biridir ve sağlık maliyetlerinin artmasına, tedavi başarısızlığına ve ölümlere katkıda^{bulunur 3}. Staphylococcus aureus'un neden olduğu hem topluluk hem de hastane kaynaklı enfeksiyonların sıklığı ulusal ve küresel düzeyde artmaya devam etmektedir. Özellikle metisiilin direnci, artan hastalık ve ölüm oranıyla ilişkilidir; Bu nedenle, direnç profilleri dünya çapında rutin olarak

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Katyonla ayarlanmış Mueller Hinton Suyu	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya	CM0405B	Et suyu mikro sulandırma yönteminde bakteriyel büyüme için
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé Rieux, Fransa	410893	Bakteriyel tanımlama için
McFarland standardı	bioMé Rieux, Fransa	95060-958	Bakteriyel inokulumun standartlaştırılması
Petri kapları	RTA, Tü rkiye	2102	Orta hazırlık ve bakteriyel yetiştirme için
Pippette ucu 20 - 200 μ L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya	Z740105	Katyonla ayarlanmış Mueller&ndash dağılımı için; Hinton suyu (CAMHB) U-bottom mikroplakalarına ve seri seyreltmelerin hazırlanmasına
Koyun kanı agarı	RTA, Tü rkiye	2001	Mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi
Staphylococcus aureus	Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu	29213	Bu çalışmada kullanılan referans suş
Teicoplanin tozu	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Almanya	T0578	Antibiyotikler
Triptik soya buloru	Merck, Almanya	1,054,590,500	Mikroorganizmaların izolasyonu ve yetiştirilmesi
U alt kuyu plakası	Thermo Fisher Scientific	163320	Et suyu mikro sulandırma yöntemiyle antimikrobiyal duyarlılık testi için
VITEK 2 AST-P664 kartları	bioMé Rieux, Fransa	414197	Antimikrobiyal duyarlılık testi için
VITEK2 Compact	bioMé Rieux, Fransa	4700030	Antimikrobiyal duyarlılık testi için