Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Ryan Wallis; Federica Mossa; Metka Gorkič Casey; Luke Gammon; Cleo L. Bishop

doi:10.3791/69742

Yöntem makalesi

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

532 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69742

⸱

24 Temmuz 2026

Ryan Wallis¹ , Federica Mossa¹ , Metka Gorkič Casey¹ , Luke Gammon¹ , Cleo L. Bishop¹

¹Blizard Institute, Faculty of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London

Bu makalede

Özet

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Özet

Çoklu immünoflüoresans (IF) boyama, geleneksel IF görüntülemeye göre sofistike açısından bir adım değişikliği temsil eder ve tek bir doku bölümü içinde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak tespit edilmesini sağlar. Bu, daha geniş bir hücre tipi ve doku yapısının profilini çıkarmayı kolaylaştırır ve ardışık kesitlerle mümkün olmayan bir şekilde bu aralarındaki mekânsal ilişkinin değerlendirilmesini sağlar. Yaşlanmanın tek bir evrensel belirteci yoktur ve artık yaşlanma imzalarının hücre türüne, yaşlanma tetikleyicisine ve indüksiyondan sonraki zamana göre değiştiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Böylece, multiplex IF'in sunduğu kombinatoryal yaklaşımlar, tek bir doku kesitinde tarafsız yaşlanma hücre algısını sağlayan güçlü bir araç sağlar.

Burada, 34 insan dokusu tipinden çekirdekler içeren doku mikrodizileri kullanıldı. Bunlar, yapısal, bağışıklık ve yaşlanma biyobelirteçlerinin kombinasyonuyla 10 plekslik bir testle boyanmış, çoklu slayt tarayıcı kullanılarak alınan görüntülerle yapılmıştır. Bu yöntem, dokudaki yaşlanmış hücrelerin bolluğu ve mekansal dağılımının değerlendirilmesini sağlar. Çoklu veri setleri oluşturmak için ardışık boyama, görüntüleme ve boya inaktivasyon döngüleri kullanıldı; görüntüler ise çoklu floresans slayt tarama sistemi kullanılarak alındı. Hem manuel slayt hazırlama hem de slayt boyacı kullanılarak otomatik işleme protokolleri, tek hücreli segmentasyon ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak mekansal analiz ile açıklanır. Genel olarak, bu yöntemler doku örneklerindeki yaşlanma ile ilişkili biyobelirteçlerin boyama, görüntüleme ve mekansal analizi için kapsamlı bir rehber ile çoklu görüntüleme için daha genel bir rehber sunmaktadır.

Giriş

Yaşlanma, yaşlanma, kanser ve bağışıklık fonksiyonu ile normal doku homeostazı gibi geniş bir yelpazede süreçte katkıda bulunduğu gösterilen karmaşık bir terminal hücre^{kaderidir 1}. Ancak, evrensel bir yaşlanma biyobelirtecisi tanımlanmamıştır ve tanımlama, sözde hallmark² olarak adlandırılan bir dizi değerin değerlendirilmesine dayanır. IF doku görüntülemesi tek bir bölüm içinde bir veya iki biyobelirteçin değerlendirilmesiyle sınırlandırılmıştır; bu da aynı örnek içindeki belirteç kombinasyonlarının değerlendirilmesini^{zorlaştırmıştır 3}. Bu sorun, tek hücre^{seviye 4'te} yaşlanan hücre heterojenliğinin ortaya çıkan tablosu ve in vivo yaşlanma^{özelliklerinin 2'nin} azlığı ile daha da kötüleşiyor; bu da dar tespit panellerinin yeni bağlamlarda veya değerli örneklerle seçilmesini^{zorlaştırıyor} ^5,6.

Çoklu IF görüntüleme, tek bir doku bölümünde birden fazla biyobelirteçin ardışık olarak tespit edilmesini kolaylaştırarak bu sınırlamayı^{aşmayı amaçlar 3}. Bu, floresan etiketli oligonukleotid raporlayıcıları kullanılarak veya floresan sinyalleri boya inaktivasyon süreciyle söndürülen etiketlenmiş birincil antikorların kullanılmasıyla mümkündür⁷. Her iki durumda da, ardışık görüntüleme kullanılarak mekansal olarak çözülmüş bir biyobelirteç paneli oluşturulur ve bu da geleneksel IF'ye göre ardışık doku boyama avantajları sunar. Bu karmaşık profillerin tek bir doku örneğinde oluşturulması sayesinde, daha fazla sayıda yaşlanan fenotip, hücre tipi ve doku yapısı tespit edilebilir; bu da mekansal ilişkileri ve dağılımlarının karmaşık bir şekilde değerlendirilmesine olanak^tanır. 7.

Ancak, çoklu IF görüntüleme profillerinin karmaşıklığı geleneksel IF'in karmaşıklığını önemli ölçüde aşsa da, işaretleyici panelleri genellikle pratik kısıtlamalar nedeniyle <100 biyobelirteç ile^{sınırlıdır 3}. Bunlar arasında, her sonraki turda epitop antijenitesinin potansiyel kaybı, sinyal yoğunlukları veya doku bütünlüğü ve mutlaka çapraz reaktivite içermemesi gereken büyük antikor kombinasyonlarının optimize edilmesi^{zorluğu yer alır} ^8,9. Bu nedenle, her antikor turunun optimal bileşiminin belirlenmesi, çoklu panel tasarımında önemli bir husustur. Sonuç olarak, genel "plex" mekânsal transkriptomik gibi tekniklerle elde edilenden daha azdır. Ancak, multipleks IF transkripsiyon seviyeleri yerine proteini nicelikle ölçerse, bu iki teknik tamamlayıcı olarak kabul edilebilir ve büyük ölçekli "multi-omics" boru hatlarında birleştirilebilir¹⁰.

Burada, 34 doku tipinden çekirdek içeren insan dokusu mikrodizileri görüntülendi. Bunlar, 10-plex testinde yapısal, bağışıklık ve yaşlanma biyobelirteçlerinin kombinasyonuyla boyandı: Pan-sitokeratin (PANCK), CD31, alfa smooth kas aktini (aSMA), keratin 15 (K15), vimentin, FOXP3, CD8, Ki67, p16 ve Lamin B1. Hem kaydırakların manuel hazırlanması için ayrıntılı adım adım protokoller hem de otomatik bir sürgü boyama cihazı ile otomasyonu entegre etmek için uyarlama sağlanmaktadır. Temsil deneysel karşılaştırmalar, ikincisinin hem doku bütünlüğünü hem de çoğu belirteç için floresan^{sinyali 11'i} iyileştirdiğini göstermektedir. Son olarak, HALO dijital patoloji yazılımı aracılığıyla çoklu doku mikroarray görüntülerinin analizi için adım adım bir rehber sunulmaktadır; bunlar arasında tek hücre segmentasyonu ve biyobelirteç ekspresyonunun mekansal analizi yer almaktadır. Temsil eden sonuçlar, yaşlanma paneline dayalı olarak yaşlanan hücre tespiti ve nicelendirmenin teknik fizibilitesini göstermektedir (yaşlanma sınıflandırmasının kapsamlı biyolojik doğrulaması yerine).

Genel olarak, bu metodoloji, yaşlanma biyobelirteçlerinin in vivo çoklu değerlendirmesine rehber ve çoklu görüntüleme için daha genel bir rehber olarak sunulmaktadır (Şekil 1).

Protokol

Etik bildirisi

Bu çalışmaya dahil edilen doku örnekleri, Barts Health NHS arşivinden tanı gereksinimlerine fazlası olarak gelmiş, tüm ilgili kurumsal ve düzenleyici yönergelere uygun olarak alınmış ve etik protokoller 10/H0704/65 ile 05/QO605/140 kapsamında onaylanmıştır.

1. Slayt hazırlığı, antijen geri alma ve bloklama

Not: Belirtilmedikçe, tüm adımlar standart laboratuvar koşullarında oda sıcaklığında (~20–25 °C) gerçekleştirilir.

İlk örnek montajı
1. Optimal doku tutumunu sağlamak için, formalin sabit parafinli gömülü (FFPE) doku örneklerini yüksek kaliteli mikroskopi slaytlarına (pozitif yüklü) monte eder ve böylece minimum şarj kaybı sağlanır.
2. Bölümlerin kalınlığı 5 μm'den fazla olmamalı ve maksimum 4 x 2 cm²boyutunda merkezi olarak monte edildiğinden emin olun; böylece Kapaksız Kaydırma Tutucu (Coverslipless Slide Holder) izleme penceresinde görünürlüğü sağlanır.
3. Numune hazırlama işlemini ya manuel olarak bir gizleme odası aracılığıyla ya da otomatik bir boyacı ile gerçekleştirin.
Gizlenme odası
1. 60 °C sıcaklıkta gece boyunca 24 slaytla pişirin, doku yukarıya bakıyor.
2. Örnekler, ksilende ardışık 5 dakikalık kuluçka hareketleriyle (adım iki kez gerçekleştirilir) ve etanol konsantrasyonlarını (%100, 100%, %90, %70) azaltarak her reaktifte tamamen slaytları batırarak balmumdan arındırılır ve yeniden hidratlanır.
3. Sürgüleri PBS'ye 5 dakika batırarak yıkayın (adımı iki kez yapın).
4. Slaytları PBS'de 10 dakika boyunca %0,3 Triton X 100 içine batırarak geçirimlileştirin.
5. Sürgüleri PBS'de 5 dakika batırarak yıkayın.
6. Aşağıdaki reaktifleri her ayrı bölüme ekleyerek gizlenme odasını hazırlayın:
  1. Ana odaya 500 mL_{ddH 2}O ddH ile gönder.
  2. 250 mL ddH₂O ddH 2 O metal raf sepetindeki merkezi rezervuar pozisyonuna yerleştirildi.
  3. 250 mL pH 6 Antijen maske açma çözeltisi 1 (ARS1) metal raf sepetinin sol rezervuar pozisyonunda.
  4. 250 mL pH 9 Antijen maske açma çözeltisi 1 (ARS2) metal raf sepetinde sağ rezervuar pozisyonunda (10x stoktan ddH₂O içinde seyreltilmiş).
7. Örnekleri ARS1 çözeltisine batırın ve üç rezervuarın üzerine bir buhar şeridi döşeyin.
8. Kapağı kapatma odasına yerleştirin ve kapalı konuma kilitlemek için çevirin, böylece basınç bırakma değerinin basınç sapı üzerinde düz durduğundan emin olun.
9. Önceden programlanmış 110 °C sıcaklık noktasına yükselen ve 4 dakika boyunca geçerli olan bir protokolü seçip başlatın.
10. Isıtma aşamasında, sıcaklık göstergesi paneli 70 °C gösterdiğinde, 20 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın. Sistem bu süre zarfında sıcaklığa ulaşır, tutur ve basıncı azaltmaya başlar.
11. Sistemi tam olarak dekompres olarak bir cımbızla basınç bırakma valfini dikkatlice eğip kapağı açın. Sıcaklığa ulaşıldığından emin olmak için akarsu şeridini kontrol edin.
12. ARS1 çözeltisinden örnekleri ARS2 çözeltisine taşıyın. Kamburun kapağını tekrar kapatın (ama kilitlemeyin veya yeniden basınçla kapatmayın) ve 20 dakika süreleyici başlatın.
13. Sürgüleri içeren rezervuar sepetini tezgaha çıkarın.
14. Sepeti tezgah üstünde oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
15. Örnekleri 5 dakika boyunca PBS'ye batırarak yıkayın (bu adımı dört kez yapın).
16. Örnekleri 1 saat boyunca %10 eşek Serumu ve %0,3 BSA içeren PBS'ye batırarak bloklayın.
17. Örnekleri 5 dakika boyunca PBS'ye batırarak yıkayın.
18. Karşı boya örnekleri, DAPI (1 μg·^mL-1) içinde 15 dakika boyunca PBS'de seyreltilerek daldırılır.
19. Örnekleri 5 dakika boyunca PBS'ye batırarak yıkayın.
20. Kaydırakları Örtüsüz Sürgü Tutucularına takın.
Otomatik kaydırmalı boyama (örneğin Bond RXm)
1. Yıkama, ER1 ve ER2 toplu reaktifleri alt çekmeceye yerleştirin.
2. Sistemi başlatmak için açın.
3. Atık konteynerlerinin boş olduğundan ve diğer tüm reaktiflerin minimum seviyelerin üzerinde olduğundan emin olun.
4. Reaktif kolunu hazırlamak için sistemin belirttiği toplam slayt sayısı için gerekli hacimlerde pot pozisyonlarını aşağıdaki reaktiflerle doldurun:
  1. PBS dolu reaktif boş potu reaktif koluna yerleştirin.
  2. PBS ile seyreltilmiş %0,3 Triton X-100 içeren reaktif kapını reaktif koluna yerleştirin.
  3. Bloklama tamponu – %10 eşek Serumu içeren reaktif potunu %0,3 BSA içinde PBS içine yerleştirin.
  4. PBS ile seyreltilmiş DAPI (1 μg·^mL-1) içeren reaktif potes'i reaktif koluna yerleştirin.
5. Tüm reaktif kolunu (hazırlanmış kap kaplarıyla birlikte) sisteme yerleştirin.
6. Ekrandaki talimatlara uygun olarak, gece boyunca çalıştırılacak aşağıdaki adımları içeren otomatik bir boyama protokolü oluşturun:
  1. 60 °C'de 10 saat pişirin.
  2. PBS'de seyreltilmiş %0,3 Triton X-100 ile kuluçka yapın (10 dakika).
  3. Toplu yıkama reaktifi ile yıkayın (önceden programlanmış rutin).
  4. Epitope Retrieval 1 (ER1) toplu reaktifiyle (20 dakika, 100 °C) kuluçka yapın.
  5. Toplu yıkama reaktifi ile yıkayın (önceden programlanmış rutin).
  6. Epitope Retrieval 2 (ER2) toplu reaktifi ile kuluçka (20 dakika, 100 °C).
  7. Toplu yıkama reaktifiyle üç kez yıkayın (önceden programlanmış rutin).
  8. Bloklama tamponu ile inkübe yapın - %10 eşek serumu ve %0,3 BSA PBS (1 saat).
  9. DAPI (PBS'de 1 μg·^mL-1 ) dört kez, her seferinde 5 dakika sürece.
  10. Wash (önceden programlanmış rutin).
7. Tüm ekleme hacimlerinin 150 μL olarak ayarlandığından ve hazırlanma adımının açılır menü üzerinden mu temizlemeye ayarlandığından emin olun.
8. 30'a kadar slayt için detaylar ekleyin ve barkod etiketleri yazdırın.
9. Kaydırma tepsisini çıkarın ve sürgüleri yukarıya bakacak şekilde yerleştirin. Her kaydırağın üzerine yukarıya bakacak şekilde örtü karoları ekleyin. Barkod etiketlerini slayt üzerinde yukarıdan aşağıya okunacak şekilde yerleştirin.
10. Sürgü tepsisini tekrar otomatik boyaya yerleştirin ve ön tepsi düğmesiyle kilitleyin.
11. Şu anda sürgülerle dolu her sürgü kolu için başlatma düğmesine basın.
  Not: Tam protokolün çalışması ~15 saat sürüyor (10 saat pişirme dahil). Yeniden hidrasyon yıkamalarını önlemek için başlama süresi geciktirilebilir.
12. Döngü tamamlandıktan sonra kaydırakları Örtüsüz Kaydırma Tutucularına takın.
Yükleme Kapaksız Sürgü Tutucu
1. Sürgüleri Coverslipless Slide Tutucu'ya yerleştirin, üst ve sağ kenarları metal durduruculara hizalayın.
2. Plastik kamlarla (ikisini aynı anda kullanarak) sürgü kapalı asma kilit pozisyonuna dönerek kilitleyin.
3. Sürgü tamamen düz oturmuş ve tutucu içinde sallanmadığını kontrol edin.
4. Kapaksız Sürgü Tutucu insert hazını, yan çubukları iki elinizle sıkıştırarak basıncı sınırlandırın ve kırılmaları önleyin.
5. Giriş portundan Coverslipless Slide Tutucu'nu, %50 gliserol içeren PBS içeren 2 mL montaj ortamı ile yükleyin.
6. Slaytın sol tarafındaki her iki yönde de bir barkod etiketi ekleyin.
7. Görüntülemeye geçin.

2. Çoklu görüntüleme

Bölge seçimi ve otofloresans görüntüleme
1. Çoklu görüntüleme edinme yazılımını (örneğin Mx iş akışı (4.2.0.4)) yazılımını açın ve protokol yayıncı sihirbazını kullanarak gerekli turlar / biyobelirteçler ve maruz kalma süreleriyle bir protokol oluşturun.
  Not: Her antikorun mevcut kanallara atamasını önceden belirleyin. Zayıf belirteçleri (yani daha yüksek pozlama süreleri gerektirenleri) en az otofloresanslı olan Cy5 ve Cy7 kanallarıyla sınırlayın. Çoklu floresans görüntüleme sisteminde her tur başına en fazla 4 antikor kullanılabilir.
2. Sanal H&E görüntüleri gerekiyorsa, Cy3 kanalının alındığından emin olun.
3. Slaytları parti oluşturucu aracı aracılığıyla (barkod numarası kullanılarak) protokole ekleyerek çoklu deney iş akışı oluşturun.
4. Slaytı satın alma yazılımı (4.2.0.4) aracılığıyla mikroskopa yükleyin ve her slayt için 2x ve 10x görüntüleme adımlarıyla ilgi alanlarını çizerek iş akışını takip edin. Bölge seçerken, dikiş sorunlarını önlemek için her görüş alanının en az iki komşusu olduğundan emin olun.
5. Boş cam sayısını en aza indirerek dikiş sorunlarını önleyin ve çalışma sürelerini azaltın, boş alanlar seçmeyin.
6. 2.1.1. adımda belirlenen pozlama süreleriyle 20x otofloresan görüntüleme işlemi yapın ve kalite kontrol (QC) sihirbazını izleyin. Görsel olarak odak dışı bölge veya artefakt olmadığını doğrulayın. Bunlar tespit edilirse, kalite kontrolünü başarısız bırakıp yeniden imim yap.
  Not: Kabul edilebilir kalite sıkılığının tek bir ölçüsü yoktur ve başarı, gerekli deneysel okumalara ve örneğin ne kadar değerli olduğuna bağlıdır. Odak dokusu yeterli boyama yoğunluğuna sahip doku ideal olarak görsel olarak net ve net görünmelidir. Küçük doku ayrılması/bozulma alanları sıklıkla gözlemlenir; bu durum ek görüntülemeyle düzelmeyecek ve örnek geri kalanının iyi görüntülendiği takdirde tolere edilebilir. Büyük parlak parçalar (örneğin toz) gözlemleniyorsa, en iyisi kaydırağı temizleyip yeniden imgelerek bunları ortadan kaldırmaktır.
7. Son biyobelirteç sinyalinden çıkarılacak arka plan görüntüleri oluşturun; bu süreç her çoklu tur için tekrarlanır.
  Not: Tüm çoklu mermiler satın alma yazılımı aracılığıyla otomatik olarak hizalanacaktır.
Robotik plaka taşıyıcısının kullanımı
1. Satın alma yazılımının kapalı olduğundan emin olun.
2. Robotik entegrasyon yazılımını açın ve başlat'a tıklayın.
3. Üst üste yığılmış Kapaksız Kaydırma Tutucusunu giriş yığınına yerleştirin.
4. Çıkış yığınının boş olduğundan emin olun.
5. Robotik Plaka Handler Kontrol Yazılımını (örneğin Harmony robotics yazılımı (3.2.0)) açın ve sihirbazı takip ederek doğru plaka tipi ve numaranın seçildiğinden emin olun.
6. Başlat tuşuna tıklayın ve plaka taşıyıcısı mikroskopu yükler; mikroskop slayt barkodu sayesinde doğru iş akışı aşamasını otomatik olarak bilir.
  NOT: Aşağıdaki biyobelirter görüntüleme adımları için robotik yükleyici kullanılırsa, yazılımda "dinamik olarak ayarlanmış pozlama süreleri" seçeneğinin seçilmemesi ve önceden ayarlanmış pozlama sürelerinin kullanılması şarttır.
Ardışık biyobelirteç boyama, boya inaktivasyonu ve çoklu görüntüleme
1. Santrifüj antikorları 13.000 x g oda sıcaklığında 1 dakika boyunca kısıtlayarak artefaktları sınırlayın.
2. Antikor çözeltisi %0,3 BSA içeren PBS içinde hazırlanır.
  Not: Nihai antikor konsantrasyonları değişkenlik gösterebilir, ancak 1:200 seyreltme yeni bir antikorun optimizasyonu için iyi bir başlangıç noktasıdır.
3. Kaplamasız Sürgü Tutucu portundan pipet yaparak montaj ortamını çıkarın ve %0,01 Tween içeren 2 mL PBS ekleyerek 5 dakika boyunca yıkayın (bu adımı üç kez tekrarlayın).
4. PBS çıkarılır ve PBS ile seyreltilmiş 350 μL antikor çözeltisi porta pipetlenir. Bu hacim, boyama odasında tam numune kaplamasını sağlamak için optimize edilmiştir.
5. Oda sıcaklığında tezgah üstünde 1 saat kuluçka yapın.
6. Antikor çözeltisini Coverslipless Slide Holder portundan pipetle çıkararak çıkarın ve %0,01 Tween içeren 2 mL PBS ekleyerek 5 dakika boyunca yıkayın (bu adımı üç kez tekrarlayın).
7. PBS'yi çıkarın ve 2 mL montaj ortamı ekleyin.
8. Kapaksız Slayt Tutucuyu mikroskopa yerleştirerek otomatik yuvarlak özel görüntüleme adımını başlatın.
9. Tamamlandıktan sonra, ekranda gösterilen kalite kontrol adımlarını geçerek iş akışını ilerletir.
10. Kaplamasız Sürgü Tutucu portundan pipet yaparak montaj ortamını çıkarın ve %0,01 Tween içeren 2 mL PBS ekleyerek 5 dakika boyunca yıkayın (bu adımı üç kez tekrarlayın).
11. 7 mL_{ddH 2}O, 2 mL 0.5M NaHCO₃ ve 1 mL %30 H₂_{O 2} içeren boya inaktivasyon çözeltisini taze hazırlayın. Bu çözeltiyi hemen kullanmadan önce hazırlayın ve gecikmeden slaytlara uygulayın.
  Dikkat: Hidrojen peroksit uygun laboratuvar PPE'si kullanılarak ele alınmalıdır.
12. PBS çıkarılır ve H₂O₂çalışma çözeltisine eklendikten hemen sonra her slayt başına 2 mL boya inaktivasyonu eklenir.
13. Sürgü tutucusunda tezgah üzerinde 15 dakika kuluçka yapın.
14. Kaplamasız Sürgü Tutucu portundan pipet yaparak boya inaktivasyon çözeltisi çıkarın ve %0,01 Tween içeren 2 mL PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
15. PBS'yi çıkarın ve 2 mL montaj ortamı ekleyin.
16. Örtüsüz Sürgü Tutucu tutucusunu mikroskopa yerleştirerek otomatik tur spesifik 20x otofloresan görüntüleme başlatın.
17. Tamamlandıktan sonra, ekranda gösterilen kalite kontrol adımlarını geçerek iş akışını ilerletir.
18. 2.3.1'den 2.3.1'e kadar olan adımları gerekli kadar tur/işaret için tekrarlayın. (İşlem, üretici tarafından 10 mermiye kadar doğrulanmıştır, ancak bu sınırın başlıca belirleyicisi doku bütünlüğü olacaktır).

3. Dijital patoloji yazılımı aracılığıyla Otomatik HighPlex analizi

Veri yüklenme ve TMA'nın segmentasyonları
1. Dijital Patoloji Yazılımı'ndaki "çalışmalar" sekmesine çoklu IF görüntülerini sürükle bırakın.
  1. Sanal H&E görüntüleri ayrı ayrı olarak aktarılmalıdır.
2. Doku mikroarray (TMA) örnekleri için "TMA modülü" kullanılır. Bu, çekirdek çekirdek etiketlemeye olanak tanır ve verilerin takimini, slaytla bütünü ele almaktan çok daha basit hale getirir.
3. TMA bloğu oluşturmak için önce blok eylemlerine gidin ve yeni bir TMA haritası oluşturun.
  1. Bu, manuel olarak veya import sihirbazı aracılığıyla Excel elektronik tablosu kullanılarak girilebilir.
4. TMA'yı çalışmalar sekmesinden örnek üzerine sağ tıklayıp "Segment TMA" seçeneğini seçerek segmentlere ayırın.
5. Çekirdeklerin boyutunu seçin ve kırmızı kutuları hareket ettirerek haritaya hizalayın. Tamamlandığında kaydet'e tıklayın.
6. Analiz ve veri ihracatı artık çekirdek bazında yürütülebilir.
  Not: Aşağıdaki boru hattı, TMA modülü kullanılmadan da tam doku kesitlerinde çalıştırılabilir.
Tek hedef segmentasyonu
1. Analiz sekmesine gidin.
2. "Ayarlar eylemleri" menüsünde yükle ve HighPlex floresan analiz modülünü seçin.
  1. Bu sonuçlar için v5.2.2 kullanıldı.
  2. Boya seçiminde, değerlendirilen işaretleyicileri manuel olarak veya "otomatik doldurma boyaları" fonksiyonuyla doldurun.
  3. Nükleer algılamada, HALO versiyonuna uygun bir segmentasyon türü seçin (burada geleneksel, yapay zeka dışı versiyon tanımlanır).
  4. Çekirdekleri yakalamak için nükleer kontrast eşiği ayarlanır (genellikle 0.4 – 0.6 aralığında).
    1. Çekirdekleri yakalamak için minimum nükleer yoğunluk ayarlayın (genellikle 0.05'ten düşük olmamalıdır).
    2. DAPI sinyalinin yoğunluğuna bağlı olarak maksimum görüntü parlaklığını yaklaşık 0.4'e düşürmek (16-bit görüntülerin dinamik aralığı nedeniyle 1'den düşürülür).
    3. Doku tipine bağlı olarak segmentasyon agresifliği, dolgu delikleri ve boyut filtreleri gibi ek parametreleri ayarlayın.
  5. Bu işlemi membran ve sitoplazma tespiti için tekrarlayın.
    1. Geleneksel sitoplazma tespiti için 2 ile 5 arasında bir yaka yarıçapı genellikle iyi bir başlangıç noktasıdır.
Biyobelirteç pozitif eşik seçimi
1. Boyama seçimi aşamasında seçilen her biyobelirteç ham yoğunluk değerleri için ölçülecektir.
2. Her belirteç için ya ikili (pozitif vs negatif) ya da birden fazla (yüksek, orta, düşük, negatif) eşik sınıflandırması belirleyin, boyama desenine göre nükleer, sitoplazmik veya membran bölmelerindeki kaydırmalarla değerleri ayarlayın.
  1. İkili eşik ayarlamak için, kesme değerini belirlemek için yalnızca alt kaydırıcıyı ayarlayın.
  2. "Analyze" menüsündeki gerçek zamanlı ayar penceresini kullanarak performansı değerlendirin ve analiz maskesini açıp kapatarak ham leke seviyeleriyle karşılaştırın.
3. "Fenotipler" fonksiyonunu kullanarak işaretleyici kombinasyonları oluşturun.
  1. Mantıksal geçiş, tüm işaretleyiciler için VE/VEYA pozitif/negatif içerir, böylece tüm boyalar arasında sınırsız bir matris oluşturulabilir.
4. Tek hedef veri gerekiyorsa (mekânsal analiz için gereklidir) depolama nesnesi verisini true olarak ayarlayın.
5. Protokolü kaydedin ve çalışmalar sekmesinde tüm slaytları analiz için işaretleyin, sağ tıklayın ve istediğiniz protokolle analiz yapın.

4. Sonuçların İncelenmesi

Dijital Patoloji Yazılımında Mekânsal Değerlendirme
1. Tüm sonuçları dijital patoloji yazılımının "sonuçlar sekmesi"nde görüntüleyin.
2. Üstteki özet tablo, mevcut görüntüdeki tüm özelliklerin ortalamalarını içerecektir.
  1. Bu, ayrı açılırsa tek çekirdek için geçerli olur.
3. Alt tablo, her özellik için tek hedef verilerini gösterir.
  1. Bireysel veri noktalarını tablodan seçerek veya görselde tıklayarak sorgulayın.
4. Uygun sütunlarda fenotipleri, işaretleyici pozitifliği veya yoğunluk eşiklerini filtreleyin. Bunlar daha sonra "nesne eylemi" > "plot" > "mekansal grafik" şeklinde yönlendirilerek çizilebilir.
5. Bu işlem birkaç farklı grup için yapıldıktan sonra, mekânsal analiz yapılabilir.
6. "Mekansal analiz" butonunu seçip gerektiğinde seçenekleri seçerek:
  1. En Yakın Komşu: Belirli bir hücre türünün en yakın gözlemine başka bir hücre türünün mesafesini bulur.
  2. Yakınlık analizi: Seçilen bir hücre tipi etrafında bantlar halinde ölçür ve diğer herhangi bir hücre tipinin hem sayısını hem de mesafesini nicelikle hesaplar.
  3. İnfiltrasyon analizi: Belirli bir hücre tipinin bulunduğu belirli bir açıklama katmanına (görselde belirtme aracı aracılığıyla işaretlenen) mesafeyi bantlar halinde ölçer.
  4. Yoğunluk Isı Haritası: Bir hücre tipinin görüntü boyunca dağılımının görselleştirilmesini sağlar.
7. Mekansal analiz, kaydırma eylemlerinin altındaki "spots result" butonu ve "sonuç eylemleri" açılır menüsiyle tüm TMA çekirdeklerinde çalıştırılabilir.
Sonuçların Dışa Aktarılması Dijital Patoloji Yazılımı
1. Sonuçlar, TMA sekmesinden "slide actions" > "export" seçeneklerine geçerek dışa aktarılabilir.
2. Yalnızca özet veri veya tam tek hedef analizi gelişmiş sekme üzerinden dışa aktarılabilir.
3. Verileri .csv dosyaları olarak üretin ve ardından R gibi yazılımlarda analiz edilerek tüm hücrelerde biyobelirteç yoğunluğunun popülasyon düzeyinde analizini oluşturabilirsiniz. Tek nesne özellikleri şunları içerir: Örnek Kimliği, benzersiz nesne kimliği (hücre başı), her belirteç için ham yoğunluk değerleri, fenotip sınıflandırmaları ve mekansal koordinatlar.

Sonuçlar

10-plex IF ve eşleştirilmiş sanal H& Farklı metodolojilerle hazırlanmış iki slayt üzerinden 34 insan doku tipini kapsayan 136 doku mikroarray çekirdeği için E görüntüleri oluşturuldu (Şekil 2). Bu temsilci görüntüler, korunmuş doku morfolojisiyle başarılı çoklu boyama ve doku mikroarray çekirdeklerinde birden fazla biyobelirteçin net tespitini göstermektedir. Bir slayt otomatik slayt boyaıcıyı, diğeri ise manuel slayt hazırlama sürecini kullanıyordu. Manuel yöntemle, örtücü odası tabanlı yöntemle, doku ayrılması ve kaybedilen veya kaymış çekirdekler ile daha fazla doku artefaktı gözlemlenmiştir (Şekil 3). Bu artefaktlar, örnek veya çekirdek başına analiz edilebilir doku bölgesini azaltarak aşağıya doğru çoklu görüntü analizini etkiler. Bu gözlemler, protokolün çeşitli doku tiplerinde güvenilir çoklu boyama ve görüntüleme sağladığını doğrulamaktadır.

Başarılı çoklu görüntüleme, korunmuş doku morfolojisi, boyama turları arasında tutarlı hizalanma ve net, spesifik biyobelirteç sinyal algılamayla gösterilir. Buna karşılık, optimal olmayan sonuçlar, analiz edilebilir bölgeleri azaltan ve sonraki analizi engelleyen doku kopması, sinyal kaybı veya görüntüleme artefaktları ile karakterize edilir.

Sonra, PANCK (epitel dokusu), CD31 (endotel doku), aSMA (stromal doku), keratin 15 (K15; bazal epitel), vimentin (mezenkimal hücreler), Ki67 (proliferasyon belirteci), CD8 (sitotoksik T hücreleri) ve FOXP3 (TREG'ler) gibi belirteçlerin boyama profili her iki slayt hazırlama tekniğinde karşılaştırıldı ve manuel yöntemle niteliksel (görsel olarak) küçük bir sinyal azalması gözlemlendi (Şekil 4A). Dijital Patoloji Yazılımında biyobelirteç sınıflandırma eşikleri kullanılarak, örnekler veri setindeki ~630K hücrenin her biri için pozitif ve negatif popülasyonlara katmanlandı (Şekil 4B). Belirtici sinyalinin nicel değerlendirmesi, dijital patoloji analiz iş akışından elde edilen yoğunluk ölçümleri kullanılarak gerçekleştirildi. Popülasyon yoğunluğu tahminleri (eğriyi altındaki alan nüfusun %100'ünü temsil eder) ve medyan yoğunluk değerleri, otomatik sürgü boyama cihazı kullanıldığında pozitif popülasyonlarda 5/8 biyobelirteçte manuel sürece kıyasla ılımsız artışlar göstermiştir (Şekil 4C).

Panel tamamlandıktan sonra, yukarıda açıklanan belirteçler Lamin B1 (nükleer zar) ve p16 (siklin-bağımlı kinaz inhibitörü) için ek biyobelirteçlerle eşleştirildi; böylece göreceli doku bolluğu ve tüm 10 belirtecin tek bir örnek boyunca dağılımı görselleştirildi (Şekil 5). Çok sayıda biyobelirteçin profil yapılabilmesi, yaşlı olma alanında özellikle faydalıdır; bu alan, geçerli bir sınıflandırma sağlamak için birden fazla ortogonal belirteçin değerlendirilmesine^{dayanır 2}. Burada, p16 yüksek ve düşük popülasyonlarda Lamin B1 yoğunluğundaki değişiklikleri profil edebildik. Önemli olarak, bu bir çoklu hücre örneği olduğundan, bu hücreler aynı doku içindeki diğer hücre tiplerinin dağılımıyla karşılaştırıldığında mekânsal bir bağlama yerleştirilebildi (Şekil 6A). Dijital Patoloji Yazılımı sınıflandırma eşiği aracılığıyla, bu boyama p16 pozitif hücrelerin negatif muadillerine göre daha düşük Lamin B1 seviyeleriyle ilişkili olduğunu göstermek için nicele edildi (Şekil 6B), bu profil, daha önce tanımlanan yaşlanma ile ilişkili işaret^{desenleri 12} ile tutarlıdır. Ayrıca Lamin B1 negatif hücrelerin p16 seviyelerinin daha yüksek olduğunu gözlemledik (Şekil 6C). Dijital Patoloji Yazılımı'ndaki fenotip fonksiyonu kullanılarak (hücreleri tek hücre segmentasyonu ve çoklu belirteçlerin eşik noktasına göre sınıflandırır), bu belirteçlerin kombinasyonu, bir hücre popülasyonunu yaşlanmış olarak tanımlamak için kullanıldı; yani hem p16 pozitif hem de Lamin B1 negatif olanlar. Daha sonra, bu hücrelerin tüm çekirdeklerdeki oranı doku tipine göre ve her biri 10 belirteç ayrı ayrı olarak nicelendirildi (Şekil 6D). Bu çıktı, çoklu doku veri seti içindeki birden fazla doku tipi arasında biyobelirteç tanımlı hücre popülasyonlarının nicel karşılaştırmasını mümkün kılar. Analiz boru hattı tek hücre seviyesinde çalışsa da, mevcut veri seti öncelikle popülasyon düzeyindeki dağılımlar kullanılarak sunulmaktadır. Bu veri setindeki nispeten düşük p16-pozitif hücre bolluğu, p16 ile Lamin B1 arasında hücre hücre sağlam korelasyon analizi için istatistiksel gücü sınırlayabilir ve bu nedenle bu tür ilişkiler temkinli yorumlanmalıdır.

figure-results-1
Şekil 1: Tam çoklu immünfloresan iş akışını gösteren şema. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Çoklu görüntülemenin genel görünümü: (A-B): Sanal H& Otomatik slayt boyacı veya manuel slayt hazırlama süreçleriyle hazırlanan slaytların doku bütünlüğünü görselleştirmek için DAPI boyama ve Cy3 otofloresansından üretilen 1. tur Cy3 otofloresansından üretilen E görüntüleri. (C-D): Tüm biyobelirteçlerin çoklu IF boyaması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Eser türlerine örnekler: Esas olarak slayt hazırlığı sırasında üretilebilen farklı tür eserlerin temsil edici örnekleri. Kısmi doku ayrılması, odak dışı bölgeler olarak gözlemlenebilir ve sonraki turlarda doku hizasında sorunlara yol açabilir. Eksik çekirdekler deneysel gücü azaltır ve genellikle hassas doku tiplerinde orantısız şekilde gerçekleşir. Kaymış veya üst üste düşen çekirdekler, bir çekirdek TMA üzerindeki konumundan ayrılıp başka bir bölgeye yapıştığında ortaya çıkar; bu da gizli çekirdeği analiz etmeyi zorlaştırarak örnek kaybını artırır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: BOND otoboyaıcı ile manuel slayt hazırlama floresan sinyalinin karşılaştırılması: (A): Yapısal belirteçler pan sitokeratin (PANCK), CD31 ve alfa düz kas aktini (aSMA) için temsil IF boyama. Bu üç görselin birleşimi ilk sütunda gösterilmiştir. (B): Digital Pathology Software ikili sınıflandırma analiz maskeleri, farklı hücre tiplerinde pozitif belirtici tespit edilir: CD31 (kırmızı), FOXP3 (turkuaz), Ki67 (sarı), CD8 (beyaz), PANCK (yeşil). Beyaz kutu, alt panellerde dijital yakınlaştırma bölgesini gösterir. (C): Hücre popülasyonlarında biyobelirteç yoğunluğunun doku hazırlama yöntemi (otomatik bir slayt boyacı = kırmızı, manuel = mavi) ve belirtici pozitifliği (koyu = negatif, ışık = pozitif) ile gruplandırılması. Her yoğunluk grafikinin altındaki alan, analiz edilen hücre popülasyonunun %100'ünü temsil eder. AF = Otofloresans. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tam çoklu panel: Ek dokusundan temsil eden görüntülerde A-B: tam 10-plex IF paneli C: PANCK (yeşil), D: CD31 (kırmızı), E:aSMA (sarı), F: K15 (pembe), G: Vimentin (beyaz), H: Lamin B1 (turkuaz), I:p16 (altın), J: Ki67 (parlak sarı), K: CD8 (parlak yeşil) ve L: FOXP3 (mor). Beyaz kutu = dijital zoom (Merge, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, s16), kesik kutu = dijital zoom (Ki67, CD8, FOXP3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Yaşlanma belirteci tespiti: (A): Pankreas dokusu görüntülerinden elde edilen temsil IF ile Lamin B1 (turkuaz) ve p16 (altın) ile diğer işaretleyiciler PANCK (yeşil), CD31 (kırmızı) ve Vimentin (beyaz) ile mekansal ilişki gösteriliyor. (B): P16 pozitif ve negatif hücre popülasyonlarında Lamin B1 (LB1) çekirdeği yoğunluğunun nicelendirilmesi. (C): Lamin B1 (LB1) pozitif ve negatif hücre popülasyonlarında p16 hücre yoğunluğunun nicelenmesi. Yoğunluk alanı, eğri altındaki alan, nüfusun %100'ünü temsil eder. (D): Her biyobelirteç veya yaşlanma fenotipi (p16+/LB1-ve) için ortalama çekirdek yüzdesi pozitifliğinin Z-skoru normalize ısı haritası, doku tipleri arasında geçerlidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Otomatik platformlar aracılığıyla multipleks IF görüntüleme, tek doku bölümlerinde büyük bir biyobelirteç panelinin incelikli profillerinin oluşturulmasını^{kolaylaştırır 13}. HALO gibi dijital patoloji yazılımlarıyla eşleştirildiğinde, hücre tiplerinin birbirine göre hem bolluğu hem de mekansal ilişkileri ve farklı doku yapıları arasında dağılımlarının sorgulanmasına^{olanak tanır 3}. Bu, yaşlanma alanına önemli bir değer katma potansiyeline sahiptir; çünkü bu alan, yaşlanan hücrelerin sağlam sınıflandırılması için özelliklerin profilleme kombinasyonlarına dayanır; bu alanların da önemli heterojenliğe sahip olduğu kanıtlanmış ve bu nedenle ardışık doku^{kesitleri 14} ile mümkün olmayan tek hedef hücre profilleme gerektirir. Ayrıca, yaşlanma hücre yükü dokular arasında değişir, yaşlanma sırasında farklı hızlarda birikebilir ve yaşlanmanın güvenilir in vivo belirteçleri eksikliği vardır; bu da daha büyük bir biyobelirteç panelinin yeni bağlamlarda daha fazla esneklik gerektirebileceği durumlarda tercih edilir ^5,15,16. Önemli olarak, önceki çalışmalar, yaşlanan hücrelerin birikimi ve zaman dinamiklerinin dokuya büyük ölçüde bağımlı olduğunu, organ sistemleri arasında hem bolluk hem de başlangıçta önemli farklılıklar olduğunu göstermiştir; bu da yaşlanmanın dokular arasında eşzamanlı gerçekleşmediğini göstermiştir. Mekansal transkriptomik veya görüntüleme kütle sitometrisi gibi alternatif mekansal profilleme teknikleri, tamamlayıcı moleküler bilgi sağlayabilir; Ancak, çoklu immünoflüoresans doğrudan protein ekspresyonunu ölçür ve sağlam doku kesitleri içindeki hücre fenotiplerinin yüksek çözünürlüklü mekansal analizini sağlar. Çoklu IF'nin ardışık doğası, aynı zamanda yinelemeli bir keşif boru hattına da olanak tanır.

Çoklu IF görüntüleme, yüksek verimli iş akışlarında otomatik bir sürgü boyama ile entegre edilerek gerçekleştirilebilir. Standartlaştırma açısından önemli avantajlar sağlamanın yanı sıra, otomatik slayt hazırlama, manuel ve decloaking odası tabanlı yaklaşıma göre daha az artefakt elde ettiği ve daha az doku ayrılması ve kaybedilen çekirdeklerin gözlemlendiği için ortaya çıkmıştır. Ancak, bu gözlemler niteliksel karşılaştırmaya dayanır ve işleme kaynaklı doku hasarındaki farklılıkları resmen belirlemek için daha fazla nicel değerlendirme gereklidir. Bu, cilt ve meme gibi yağlı doku tiplerinde özellikle bir endişe kaynağıdır. Ayrıca, Coverslipless Slide Holder sistemi, robotik plaka taşıyıcılarıyla entegrasyon sağlar; böylece daha yüksek verimlilik sağlar ve gece boyunca görüntüleme gibi iş akışı iyileştirmelerini kolaylaştırarak operatör süresini azaltır. Otomasyonun verimliliği ve standartlaşmayı artırması beklense de, bu iyileştirmelerin nicel kıyısıyla bu çalışmada resmi olarak değerlendirilmedi ve ölçülü bir sonuç yerine pratik bir gözlem olarak yorumlanmalıdır. Örnekler doku mikrodizileri olarak hazırlandığında, nispeten az sayıda slayt üzerinde yüzlerce hasta örneği için kapsamlı analizlerin oluşturulması mümkün hale gelir; bu da klinik doku örneklerinde yaşlanan hücreleri inceleyen gelecekteki çalışmaları^{kolaylaştırabilir.}

Manuel kaydırma hazırlama sürecinde otomatik sürgü boyaıcısı kullanılarak işaretleyici yoğunluklarında hafif artışlar gözlemlenmiş olsa da, pratikte bu avantaj çok küçüktür; düşük sinyal genellikle daha uzun pozlama süreleri veya analiz eşiklerinde ayarlamalar kullanılarak aşılabilir. Antikor optimizasyonu, çoklu panel tasarımı ve görüntüleme parametrelerinin seçimi gibi birkaç temel adım, analiz başarısını kritik şekilde etkiler. Antikor uyumluluğunun, sinyal yoğunluğunun ve tekrarlanan boyama döngülerine karşı direncin dikkatlice doğrulanması, tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli çoklu veri sağlamak için gereklidir. Çok daha önemli olan, biyolojik belirteçlerin tur optimizasyonu ve kanal seçimidir. Bunlar, test örneklerinde bireysel veya kombinasyon halinde değerlendirilir; böylece antikorlar arasında çapraz reaktivite eksikliği sağlanır ve istenen turlarda boya inaktivasyonu ile epitop tespit edilebilir olduğu gösterilir. Genellikle daha düşük otofloresans gösteren Cy5 ve Cy7 kanallarında zayıf veya daha az bol belirteçlerin kullanılması önerilir. Son panel, ilgi duyduğu doku tipinde test edilir; çünkü yaygın olarak kullanılan bazı optimizasyon dokuları (örneğin bademcik), deneysel ortamlara göre genellikle daha düşük konsantrasyon ve maruz kalma süreleri gerektirir; bu da otofloresans gibi özelliklerde farklılık gösterebilir. Ancak, deneysel dokularda hücre tipi varlığı belirsiz olduğunda, sinyal eksikliği hedef hücrelerin yokluğundan kolayca ayırt edilemez olduğunda, bu tür pozitif kontrol dokuları faydalı olabilir. Hedef doku tipi içindeki bu panel optimizasyonlarında özenle yapılması, başarılı bir testin sağlanması için en kritik deneysel adımdır ve son deneysel çalışmalardan kaynaklanan biyobelirteç kaybını en aza indirmektir. Sorunların çoğu, antikorların çapraz reaksiyonu, düşük antikor konsantrasyonları nedeniyle yetersiz sinyal veya FITC/Cy3 kanallarında düşük sinyal-gürültü nedeniyle ortaya çıkar. Ayrıca, tekrarlanan boya inaktivasyon adımlarında antijen koruması hem antikor hem de doku bağımlısıdır; bu da deneysel örnekler için uygun panel/yuvarlak bileşimlerin seçilmesini sağlamak amacıyla kapsamlı optimizasyon adımlarının kullanılmasını gerektirir. Çoklu immünoflüoresans iş akışlarının temel sınırlamalarından biri, yüksek kaliteli antikorlara bağımlılık ve epitopların tekrar eden boyama ve boya inaktivasyon döngülerinde stabilitesidir.

Genel olarak, çoklu görüntüleme ve otomasyon platformları ile birleşerek, in vivo doku örneklerinin IF değerlendirmesinde bir aşamalı gelişmeyi temsil eder ve tek hücre düzeyinde karmaşık biyobelirteç panellerinin kapsamlı mekansal analizini kolaylaştırır. Bu iş akışının gelecekteki uygulamaları arasında, çeşitli doku tipleri boyunca yaşlanmaya bağlı biyobelirteçlerin büyük ölçekli profillenmesi ve karmaşık doku ortamlarında hücresel heterojenliği daha da çözmek için yeni uzamsal omik yaklaşımlarla entegrasyon yer almaktadır.

Açıklamalar

CLB, Senisca, StarkAge ve AKLRD için danışmanlık yapmıştır. CLB'nin laboratuvarı ValiRx'ten finansman aldı.

Yazarın katkısı:

RW, LG ve CLB ilk konsepti geliştirdi. RW, FM, MGC, LG ve CLB konsepti tamamladı, deneyler geliştirdi ve tasarladı. RW, FM, MGC ve LG tüm deneyleri gerçekleştirdi. RW ve CLB, tüm yazarların gönderim öncesinde makalenin revizyonlarına katkıda bulunmasıyla ilk taslağı yazdı. Tüm yazarlar nihai makaleyi okuyup onayladı.

Teşekkürler

CLB, FM ve MGC için BBSRC'den (sırasıyla BB/T008709/1 ve BB/W510427/1) ve Wellcome Trust'tan Cell DIVE'ın satın alınmasını (223803/Z/21/Z) kabul etmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
30% Hydrogen Peroxide (H₂O₂)	Merck	H1009
Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1)	Vector Labs.	H-3300	Prepare with 12.5 ml Antigen Unmasking Solution + 237.5 ml ddH2O
Antigen unmasking solution 2 (ARS2)	Sigma	T6066 / E5134	Prepare 10x stock (12.9 g Trizma base, 3.7 g EDTA, 5 mL Tween 20, 995 mL ddH20).
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A2153
Bulk Dewaxing Solution	Leica	AR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)	Leica	AR9961
Bulk Epitope Retrieval (ER2)	Leica	AR9640
Bulk Wash Solution	Leica	AR9590
DAPI	Merck	D3571
Doubled distilled water (ddH₂0)	N/A	N/A
DMSO	Merck	472301
Donkey Serum	Merck	D9663
EDTA	Merck	E5134
Glycerol	Merck	G5516
NaHCO₃	Merck	S5761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	BP399
Propyl Gallate	Merck	P3130
Sodium Bicarbonate	Merck	S5761
Triton X 100	Merck	H5141
Trizma Base	Merck	T6066
Tween20	Merck	P1379
Diğer sarf malzemeleri veya Ekipmanlar
Decloaking chamber	BioCare	DC2012
Steam strips	BioCare	613QC
Bond RXm Auto Slide Stainer	Leica	HIS2330	Referred to as automated slide stainer
Cell DIVE	Leica	29429159	Referred to as multiplex fluorescence imaging system
Click Well slide holders	Leica	29463259	Referred to as Well Coverslipless Slide Holder
Antikor Listesi
CD31 (Pecam-1)	Cell Signalling	61255	Clone: 89C2 Fluorophore: AF555 Dilution: 1 in 50
CD8a	BioLegend	372906	Clone: C8/144B Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 100
CDKN2A/p16	Santa Cruz	sc-56330 AF647	Clone: jc8 Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 200
FOXP3	BioLegend	320114	Clone: 206D Fluorophore: Alexa 647 Dilution: 1 in 50
Keratin 15	Abcam	ab194065	Clone: EPR1614Y Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 200
Ki67	Abcam	ab215226	Clone: EPR3610 Fluorophore: AF555 Dilution: 1 in 50
Lamin B1	Abcam	ab194106	Clone: EPR8985(B) Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 100
PanCK_AE1/AE3	Thermofisher	53-9003-82	Clone: AE1/AE3 Fluorophore: AF_488 Dilution: 1 in 100
SMA	R&D systems	IC1420S	Clone: 1A4 Fluorophore: Alexa 750 Dilution: 1 in 100
Vimentin	Cell Signalling	69227	Clone: D21H3 Fluorophore: Alexa 750 Dilution: 1 in 100

Kaynaklar

Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a Path Forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends Cell Biol. 28 (6), 436-453 (2018).
De Souza, N., Zhao, S., Bodenmiller, B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 24 (3), 171-191 (2024).
Teo, Y. V., et al. Notch signaling mediates secondary senescence. Cell Rep. 27 (3), 997-1007 (2019).
Ogrodnik, M., et al. Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo. Cell. 187 (16), 4150-4175 (2024).
Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
Schürch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359.e19 (2020).
Lin, J. R., et al. Highly multiplexed immunofluorescence imaging of human tissues and tumors using t-CyCIF and conventional optical microscopes. eLife. 7, e31657(2018).
Tomimatsu, K., et al. Precise immunofluorescence cancelling for highly multiplexed imaging to capture specific cell states. Nat Commun. 15, 3657(2024).
Kiessling, P., Kuppe, C. Spatial multi-omics: novel tools to study the complexity of cardiovascular diseases. Genome Med. 16 (1), 14(2024).
Chaib, S., Tchkonia, T., Kirkland, J. L. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 28, 1556(2022).
Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M., Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 23 (11), 2066-2075 (2012).
Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
Wallis, R., et al. Senescence-associated morphological profiles (SAMPs): an image-based phenotypic profiling method for evaluating inter- and intra-model heterogeneity of senescence. Aging (Albany NY). 14, 1-27 (2022).
González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. FEBS J. 288 (1), 56-80 (2021).
O’Sullivan, E. A., Wallis, R., Mossa, F., Bishop, C. L. The paradox of senescent-marker positive cancer cells: challenges and opportunities. NPJ Aging. 10 (1), 1-11 (2024).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biyoloji Sayı 233 Sayı 233 Boş Değer Sayı Multiplex görüntüleme Döngüsel immünofloresan İteratif immünolabelleme ve kimyasal ağartma Tüm slayt görüntüleme Uzamsal biyoloji Dijital Patoloji Otomatik boyama cihazı Robotik Entegrasyon Cell DIVE HALO BOND RXm

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi