Yöntem makalesi

Fare Kortikal Dokusundan Perisitlerin Tek Hücreli Dizileme için FACS Kullanılarak İzolasyonu

DOI:

10.3791/69749

⸱

30 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2International Center of Microvascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare beyni kortikal perisitlerini elde etmek için, CD13⁺/CD31⁻ seçimine dayalı kritik optimize edilmiş bir FACS protokolü sunuyoruz. Ana iyileştirmelerimiz, hücre canlılığını ve RNA bütünlüğünü önemli ölçüde artırır ve güvenilir transkriptomik profilleme imkanı sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perisitler, nörovasküler birimin temel bir bileşeni olarak, kan-beyin bariyerinin bütünlüğünü korumada ve mikrovasküler tonun modülasyonu yoluyla beyin hemodinamik homeostazın düzenlenmesinde hayati bir rol oynar. Perisitlerin işlev bozukluğu, çeşitli nörolojik bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Perisitlerin heterojenliğini araştırmak ve tek hücre çözünürlükte nörovasküler hastalıklarda mekanizmalarını açıklamak için, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) için uygun fare beyin perisitlerini izole etmek için optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir protokol oluşturduk. Bu yöntem, yerleşik CD13+/CD31 sıralama stratejisinin üzerine inşa edilir, ancak scRNA-seq uygulamaları için özel olarak tasarlanmış temel geliştirmeleri içerir. Kısa bir süreliğine, üç yetişkin C57BL/6 faresinden beyin alındı. Beyin dokuları mekanik olarak ayrılarak enzimatik sindirime tabi tutularak tek hücreli süspansiyonlar elde edildi. Ardışık santrifüjlemeden sonra, son hücre pelleti %20 sığır serum albümini (BSA) çözeltisine yeniden süspansiyona getirildi; bu, stres ve agregasyonu en aza indirmek için tanıttığımız kritik bir adımdı; böylece dizileme için canlılık ve RNA kalitesini en üst düzeye çıkardık. Bu optimize edilmiş FACS tabanlı yaklaşım, scRNA-seq için sıkı gereksinimleri karşılayan canlı fare beyin perisitlerinin sağlam izolasyonunu sağlar ve perisit heterojenliğini ve nörovastik hastalıklarda patolojik rollerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perisitler, genellikle kapiller bazaz zarının içinde gömülü ve endotel hücrelerini kaplayan mikrodamarlar boyunca yer alan önemli bir hücretürüdür 1. Beyinde, perisitler, endotel hücreleri, astrositler ve diğer hücre tipleriyle birlikte nörovasküler birimi oluşturur ve kan-beyin bariyerinin (BBB) yapısı ve işlevi için ayrılmaz bir yer oluşturur. Perisitler, beyin kan akışının düzenlenmesinde, damar yeniden yapılanmasında ve damar homeostazının korunmasında önemli roller oynar. BBB'nin bütünlüğünü, komşu hücrelerle yakın fiziksel etkileşimler ve parakrin sinyal yoluylakorurlar 2; endotoz ve spesifik taşıyıcı proteinlerin ekspresyonuyla transendotel taşınmasını dinamik olarak düzenler; ve kasılma ve gevşetici aktiviteleriyle beyin hemodinamik stabilitesine katkıdabulunurlar 3. Perisitlerin işlev bozukluğu ve kapsama veya yoğunluklarındaki değişiklikler, damar düzensizliği ve nörolojik eksikliklere yol açabilir; bu da nihayetinde çeşitli nörolojik bozukluklarla ilişkili patolojik değişikliklere yolaçabilir 4. Ancak, perisitlerin doğasında bulunan heterojenliği, daha ileri mekanik çalışmalar için önemli zorluklar yaratmaktadır.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizi) teknolojisinin ilerlemesiyle birlikte, giderek artan sayıda çalışma scRNA-seq'i kullanarak hücresel heterojenliği keşfetmiştir ve hastalıkların patogenezi ile ilerlemesinde önemli hedefleri belirlemiştir. Yaygın olarak kullanılan perisit belirteçleri arasında trombositten köken alan büyüme faktörü reseptörü-beta (PDGFR-β)5, nöron-glial antijen 2 (NG2) ve alfa-smooth kas aktini (α-SMA) bulunur. Ancak, bu belirteçlerin özgüllüğü nispetenzayıftır 6; çünkü aynı anda düz kas hücreleri gibi diğer damar hücrelerini ve oligodendrosit öncü hücreleri gibi sinir öncü hücrelerini etiketleyebilirler; bu da perisitleri diğer beyin hücrelerinden ayırt etmeyi zorlaştırır. Daha sağlam bir alternatif ararken öncekiçalışmalarda 7,8,9,10 serebrovasküler perisitlerde güçlü ve tutarlı ekspresyonuyla tanınan CD13 (Aminopeptidaz N, APN) işaretçisine başvurduk. Çalışmamızda, beyin dokusu kesitlerinde immünoflüoresans boyama yaptık ve sonuçlar perisitlerde CD13 ekspresyonunu doğruladı; bu da perisitleri endotel hücrelerden ayırt etmede etkinliğini gösterdi; çünkü CD13 sinyali yalnızca perivasküler hücrelerle ilişkiliydi ve CD31⁺ endotel hücrelerinde yoktu. (Şekil 1A). Ancak, CD13 ifadesinin tamamen perisitlere özgü olmadığını belirtmek önemlidir; Tespit edilebilir seviyeler arteriol ve venüllerin düz kas hücrelerinde de gözlemlenmektedir (Şekil 1B,C).

figure-introduction-1
Şekil 1: İmmünofluoresans boyama, beyin damar perisitlerinde ve düz kas hücrelerinde CD13 ekspresyonunu gösterir, endotel hücrelerinde ise tespit edilebilir sinyal yoktur. (A) Beyin mikrodamar sistemindeki arteriol-kapiller geçiş bölgesinin temsil immünfloresan görüntülemesi. Birleştirilen görüntü, CD13⁺ perisitlerinin (yeşil) CD31⁺ endotel hücrelerini (kırmızı) örtüldüğünü gösteriyor. α-SMA+ düz kas hücreleri (siyaan) arteriolar bölgede lokalize olup, kapilyarlarda yoktur. (B) Bir arteriolün kesiti. Görüntüler, çevredeki düz kas katmanında CD13⁺ perisit (yeşil) ve α-SMA+ düz kas hücrelerinin (siyanen) net bir yer-lokalizasyonunu göstererek, arteriolar düz kas hücrelerinde CD13 ekspresyonunu doğruluyor. (C) Bir venülün kesiti. Benzer şekilde, CD13 (yeşil) venül duvarın α-SMA düz kas hücrelerinde (ok uçları) tespit edilebilir. Ölçek çubuğu: 20 μm (A-C). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

ScRNA-seq gereksinimlerini karşılayan fare kortikal vasküler perisitleri elde etmek için, perisit izolasyonu11 için CD13⁺/CD31⁻ antikor etiketlemesi kullanarak floresans-aktive hücre sıralaması (FACS) uyguladık. Başlangıçta, beyin dokusu süspansiyonlarından hematopoietik hücreleri dışlamak için CD45 ve CD41 belirteçlerikullanılmıştır 12. Daha sonra, perisitler CD13+ hücreleri seçilerek zenginleştirildi ve endotel hücreleri CD31- popülasyonları için kapalı olarak daha da dışlandı, böylece hedef perisitpopülasyonu 13 izole edildi.

CD13-pozitif seçim adımının eşzamanlı olarak hem arteriollerden hem de venüllerden CD13 eksprese eden düz kas hücrelerini yakalar. scRNA-seq için kritik gereksinimleri karşılamak ve perisit tutumunu maksimize etmek için, bu belirtici kombinasyonunu stratejik olarak seçtik; böylece sıralama aşamasında perisit verimini önceliklendirdik. Bu yaklaşım, küçük bir düz kas hücre popülasyonunun birlikte izolasyonuna yol açsa da, ön zenginleştirme aşamasında tüm potansiyel perisitlerin iyileşmesini etkili bir şekilde en üst düzeye çıkarır. Bu kademeli kapı stratejisi, ilk hücre kaybını önemli ölçüde en aza indirir. Ayrıca, perisitlerin canlılığını ve verimini en üst düzeye çıkarmak için, dissosiyasyon sonrası hücre yeniden süspansiyonu ve filtreleme için %20 BSA çözümü kullandık; böylece parça parçalarını etkili şekilde temizleyip sıralanmış hücre canlılığı ve saflığınıkoruduk.

Bu yöntemi kullanarak, beyin damarları perisitlerini diğer hücre tiplerinden başarıyla ayırt ettik; scRNA-seq için sıkı gereksinimleri karşılayan yüksek saflık ve yüksek canlılıkta perisit preparatları elde ettik. Bu teknik, perisitlerin çeşitli hastalık bağlamlarında rollerine dair sonraki derinlemesine araştırmalar için sağlam bir temel sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, üç yetişkin C57BL/6J faresi (3 aylık, 20-25 g) kullandık. Tüm fareler, 12 saatlik ışık/karanlık döngü altında, sıkı kontrol altında sıcaklık ve nem ile deneylerden önce serbest yiyecek ve suya erişimle tutuldu. Laboratuvar hayvanlarıyla ilgili tüm deneysel işlemler, Mikrosirkülasyon Enstitüsü, Çin Tıp Bilimleri Akademisi ve Pekin Birliği Tıp Fakültesi Laboratuvar Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından onaylandı ve ilgili hayvan refahı yönergelerine sıkı uyum sağladı.

1. Reaktif hazırlığı

  1. %30 (ağırlık/hacim) Glikoz Çözeltisi: 15 g glukozu 50 mL UltraPure DNaz/RNase-free dH2Oiçinde çözüp çöz. Tam çözünmeyi sağlamak için önce 20 mL UltraPure DNase/RNase-free dH 2O'ya glikoz ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 50 mL nihai hacme UltraPure DNaz/RNase içermeyen dH2Oekleyin. Çözeltiyi filtreleyin ve 4 °C'de 6 aya kadar saklayın.
  2. DNaz I (10 mg/mL): 50 mg DNase I'i 5 mL steril ddH2Oiçinde çözün. Stok çözeltisi -20 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.
    NOT: Enzimatik aktivite kaybını önlemek için tekrarlayan donma-çözülme döngülerinden kesinlikle kaçınılmalıdır. Donma-erime etkilerini en aza indirmek için, çözeltinin 150 μL'sini ilk dondurmadan önce steril mikrosantrifüj tüplerine aliquot atın ve deneyler için gerektiğinde bireysel aliquotları eritin.
  3. %2 (hacim/hacim) Fetal Sığır Serumu (FBS) Fosfatla Tamponlu Salinde (PBS): 1× PBS 5 mL 10× PBS ile 45 mL UltraPure DNaz/RNazsızdH 2Okarıştırarak hazırlayın. 1 mL FBS ile 49 mL 1× PBS ekleyin ve iyice karıştırın.
    NOT: Bu çözümü Adım 2.1.2 sırasında taze hazırlayın. Her doku örneği için 15 mL tahsis edin.
  4. Kolajenaz ve dispaz (CD) enzim stok çözeltisi: 100 mg Dispaz ve 100 mg kollajenazı ayrı ayrı 1 mL UltraPure DNaz/RNase-free dH2Oiçinde çözüp çöz. Çözeltileri birleştirerek 2 mL nihai hacim elde edin (100 mg/mL enzim konsantrasyonu).
    NOT: Aliquot 500 μL steril mikrosantrifüj tüplerine alın ve -20 °C'de saklanın. Donma-erime döngülerinden kaynaklanan aktivite kaybını önlemek için kullanımdan önce vortex yapın. Pudra formunun ciddi cilt/göz tahrişi ve solunum sıkıntısına yol açabileceğini belirtmek önemlidir. Her zaman kimyasal bir buhar davlumbastonunda nitril eldiven ve N95 maskesi takarak kullanın. Maruz kalma durumunda, etkilenen bölgeyi hemen bol suyla sulanın ve tıbbi yardım alın.
  5. CD enzim çalışma çözeltisi: 1.5 mL CD enzim stok çözeltisi ile 43.5 mL %2 (vol/hacim) FBS içinde PBS (Adım 1.3'ten) nazik ters çevirme yöntemiyle karıştırın.
    NOT: Doku dissosiyasyonundan hemen önce hazırlanın (Adım 2.3.4). Bu hacim, üç fare için optimize edilmiştir; Gerekirse orantılı olarak ayarlayın.
  6. %22 (hacim/hacim) Percoll çözeltisi: 11 mL Percoll, 5 mL 10× PBS ve 34 mL UltraPure DNase/RNase-free dH2Okarışımı için 50 mL bir çözelti hazırlanır.
    NOT: 0.22 μm PES membrandan filtre-sterilizasyon yapın. 4 °C'de bir ay boyunca önemli bir stabilite kaybı olmadan saklanabilir.
  7. Mekanik dissosiyasyon tamponu: 10 mL DNase I (10 mg/mL) eklenerek PBS'de 10 mL %2 (vol/hacim) FBS (Adım 1.3'ten). Pipetle karıştırın.
  8. BSA çözümleri: 1%, %20 ve %35 (kövş) BSA çözümlerini ayrı ayrı aşağıdaki şekilde hazırlayın:
    1. %1 (ağırlık/hacim) BSA: 0,15 g BSA'yı 15 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Sözü (DPBS) içinde çözür.
    2. %20 (ağırlık/hacim) BSA: 3 g BSA'yı 15 mL DPBS'de çözür.
    3. %35 (ağırlık/hacim) BSA: 2 mL DPBS'de 0.7 g BSA çözün.
      NOT: Tüm çözeltileri kullanmadan önce 0.22 μm PES membranından filtreleyin.
  9. Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)/BSA/Glikoz Tamponu: 50 mL HBSS'ye 167 μL %30 (k/hacim) (Adım 1.1'den) ve %35 (hacim/hacim) 1.4 mL (Seviye/hacim) BSA (Adım 1.8'den) 50 mL HBSS ekleyin, nazikçe karıştırın.
    NOT: Bu çözeltiyi 2.1.2. adım sırasında taze steril koşullarda hazırlayın. Kullanıma kadar 4 °C'de saklanın.
  10. Doku Toplama Tamponu: 12 mL HBSS/BSA/Glikoz Tamponu (Step 1.9'dan) 800 μL DNase I (10 mg/mL) takviyesi ekleyin. Geçici doku depolama ve pipet durulama için kullanım.
    NOT: Bu çözeltiyi 2.1.2. adım sırasında taze steril koşullarda hazırlayın.
  11. %1,25 (w/v) Tribromoetanol Çözeltisi: 1,25 g 2,2,2-Tribromoetanol 2,5 ml 2-Metil-2-butanolde çözün, ardından bu karışımı 97,5 ml steril ddH2Oveya fizyolojik tuzlu suyla birleştirerek berrak %1,25 Tribromoetanol Çözeltisi elde edin.
    NOT: Her kullanımdan önce çözeltiyi taze hazırlayın. Oda sıcaklığında ışıktan korunur ve hemen kullanın.

2. Deneysel Prosedür (örnek olarak üç fare kullanılarak)

  1. Deney öncesi hazırlık (Zamanlama: 30 dakika)
    1. Otoklav, %75 (vol/vol) etanol içeren cerrahi aletleri dezenfekte etmek ve tüketim malzemeleri gerektiriyordu.
    2. Çalışma çözeltileri hazırlayın: 1× PBS (Adım 1.3'ten), %2 (hacim/hacim) FBS (Adım 1.3'ten itibaren), HBSS/BSA/glikoz çözeltisi (Adım 1.9'dan) ve doku toplama tamponu (Adım 1.10'dan itibaren).
    3. 10 mL 1× PBS'yi 10 cm hücreli bir klüter kabına dökün ve buzun üzerinde tutun.
    4. Üç ampul hazırlayın, her birine 3 mL doku toplama tamponu ekleyin ve buzun üzerinde kalın.
    5. Üç adet 15 mL santrifüj tüpü hazırlayın, her birine 10 mL %2 (vol/hacim) FBS PBS ekleyin ve buzun üzerinde kalın.
  2. Fare beyni toplama (Zamanlama: 30 dakika)
    1. Fareler, 10 g vücut ağırlığı başına 0,2 mL dozda intraperitoneal tribromoetanol enjeksiyonuyla (Step 1.11'den itibaren) derin bir anestezi edildi. Pedal reflekslerinin kaybından sonra, ötenazi servikal dislokasyon yoluyla gerçekleştirildi.
      NOT: Eğer fare, enjeksiyondan sonra 5-10 dakika içinde pedal yoksunluk refleksinin olmaması ile ölçülen cerrahi anestezi düzlemine ulaşmadıysa, başlangıç dozunun üçte birine eşit olan ekstra intraperitoneal tribromoetanol dozu uygulandı.
    2. Baş/boyun bölgesine %75 etanol spreyleyin. Kafatasını açmak için oksipital bölgeden frontal bölgeye orta hat saç kesisi yapın. İki taraflı orbitaların önünde enine kesi yapılması ve ardından beyincik alt kenarları boyunca yan kesiler yapılarak kafatası tabanını ayırmak. Son olarak, kalvaryumu sagital dikiş boyunca arkadan öne doğru uzunlamasına kesin. Kranial kapağı kaldırarak dura kapalı beyni ortaya çıkarın. Optik sinirleri ve medulla oblongata-omurilik bağlantısını cerrahi makasla keserken beyni nazikçeyükseltin 15. Sağlam beyni, içinde 10 mL buz gibi 1× PBS içeren 10 cm'lik bir kaba yerleştirin.
      NOT: Hasarı önlemek için dokuyu nazikçe tutun.
    3. Beyni alüminyum folyoya aktarın. Forseps kullanarak, dura mater'i kenarlardan kaldırın ve orta hattı sulkusu boyunca kesin. Dura tamamen çıkarıldıktan sonra, subaraknoid boşluğu açığa çıkarın. Subaraknoid boşluğu HBSS çözeltisiyle durulayın, ardından küt bir iğne ile damarları disekiye edin ve piamater 16'yı dikkatlice çıkarın. Beyni jilet bıçağıyla koronal olarak 2-3 mm kalınlığında dilimlere ayırın. Koku soğanını ve en kuyak kısmını at. Beyin korteksini korpus kallozum boyunca izole edin ve kortikal dokuyu 3 mL buz soğukluğu dokusu toplamatamponu 11 içeren ampullara aktarın.
    4. Bu protokolteki perisit izolasyonu özellikle beyin korteksini hedef alır. İlgi çekici diğer bölgeler için: Koronal kesitleri iki kuyulu bir kaydırmada, PBS'de %2 (vol/hacim) FBS bir damla yerleştirin. Hedef bölgeleri diseksiyon mikroskopisi altında belirleyin, manuel izole edin ve aynı sonraki işlem adımlarına devam edin.
  3. Doku dissosiyasyonu (Zamanlama: 3-3,5 saat)
    1. Cerrahi skalpellerle ampullerde yaklaşık 1 mm × 1 mm boyutunda parçalara kıyır.
      NOT: Doku tazeliğini korumak için 5 dakika içinde tam doğran.
    2. Pipet uçlarını doku toplama tamponuyla önceden durulayın. Kıyılmış parçaları yavaşça uç noktasına doğru aspire ederek dikey yönü (ucu aşağıya doğru) koruyun. Parçaları önceden soğutulmuş 15 mL santrifüj tüplerine (Adım 2.1.5'te hazırlanmış) nazikçe dışarı atın.
      NOT: Pipet duvarına yapışmasını önlemek için parçaları üst namluya üflemekten kaçının.
    3. Parça içeren ampulleri (Adım 2.3.1'den) PBS içinde %2 (vol/hacim) FBS ile yıkayın ve yıkamayı santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüj 300 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca kullanın.
    4. Santrifüjleme sonrası süpernatanları atın. Peletleri tüp başına 3 mL CD enzimi çalışma çözeltisiyle (Adım 1.5'ten itibaren) yeniden süzülür. Her süspansiyonu eşit olarak üç tüpe (toplam 9 tüp, 1 mL/tüp) alarak birleştirin, ardından 4 mL CD enzim çalışma çözeltisi ile takviye edin (son hacim: 5 mL/tüp).
    5. Tüpleri 37 °C hibridizasyon fırınında 100 dakika boyunca kuluçka edin, 100 x g14 derecesinde yörünge sallanma ile yapılsın.
    6. İnkubasyon sırasında 10 mL DNase I çözeltisi ekleyerek PBS'de (Adım 1.10'dan itibaren) %2 (vol/hacim) FBS'ye 1 mL DNase I çözeltisi ekleyin.
    7. Sindirimi 300 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjle sonlandırın.
      NOT: 10-20 μL aliquot kullanarak sindirim verimliliğini mikroskobik olarak değerlendirin. İdeal uç nokta, boncuk benzeri damar parçaları olarak ortaya çıkar; Uzun damar segmentleri yetersiz sindirimi gösterirken, baskın tek hücreler aşırı sindirimi işaret eder.
    8. Peletleri tüp başına 1 mL doku dissosiyasyon çözeltisiyle yeniden süzülür. Mekanik olarak pipetle 100 kez11 kez dissosiyasyon yapın.
      NOT: Baloncuk oluşumunu en aza indirmek ve hücre canlılığını korumak için tam pipet hacmi aspirasyonundan kaçının.
    9. Tüm süspansiyonları (toplam 9 sindirim tüpünden, 3 farenin beyin dokularını temsil ediyor) 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne biriktirin. Her sindirim tüpünü 2 mL %2 (vol/vol) FBS ile PBS ve kombine yıkamalarıyla durulayın. Santrifüj 300 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca kullanın.
    10. Santrifüjlemeden sonra belirgin katmanlar görünür. En üst tabakayı (safsızlıklar ve küçük hücresel kalıntılar içeren) dikkatlice atarak, ara tabakayı (daha düşük yoğunluklu hücreler veya hücre kümelerinden oluşan) ve alt tabakayı (sağlam hücreler ve kısmen sindirilmemiş doku parçaları) korun. 12,5 mL %20 BSA çözeltisi ekleyin ve tüpü nazikçe ters çevirerek peletleri yeniden süspansiyona alın. Tekrar 1000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın.
    11. Alt pelleti (sağlam hücrelerle zenginleştirilmiş ve daha yüksek saflıkta) toplayın ve süpernatantı (özellikle miyelin kalıntıları, lipidler ve az sayıda hücre içeren) yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Nazik ters çevirme ile tekrar askı yapın ve 1.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın.
    12. İki santrifüj aşamasından (adım 2.3.10 ve Adım 2.3.11) elde edilen her peleti 2 mL %2 (hacim/hacim) FBS'ye PBS içinde yeniden askıya alın (nihai birleşik hacim: 4 mL).
      NOT: Yeniden askı sırasında tüp duvarlarına dokunmaktan kaçının, böylece enkaz kirliliğini en aza indirin.
    13. Önceki aşamadaki iki yeniden süspansiyonu birleştirerek 15 mL'lik bir santrifüj tüpünü oluşturun. Santrifüj 300 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Süpernatantı (BSA, hücre döküntüleri ve potansiyel olarak iz miktarda kalıntı miyelin lipidleri içeren atık tamponu) atın. Pelleti (son saflaştırılmış ve yıkanmış, yüksek saflıkta sağlam hedef hücreler) %2 FBS içeren 2 mL PBS çözeltisine yeniden süzülün.
      NOT: Bu adım, hücrelerin aşağı akış uygulamaları için temiz ve uygun bir süspansiyon tamponuna aktarılmasıdır.
    14. Her biri 4 mL %22 Percoll çözeltisi içeren dört adet 15 mL santrifüj tüpü hazırlayın. Hücre verimini maksimize etmek için Percoll gradyanına (toplam dört aliquot) 0,5 mL resüspansiyon alikotunu nazikçe katmanlayın. 560 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Santrifüjü "frensiz" konumuna ayarlayın, böylece yoğunluk gradyanının girdap kaynaklı bozulmasını önleyin, böylece miyelin kalıntılarının süpernatantta stabil kalmasını sağlar.
    15. Süpernatantları dikkatlice aspire edin. Peletleri tüp başına 1 mL HBSS/BSA/glikoz tamponunda yeniden askıya alın. Havuz süspansiyonları yeni 15 mL bir tüpe bağlandı. Percoll tüplerini 2 mL HBSS/BSA/glikoz tamponu ile durulayın ve kombine yıkamaları yapın. Santrifüj 300 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca pişirin.
  4. Akış sitometrisi sıralama hazırlığı ve edinimi (Zamanlama: 50 dakika)
    1. Süpernatantı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 1 mL HBSS/BSA/glikoz tamponunda yeniden askıya alın.
    2. Hücre süspansiyonuna 5 μL Fc reseptörü (FcR) engelleyici reaktif ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
    3. Aşağıdaki floresan konjuge antikorları hücre süspansiyonuna belirtilen hacimlerde ekleyin (3 fareden elde edilen doku için yeterli olan): 5 μL CD45-PE; 5 μL CD41-PE; 20 μL CD31-APC; 15 μL CD13-FITC.
    4. Hücreleri karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka yapın.
      NOT: Işığa karşı koruyun. Karıştırmaktan kaçının.
    5. Hücreleri yıkamak için 6 mL HBSS/BSA/glikoz tamponu ekleyin. Santrifüj 300 x g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca kullanın.
    6. Üst natantı aspire edin. Hücre peletini 1 mL HBSS/BSA/glikoz tamponunda yeniden askıya alın. 200 μL 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) çözeltisi ekleyin (ölü hücreleri dışlamak için) ve 10 dakika boyunca buzda kuluçka yapın. Daha sonra HBSS/BSA/glikoz tamponu ile hacmi 2 mL'ye ayarlayın.
      NOT: Işığa karşı koruyun.
    7. Toplama tüplerine (15 mL konik tüpler) %1 BSA çözeltisi ekleyin, iç yüzeyleri nazikçe durulamak için döndürün. Fazla çözeltiyi aspire edin, her tüpte tam olarak 1 mL %1 BSA çözeltisi bırakarak sıralanmış hücreleri alın. Geçici olarak buzda sakla.
    8. Boyalı hücre süspansiyonunu ayırmadan hemen önce 40 μm süzgeçten geçirin.
    9. Düşük FSC-A/SSC-A sinyalleri gösteren hücresel enkaz maddelerini dışlamak için ileri saçılma (FSC-A) ve yan saçılma (SSC-A) parametrelerine dayalı bir başlangıç kapısı oluşturulur.
    10. Hematopoietik soy hücrelerinin tükenmesi, CD45 ve CD41 için çift negatif kapı ile sağlandı ve lökositlerden, bağışıklık hücrelerinden ve trombositlerden gelen kontaminasyonu etkili bir şekilde ortadan kaldırdı.
    11. Vasküler duvar hücrelerinden CD13-pozitif seçilimle muhtemel perisitleri yakalamak.
    12. 7-AAD floresan problama ile membran bütünlüğünü değerlendirmek; 7-AAD⁻ gating ile apoptotik hücreleri dışlar.
      NOT: CD31⁻/CD13⁺ perisitlerini CD31-negatif seçimiyle toplayın. Sıralanmış perisitleri doğrudan %1 BSA içeren tüplere (Adım 2.4.7'den itibaren) toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Hemen tek hücreli süspansiyonları sayım için hazırlayın. Sonra örnekleri doğrudan dizileme için yükleyin, ara kültür adımları olmadan.
  5. scRNA dizisi ve analizi (Tming: 3-4 gün)
    1. Sıralanmış perisitlerin tek hücreli süspansiyonları, 10x Genomics'in protokolüne uygun olarak hazırlanmıştır: "GEM-X Universal 3' Gen İfasyonu v4 4-plex Reaktif Kitleri Kullanıcı Rehberi" (CG000731)17,18. Yükleme için hazırlanan hücre süspansiyonu %90 > kullanılabilirliğe sahipti ve önerilen 300-2000 hücre/μL aralığında seyreltildi.
    2. Tek hücreli süspansiyonu barkodlu jel boncuklar ve enzimlerle birleştirin, ardından mikrofluidik damla kapsülasyonu19 ile Jel-in-Emülsiyon (GEM) olarak bölebilirsiniz. Yerinde hücre lizisi, ters transkripsiyon ve barkod-cDNA bağlantısı uygulanır.
    3. Ürünleri geri kazanmak için GEM'leri kırın. PCR ile cDNA'yı aşağıdaki protokolle amplifikasyon: 9 °C'de 4 saniye boyunca ilk denatürasyon; ardından döngü (<500 hedef hücre için 13 döngü, 501-6000 hedef hücre için 12 döngü) oluşur; bunlar 9 °C'de 2 saniye denatürasyon, 3 saniye 9 °C'de tavlama ve 6 saniye boyunca 7 °C'de uzatma içerir; ve 72 °C'de 1 dakika boyunca son uzatma ve ardından 4 °C'de bekleme yapıldı. Amplifikasyonlu ürünleri parça boyutu (200-300 bp) ve verim açısından doğrulayın.
      NOT: Amplifikasyon ürünleri 4 °C'de 72 saate kadar veya -2 °C'de bir hafta boyunca saklanabilir veya bir sonraki adımda doğrudan işlenebilirler.
    4. Nitelikli cDNA için: Parçalayın, uç onarımı yapın, P7 adaptörünü bağlayın ve indeks primerleriyle güçlendirin. Dizileme kütüphaneleri oluşturmak için boyut seçimi parçaları.
    5. QC doğrulamasından sonra Illumina NovaSeq platformundaki dizi kütüphaneleri.
    6. Hücre barkodlarını, benzersiz moleküler tanımlayıcıları (UMI'leri) ve RNA dizilerini çıkarmak için demultiplex dizileme verileri. Hizalamak referans genomuna göre okunuyor.
    7. UMI sayılarını nicelikle ölçer, geçerli hücre sayılarını tahmin eder ve bir gen-barkod ifadematrisi 20 oluşturur.
    8. R'deki DoubletFinder paketini (v2.0.6) kullanarak çiftleri çıkarın. Veri kalitesini sağlamak için yapay en yakın komşu tanımlamasına dayanarak tahmin edin.
    9. Ana bileşen analizi (PCA) ve Uniform Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyon (UMAP) boyut küçümsemesi Seurat (v5.0) kullanılarak gerçekleştirilin. Hücre kümelerini tanımlayın ve perisitlere özgü işaretleyici genleri görselleştirerek hücresel kimliği doğrulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin perisitlerinin kesin izolasyonu sağlamak için, beyin dokusundan ayrılan hücreler PE Texas Kırmızı konjuge anti-fare CD41/CD45, FITC ile konjuge edilmiş anti-fare CD13 ve APC ile konjuge anti-fare CD31 ile boyanmış, yüzey belirteçleri ve canlılık tespitini entegre eden çok aşamalı bir sıralama stratejisi oluşturulmuştur (Şekil 2). İleri saçılma (FSC-A) ve yan saçılma (SSC-A) parametrelerine dayalı ilk kapı belirleme, hücresel döküntüleri etkili bir şeki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, fare beyin damar perisitlerinin yüksek verimli izolasyonu için CD13⁺/CD31⁻ çok renkli etiketleme temelinde sistematik olarak optimize edilmiş ve doğrulanmış bir FACSstratejisini tanımlamaktadır 24. Akış sitometri ve sonraki scRNA-seq analizleri, yöntemin perisitleri endotel hücrelerden kesin olarak ayırt ettiğini ve scRNA-seq için canlılık, toplanma oranı, canlı hücre konsantrasyonu ve çekirdekli hücre oranı gibi tüm kritik kalite kontrol ölçütlerini t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 7242222), Hebei Eyaleti İl Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (Hibe No. 203777110D) ve Pekin Birliği Tıp Fakültesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Mikrosirkülasyon Araştırma Enstitüsü (Hibe No. CAMS-IM-2023-02).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fetal Bovine Serum (FBS)GibicolA5669701Alikota alıp -20°C'de saklayın; erimeden sonra 1 haftaya kadar 4°C'de saklanabilir
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)Life Technologies70011-044Hücre yıkama için kullanmadan önce seyreltin
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KGHücre enerji tamponunun hazırlanması için
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA1933-25gHücreleri korur ve yapışmayı önler
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)Gibco14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)Life Technologies14175-095Hücre yıkama ve yeniden süspansiyon için
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977-015Nükleaz içermeyen reaksiyon sistemlerinin hazırlanması için
Collagenase/DispaseSigma-Aldrich11097113001-100mgDokunun sindirimi ve hücre ayrışması için; alikot alıp -20°C'de saklayın
DNaseI(RNase-Free)TIANGENRT411-1500UDNA toplanmasını önler; alikot alıp -20°C'de saklayın
PercollSigma-AldrichP1644-100MLHücre ayırma için; 4°C'de saklayın
FITC Rat Anti-Mouse CD13BD Biosciences558744Floresan konjugat; 1 aya kadar 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262Birkaç ay boyunca 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
PE Rat Anti-Mouse CD41BD Biosciences558040Birkaç ay boyunca 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
PE Rat Anti-Mouse CD45BD Biosciences553081Birkaç ay boyunca 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
FITC Rat IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences552916Floresans kontrolü; 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
APC Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences553932Birkaç ay boyunca 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
PE Rat IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences553989Birkaç ay boyunca 4°C'de ışıktan korunmuş saklayın
RNase AWAY Decontamination ReagentAmbion10328011RNase kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önler
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)BD Pharmingen559925Ölü hücre dışlaması için.
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402-25g1.25% (w/v) Tribromoetanol Çözeltisinin hazırlanması için
2-Methyl-2-butanolPsaitongM20008-500mL1.25% (w/v) Tribromoetanol Çözeltisinin hazırlanması için
C57BL/6 mouseJiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tubeCorning430291
15 mL centrifuge tubeCorning430791
cell cluture dish 100mm×20mmCorning430167
Cell Ranger3.1.0/4.0.0Tek Hücreli Sıralama Veri Analizi Yazılımı
Loupe Cell Browser4.1Hücre Tarayıcı
STAR2.5.1bRNA Hizalama
irlbpy-Ana Bileşen Analizi
tsne0.15Barnes-Hut t-SNE (t-Dağılımlı Stokastik Komşu Gömüleme) Analizi
k-means0.17K-Ortalamalar Kümeleme
graph-based clustering0.17Graf Tabanlı Kümeleme
FastQCv0.11.2Veri Kalite Kontrolü (QC)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Payne, L. B., et al. The pericyte microenvironment during vascular development. Microcirculation. 26 (8), e12554(2019).
  2. Ma, Q., et al. Blood-brain barrier-associated pericytes internalize and clear aggregated amyloid-β42 by LRP1-dependent apolipoprotein E isoform-specific mechanism. Mol Neurodegener. 13 (1), 57(2018).
  3. Mäe, M. A., et al. Single-cell analysis of blood-brain barrier response to pericyte loss. Circ Res. 128 (4), e46-e62 (2021).
  4. Li, P., Fan, H. Pericyte loss in diseases. Cells. 12 (15), 1931(2023).
  5. Oliveira, F., et al. Cultured brain pericytes adopt an immature phenotype and require endothelial cells for expression of canonical markers and ECM genes. Front Cell Neurosci. 17, 1165887(2023).
  6. Yao, Y. Challenges in pericyte research:pericyte-specific and subtype-specific markers. Transl Stroke Res. 13 (6), 863-865 (2022).
  7. Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
  8. Alliot, F., et al. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. J Neurosci Res. 58 (3), 367-378 (1999).
  9. Huang, Y., et al. Isolation, culture, and characterization of primary endothelial cells and pericytes from mouse sciatic nerve. J Neurosci Methods. 416, 110366(2025).
  10. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  11. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nat Protoc. 13 (4), 738-751 (2018).
  12. Eichhorn, T., et al. Expression of tissue factor and platelet/leukocyte markers on extracellular vesicles reflect platelet-leukocyte interaction in severe COVID-19. Int J Mol Sci. 24 (23), 16886(2023).
  13. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. J Chem Neuroanat. 92, 48-60 (2018).
  14. Wu, Q., et al. Epitranscriptomic mechanisms of N6-methyladenosine methylation regulating mammalian hypertension development by determined spontaneously hypertensive rats pericytes. Epigenomics. 11 (12), 1359-1370 (2019).
  15. Mirzadeh, Z., et al. The subventricular zone en-face:wholemount staining and ependymal flow. J. Vis. Exp. (39), e1938(2010).
  16. Zappaterra, M. W., et al. Isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants. J. Vis. Exp. (73), e50333(2013).
  17. Zou, Z., et al. A single-cell transcriptomic atlas of human skin aging. Dev Cell. 56 (3), 383-397.e8 (2021).
  18. Bahl, E., et al. Using deep learning to quantify neuronal activation from single-cell and spatial transcriptomic data. Nat Commun. 15 (1), 779(2024).
  19. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  20. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).
  21. Song, H. W., et al. Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels. Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).
  22. He, L., et al. Analysis of the brain mural cell transcriptome. Sci Rep. 6, 35108(2016).
  23. Stebbins, M. J., et al. Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties. Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).
  24. Crouch, E. E., et al. Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage. J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).
  25. Ruan, J., et al. Screening and identification of muscle pericyte selective markers. Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).
  26. Dias, D. O., et al. Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions. Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).
  27. Thalgott, J. H., et al. Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy. Nat Biomed Eng. , (2025).
  28. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).
  29. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Beyin PerisitleriPerisit zolasyonuFACS S ralamaN rovask ler niteKan Beyin BariyeriCD13 Pozitif H crelerCD31 Negatif H crelerEnzimatik SindirimH cre S spansiyonu

İlgili makaleler