NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 ekseni, sepsis modellerinde makrofaj polarizasyonunu ve iltihabını düzenler

Özet

Bu protokol, klinik örnekleri, kültürlenmiş makrofajları ve cekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) fare modelini entegre ederek NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 ekseninin sepsisteki makrofaj polarizasyonunu ve iltihabını nasıl düzenlediğini inceler; böylece diğer lncRNA aracılı bağışıklık yollarına uyarlanabilecek adım adım rehberlik sağlar.

Özet

Sepsis, konak bağışıklık yanıtının düzensizliği ile karakterize edilir ve dünya çapında ölümlerin önde gelen nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Uzun süredir kodlamayan RNA NEAT1, inflamatuar hastalıklarda rol oynamıştır, ancak sepsis sırasında makrofaj polarizasyonundaki özel rolü tam olarak tanımlanmamıştır. Burada, klinik örnekler, kültürlenmiş makrofajlar ve bir CLP fare modeli boyunca NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 eksenini sistematik olarak inceliyoruz. NEAT1, miR-181a-5p ve HMGB1 arasındaki rekabetçi endojen RNA (ceRNA) etkileşimini doğrulamak için nicel PCR, western blotting, çift lusiferaz raporlayıcı testleri ve RNA pull-down deneyleri kullanılır. İmmünofluoresans, transwell göçü ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick end etiketleme (TUNEL) boyama gibi fonksiyonel testler, makrofaj polarizasyonu, göçü ve apoptozu değerlendirmek için uygulanır. In vivo, CLP modeli, ELISA ve histopatoloji ile birleştiğinde, NEAT1'in etkisinin sitokin profilleri ve organ hasarı üzerindeki etkisini doğrular. NEAT1 ve HMGB1 yükseltilirken, sepsisli hastalarda ve lipopolisakkarit ile uyarılan makrofajlarda miR-181a-5p aşağı regülasyonlu olur. NEAT1'in susturulması, M2 makrofaj polarizasyonunu teşvik eder, pro-inflamatuar sitokinleri azaltır, makrofaj göçünü engeller ve septik farelerde miR-181a-5p/HMGB1 ekseni üzerinden doku hasarını hafifletir. Bildiğimiz kadarıyla, sepsiste lncRNA-mikroRNA-HMGB1 düzenleyici devresini uyumlu klinik, in vitro ve in vivo yaklaşımlarla karakterize eden ilk entegre protokoldür. NEAT1 ile ilgili ceRNA ağlarını potansiyel terapötik stratejiler olarak hedeflemek için metodolojik bir çerçeve sunar.

Giriş

Sepsis, enfeksiyona karşı düzensiz bir konak yanıtı nedeniyle hayatı tehdit eden organ işlev bozukluğu^{olarak tanımlanır.} Klinik yönetimdeki ilerlemelere rağmen, ölüm oranı yüksek olmaya devam etmekte ve bağışıklık dengesizliğinin altında yatan moleküler mekanizmalar tam olarak^{anlaşılmamaktadır 2,3}. Bağışıklık düzenleyiciler arasında, uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), inflamatuar sinyal ve makrofaj fonksiyonunun önemli^{modülatörleri olarak ortaya çıkmıştır 4,5}. NEAT1, nükleer zenginleştirilmiş bol bir transkript, paraspeckles'in yapısal bir bileşenidir ve bağışıklık ile doku hasarı^{yanıtlarıyla ilişkilendirilmiştir 6,7}. Önceki çalışmalar NEAT1'i bağırsak iltihabı, iskemi/reperfüzyon hasarı ve akut solunum sıkıntısı^{sendromu 8,9,10} ile ilişkilendirmiştir.

Sepsis bağlamında, biriken kanıtlar lncRNA'ların makrofaj polarizasyonunu ve inflamatuar sinyalizasyonu düzenlediğini, böylece hastalık ilerlemesini ve sonucunu^{etkilediğini göstermektedir 11,12}. Örneğin, lncRNA'lar KCNQ1OT1 ve SNHG1'in sepsis kaynaklı miyokard hasarını mikroRNA aracılı yollar^13,14 aracılığıyla modüle ettiği bildirilmiştir. Ancak, sepsiste NEAT1'in makrofaj polarizasyonunu miR-181a-5p/HMGB1 ekseni üzerinden düzenleyip düzenlemediği sistematik olarak tanımlanmamıştır. Bu boşluğu gidermek için, hasta kan örneklerini, lipopolisakkarit ile uyarılmış RAW264.7 makrofajlarını ve bir cekal ligasyon ve ponksiyon fare modelini birleştirerek NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1^{eksenini 15,16} sorgulayan bir protokol oluşturduk. Nicel PCR, western blotting, çift lusiferaz raporlayıcı testleri, RNA çekimleri ve makrofaj M1/M2 polarizasyonu, göçü ve apoptozunun fonksiyonel okumalarını kullanarak, bu protokol NEAT1'i sepsisteki makrofaj fonksiyonunun düzenleyicisi olarak tanımlamak ve lncRNA hedefli stratejilerin geliştirilmesini desteklemek için tekrarlanabilir bir deneysel çerçeve^{sağlar 17,18}.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, Hebei Üniversitesi Bağlı Hastanesi Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylandı (Onay No. HDFY-LL-2021-232). Yazılı bilgilendirilmiş onay tüm katılımcılardan veya uygun olduğunda yasal vekillerinden alındı. Tüm hayvan deneyleri, kurumsal yönergeler ve ulusal düzenlemelere uygun olarak yürütüldü ve aynı etik komitesi tarafından onaylandı. Onaylanmış protokol, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) prosedürünün, adenoviral uygulamanın, anestezik rejimin ve insani son noktaların detaylarını belirtmiştir.

Hasta örnek toplama

Sepsisli hastalar, Şubat 2022 ile Temmuz 2024 arasında Hebei Üniversitesi Bağlı Hastanesi'nde prospektif olarak alındı. Dahil etme kriterlerini karşılayan toplam 50 hasta vardı; bunların içinde 26 erkek ve 24 kadın vardı, yaşları 24-69 arasında (ortalama 52,4 ± 10,2 yıl). Sepsis, şüpheli veya doğrulanmış enfeksiyon ile birlikte Ardışık Organ Yetmezliği Değerlendirmesi (SOFA) puanında ≥ 2 puan artış gerektiren Sepsis-3 kriterlerine göre teşhis edildi. Her hasta için, birincil enfeksiyon kaynağı (örneğin akciğer, karın iğnesi, idrar yolu veya kan dolaşımı enfeksiyonu) ve hastalığın şiddeti (sepsis veya septik şok) kaydedildi ve SOFA puanlarının dağılımı özetlenerek hastalık yükünü karakterize etti. Kontrol grubu olarak, enfeksiyon veya sistemik inflamatuar hastalık klinik kanıtı olmayan 39 sağlıklı birey kaydedildi (26-70 yaş arası, 20 erkek ve 19 kadın, ortalama 50,7 ± 11,0 yaş) ve gruplar arasında yaş veya cinsiyet açısından anlamlı fark yoktu.

Sepsisli hastalardan periferik venöz kan, sepsis-spesifik tedaviye başlamadan önce mümkün olduğunda toplanmıştır. Kan (genellikle 5-10 mL) etilen diamintetraasetik asit (EDTA) kaplı tüplere çekilir ve antikoagülant karıştırmak için birkaç kez nazikçe ters çevrilir. Örnekler, toplandıktan yaklaşık 1 saat içinde işlendi. Plazma, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.500 × g santrifüjle elde edildi, etiketlenmiş mikrotüplere alındı ve sonraki sitokin ölçümleri için -80 °C'de saklandı. RNA ve protein ekstraksiyonu için, üreticinin talimatlarına göre aynı örneklerin bir kısmından yoğunluk-gradyan ayırma ortamı kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izole edilmiştir. Hücreler daha sonra PBS'de iki kez yıkanmış, sayılmış ve -80 °C sıcaklıkta hücre pelletleri olarak depolanmıştır.

Hücre kültürü ve transfeksiyon

RAW264.7 fare makrofaj hücreleri, %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş, %5 CO2 ile 37 °C sıcaklıkta nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, RPMI-1640 ortamında_tutuldu. Hücreler, aşırı birleşmeye ulaşmadan önce bir hücre kazıyıcısı ile geçirilerek kararlı bir fenotipi korudu.

Transfeksiyon için, RAW264.7 hücreleri, reaktif maruziyetinden yaklaşık 24 saat önce, 6 kuyu yuvalı plakalarda, 2 mL tam ortamda her kuyu başına 5 ×^{10-10 5} hücreye tohumlanmıştır. Kültürler %70-90 birleşime ulaştığında, nükleik asitler (örneğin NEAT1 veya HMGB1 ekspresyon plazmidleri, kısa toka yapıları, miR-181a-5p taklitleri veya inhibitörleri ve ilgili kontroller) üreticinin talimatlarına göre serumsuz ortamda lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifiyle kompleksleştirildi. Genellikle, 2-3 μg plazmid DNA veya 50-100 pmol küçük RNA önerilen reaktif hacmiyle karıştırılır, oda sıcaklığında 10-15 dakika kompleksler oluşturulur ve ardından antibiyotiksiz ortamda hücrelere damla olarak eklenir. 4-6 saat sonra, ortam taze tam ortamla değiştirildi ve hücreler sonraki akım testlerinden önce 24-48 saat daha kuluçka altına alındı.

Makrofaj polarizasyonunun indüksiyonu

İltihabi makrofaj polarizasyonunu indüklemek için, RAW264.7 hücrelerinin tam ortamda en az 4 saat boyunca 6 delikli plakalarda tutunmasına izin verildi. Daha sonra ortam, 100 ng/mL lipopolisakkarit (LPS) içeren DMEM ile değiştirildi ve hücreler %5_CO2 ile 37 °C'de 6 saat kuluçka edildi. Uyarımdan sonra, deneysel tasarıma bağlı olarak hücreler hemen RNA ve protein ekstraksiyonu, immünoflüoresans boyama, göç testleri veya apoptoz analizi için işlendi.

Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)

Toplam RNA, fenol-guanidinyum bazlı monofazik bir reaktif kullanılarak kültürlenmiş hücrelerden, PBMC'lerden veya fare dokularından standart prosedürlere uygun olarak çıkarıldı. Kısaca, örnekler 10⁶ hücre veya 50-100 mg doku başına 1 mL reaktifte lizedilmiş, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka edilmiş ve ardından kloroform ile (1 mL reaktif başına 0,2 mL) sertçe karıştırılmıştır. 2-3 dakika kuluçkadan sonra, lizatlar 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlenerek fazları ayırdı. Sulu faz yeni bir tüpe aktarıldı ve RNA eşit hacimde izopropanol ile çökelti. Karışım yaklaşık 10 dakika kuluçka edilip, 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjlendi. Ortaya çıkan pellet %75 etanol ile yıkanmış, 7.500 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüjlenmiş, kısa bir süre hava kurutulmuş ve RNase içermeyen suda çözünmüştür. RNA konsantrasyonu ve saflığı UV spektrotometrisi kullanılarak değerlendirildi ve yaklaşık 1.8-2.0 oranında A₂₆₀/A₂₈₀ olan örnekler sonraki analizler için kullanıldı. Gerektiğinde bütünlük agaroz jel elektroforezi ile doğrulandı.

Tamamlayıcı DNA (cDNA), üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari olarak mevcut bir ters transkripsiyon kiti kullanılarak toplam RNA'dan sentezlenmiştir. miR-181a-5p için, önerildiği gibi gene özgü veya kök döngü primerleri kullanıldı. Nicel gerçek zamanlı PCR, gerçek zamanlı PCR sistemi ve uygun bir ana karışım (örneğin SYBR Yeşil veya prob tabanlı kimya) kullanılarak cDNA şablonu ve her primerin 0,2-0,4 μM içeren toplam 20 μL reaksiyon hacminde gerçekleştirildi. Tipik döngü koşulları, 95 °C'de 3 dakika boyunca başlangıç denatürasyonu, ardından 10 saniye ve 30 saniye boyunca 95 °C ile 40 çevrim ve amplikon özgüllüğünü doğrulamak için uygun olduğunda erime eğrisi analizi içeriyordu. NEAT1 ve HMGB1 ifade seviyeleri GAPDH'ye normalleştirildi ve miR-181a-5p ekspresyonu U6 küçük nükleer RNA olarak normalleştirildi. Göreceli ifade 2-ΔΔCt yöntemiyle hesaplanmış ve kontrol gruplarına kıyasla katlanma değişimi olarak ifade edilmiştir. Primer dizileri ve amplikon boyutları, Ek Tablo 1 olarak sunulmak üzere ayrı bir tabloda derlendi.

Western blotting

Western blotting için, hücreler buz gibi PBS ile iki kez yıkanmış ve uygun bir radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu ile proteaz inhibitörleriyle desteklenmiştir. Lizatlar 15-30 dakika boyunca buzda kuluçka altına alındı, ara sıra nazik karıştırıldı ve hücresel kalıntıları gidermek için 12.000 × g boyunca 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlendi. Süpernatanlar toplandı ve protein konsantrasyonları bicinchoninic asit (BCA) testi kullanılarak belirlendi.

Eşit miktarda protein (genellikle şerit başına 40 μg) yükleme tamponu ile karıştırıldı, proteinleri denatüre etmek için 95 °C'de 5-10 dakika kaynatıldı ve uygun akrilamid konsantrasyonlu sodyum dodekil sülfat (SDS)-poliakrilamid jellerinde ayrıldı (örneğin HMGB1 için %10-12). Proteinler, ilgi duyulan moleküler ağırlık aralığı için önerilen koşullarda ıslak veya yarı kuru transfer sistemi kullanılarak poliviniliden florür (PVDF) membranlarına aktarıldı. Zarlar, %5 yağsız süt veya sığır serum albümini (BSA) ile Tris tamponlu tuzlu suyda %0,1 Tween-20 (TBST) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloklandı ve ardından HMGB1'e karşı birincil antikorlarla (örneğin, 1:500 seyreltme) ve GAPDH (örneğin, 1:1.000 seyreltme) ile bloklayıcı tamponda seyreltiltilerek 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. TBST'de üç yıkamadan sonra, zarlar uygun yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Ek yıkamaların ardından, protein bantları geliştirilmiş kemimilüminesans alt tabakası kullanılarak görselleştirilmiş ve dijital görüntüleme sistemiyle yakalanmıştır. Bant yoğunlukları görüntü analiz yazılımı kullanılarak nicelendirildi, HMGB1 sinyalleri GAPDH'ye normalleştirildi ve gruplar arasında göreli ifade karşılaştırıldı.

Dual-Luciferase muhabir testi

NEAT1'in vahşi tip ve mutant parçaları ile tahmin edilen miR-181a-5p bağlanma noktalarını içeren HMGB1 3′-çevrilmemiş bölgesi (3′-UTR) lusiferaz raporlayıcı vektör^19'a klonlandı. Tüm yapılar, yerleştirme ve mutasyon^{noktalarını 20} doğrulamak için Sanger dizileme ile doğrulandı. RAW264.7 hücreleri 24 kuyu plakalarına tohumlanarak gece boyunca yapışmasına izin verildi. Hücreler, raporlayıcı plazmidler ve miR-181a-5p inhibitörleri, mimikler veya ilgili negatif kontrollerle birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifiyle birlikte transfeksiyon yapıldı; genel transfeksiyon prosedürü için tanımlandı.

Yaklaşık 24-48 saat kuluçkadan sonra, hücreler PBS ile yıkanmış, uygun pasif lizis tamponunda (örneğin, kuyu başına 20 μL) lizlenmiş ve tam lizisi sağlamak için nazikçe çalkalanmış şekilde yapılmıştır. Lusiferaz aktivitesi, üreticinin talimatlarına uygun olarak çift lusiferaz test kiti ve bir luminometre kullanılarak ölçüldü. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, transfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için Renilla lusiferaz aktivitesine normalize edildi ve her grubun göreli lusiferaz aktivitesi ilgili kontrol ile karşılaştırıldı.

Transwell göç testi

Makrofaj göçü, hücre istilası testleri için uygun ekstraselüler matris jeliyle önceden kaplanmış transwell odaları kullanılarak değerlendirildi. Jel, serumsuz ortamda buz üzerinde 1:6 oranında seyreltildi ve her bir ekin üst yüzeyine 50 μL seyreltilmiş çözelti eklendi. Plaka, jelin katılaşması için yaklaşık 4 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapıldı. Transfeksiyon edilen veya işlenmiş RAW264.7 hücreleri toplanmış, serumsuz ortamda 1 × 10⁶ hücre/mL ile yeniden süspansiyon yapılmış ve hücre süspansiyonundan 100 μL (1 × 10,5 hücre) üst kameraya eklenmiştir. Alt oda, kemoattrektif olarak %10 fetal sığır serumu içeren 600 μL tam ortamla dolduruldu.

Hücreler %5_CO2 ile 37 °C'de 24 saat boyunca kuluçka edildi. Kuluçka sonunda, zarın üst yüzeyinde kalan göç etmemiş hücreler pamuklu çubukla nazikçe çıkarıldı. Alt membran yüzeyine yapışan göç etmiş hücreler, oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika boyunca %95 etanol ile sabitlendi ve ardından %0,5 kristal mor çözeltisi ile 10-15 dakika boyandı. Fazla boya PBS ile yıkanarak çıkarıldı ve membranlar hava yoluyla kurutuldu. Göç eden hücreler ışık mikroskobu altında incelendi ve her bir ekte rastgele seçilmiş birkaç alandaki hücreler kör şekilde sayıldı, göç kapasitesi ölçüldü.

TUNEL apoptoz testi

Apoptoz tespiti için RAW264.7 hücreleri cam kapak örtülerinde kültürlendi ve belirtilen tedaviler veya transfeksiyonlara tabi tutuldu. Hücreler, oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 30-60 dakika sabitlendi ve PBS ile durulandı. Endojen peroksidaz aktivitesi, %0,3 hidrojen peroksitle 20 dakika boyunca kuluçka ile engellendi, ardından PBS yıkamaları yapıldı. Bir TUNEL test kiti kullanıldı ve etiketleme karışımı hücreleri kapsayacak şekilde uygulandı. Örnekler, nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 60 dakika boyunca 37 °C'de kuluçka edildi ve reaksiyon kit talimatlarına göre durduruldu. 37 °C'de streptavidin-HRP veya eşdeğer bir tespit reaktifiyle 30 dakika inkubasyon yaptıktan sonra, çekirdekler 3,3′-diaminobenzidin (DAB) gibi kromojenik bir alt ile görselleştirildi ve ta ki brown boyalı apoptotik çekirdekler belirginleşene kadar. Slaytlar hematoksilinle karşı boyanmış, derecelendirilmiş etanolle kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve kalıcı bir ortamla montaj edilmiştir. Apoptotik hücreler ve toplam çekirdekler ışık mikroskobu altında gözlemlendi ve apoptotik indeks TUNEL-pozitif hücrelerin yüzdesi olarak hesaplandı.

İmmünoflüoresans

İmmünofluoresans için, parafinle gömülü doku kesitleri ksilenle mumdan arındırıldı ve derecelendirilmiş etanol serisi ile suya yeniden hidratlandırıldı. Antijen alımı, antikor önerilerine göre uygun bir tampon (örneğin sitrat tamponu, pH 6.0) ve mikrodalga veya basınçlı tencere ile ısıyla indüklenen epitop alımı kullanılarak gerçekleştirildi. Soğutma ve durulama işleminden, bölümler PBS'de %5 normal serumla 37 °C'de 1 saat boyunca bloklandı, böylece spesifik olmayan bağlanma azaltıldı. Daha sonra dokular, makrofaj polarizasyonu ve inflamatuar sitokinler belirteçlerine karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi; bunlar arasında CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, indüklenebilir nitrik oksit sentazı (iNOS), IL-4, IL-10 ve Arg-1 (genellikle 1:500 seyreltmede) bulunur ve bloklayıcı tamponla seyreltildi.

Ertesi gün, bölümler PBS'de yıkanıp uygun florofor konjuge ikincil antikorlarla 1 saat boyunca 37 °C'de karanlıkta kuluçka altına alındı. Çekirdekler 5 dakika boyunca 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama yapıldı. Son yıkamalardan sonra, bölümler anti-solma montaj ortamıyla monte edildi ve uygun filtre setleriyle floresan mikroskobu altında incelendi. Görüntüler, gruplar arasında tutarlı pozlama ayarlarıyla alındı ve tüm figür panellerinde ve legendlerde ölçek çubukları (örneğin 20 μm) ve büyütmeler gösterildi.

CLP kaynaklı sepsis fare modeli

Erkek C57BL/6 fareleri (24-32 g) ameliyattan en az 1 hafta önce alıştırıldı ve ardından rastgele olarak Sham, CLP, CLP plus negatif kontrol kısa saç tokası veya CLP artı NEAT1 kısa saç tokası gruplarına (n = 6 grup başına gönderildi) olarak atandı. Fareler, kapalı bir odada eter solunmasıyla yaklaşık 1-3 dakika boyunca anestezi edildi; ta ki düzeltici refleks eteri veya başka bir kurum onaylı anestezi kaybedilene kadar; doz ve maruziyet süresi bu da doğru refleksin kaybına yol açarken yeterli solunum fonksiyonunu koruyordu. Karın tüyleri tıraş edildi ve cilt uygun antiseptik bir çözeltiyle dezenfekte edildi. Yaklaşık 1-2 cm orta çizgi laparotomisi yapılarak çekum ve bitişiği bağırsak açığa çıktı.

CLP için, çekum nazikçe dışa çıkarıldı ve uzunluğunun yaklaşık üçte ikisinde steril bir dikişle bağlandı; ileosekal kapak tıkanmamaya veya mezenterik kan akışını engellememeye özen gösterildi. Bağlanmış sekum, onaylanan protokolde belirtilen ölçü ölçüsünde steril bir iğne ile (örneğin 21 G) iki kez delildi ve delme noktalarının açıklığını sağlamak için az miktarda dışkı nazikçe dışarıya çıkarıldı. Çekum daha sonra periton boşluğuna geri getirildi ve karın duvarı ile deri dikişlerle katmanlar halinde kapatıldı. Sahte ameliyatlı fareler aynı laparotomi ve çekum maruziyetini, ligasyon veya ponksiyon olmadan geçirdi.

NEAT1'in in vivo olarak yok edilmesini sağlamak için, shNEAT1'i kodlayan adenoviral bir vektör ve buna karşılık gelen negatif kontrol vektörü tanımlanmış bir titrde hazırlandı (örneğin, 1 ×^{10 9} plak oluşturma birimi/mL). Deneysel tasarımda tanımlandığı ve etik komite tarafından onaylandığı üzere, CLP'ye göre (örneğin, ameliyattan 1 saat sonra) kuyruk damarı üzerinden belirli bir zamanda (örneğin fare başına 100 μL) sabit bir viral süspansiyon hacmi uygulandı. Ameliyattan sonra, fareler standart ameliyat sonrası bakım aldı; belirtilirse deri altı sıvı resüsitasyonu da dahil olmak üzere ve sepsis ile sıkıntı klinik belirtileri için izlendi. Önceden belirlenmiş zaman noktasında, hayvanlar kapalı bir odada aşırı dozda eter soluma yoluyla insancıl bir şekilde ötenazilen, yaklaşık 5-10 ml eter kullanılarak hızlı nefes kesilmesini sağladı, ardından ölüm doğrulandı, kan sitokin analizi için toplandı ve histopatoloji, immünoflüoresans ve moleküler testler için organlar alındı.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analiz, SPSS sürüm 23.0 veya eşdeğer bir istatistiksel yazılım paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler, aksi belirtilmedikçe ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için, veriler normalde homojen varyanslarla dağıtıldığında eşleşmemiş bir Öğrenci t-testi kullanılmıştır. Üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı, ardından anlamlı genel bir etki tespit edildiğinde birden fazla karşılaştırma için uygun post hoc testler yapıldı. İki taraflı p değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel sembollerin anlamı (örneğin, p < 0.05, *p < 0.01) şekil efsanelerinde tanımlanmış ve biyolojik kopya sayısı ilgili metin veya efsanelerde belirtilmiştir.

Sonuçlar

NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 ifadesinin ve sepsisteki etkileşimlerinin tespiti

Sepsisli hastaların serumunda NEAT1 ve HMGB1 seviyeleri sağlıklı kontrol gruplarına göre anlamlı şekilde daha yüksekken, miR-181a-5p belirgin şekilde azaldı. Benzer ifade kalıpları PBMC'lerde ve lipopolisakkarit ile uyarlanan RAW264.7 makrofajlarında gözlemlenmiş, bu da bu eksenin sepsis ve sepsis benzeri iltihap koşullarında tutarlı olarak değiştiğini göstermektedir (Şekil 1A-C).

Tartışma

Sepsis, hiperinflamasyon ve immünosupresyonun evrelerinin birlikte var olduğu ve organ yetmezliğine ve kötü sonuçlara katkıda bulunduğu, derin ve çoğu zaman uzun süreli bağışıklık düzensizliği ile^{karakterize edilir 21,22}. Toplanan kanıtlar, uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNA'ların) bu süreçlere katılarak inflamatuar sinyal ve makrofaj polarizasyonunu modüle^{ettiğini göstermektedir 23,24}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adenoviral Vektör (shNEAT1)	10692-V5	Vigene Biosciences	Adenovirüs, NEAT1 ifadesini in vivo ve in vitro olarak azaltmak için kullanılır.
BCA Protein Test Kiti	23227	Thermo Fisher	Kit, hücre lizatlarındaki protein konsantrasyonunu nicelik olarak ölçmek için kullanıldı.
Çift Luciferase Muhabir Değerlendirme Kiti	E1910	Promega	miR-181a-5p etkileşimini ölçmek için çift lusiferaz raporlayıcı testleri için kullanılan kit.
ELISA Kitleri (Sitokinler)	Yok	R& D Sistemleri	Serum ve doku örneklerindeki sitokin seviyelerini ölçmek için kullanılan kitler.
Fetal Sığır Serumu (FBS)	16000-044	Gibco	Kültür ortamında hücre büyümesi için kullanılan takviye.
GAPDH Antikor	2118S	Hücre Sinyal Teknolojisi	Western blot'ta yük kontrolü olarak kullanılan GAPDH'ye karşı birincil antikor.
Hematoksilin ve Eozin Boyama Kiti	Yok	Thermo Fisher	Patolojik analiz için doku kesitlerinin histolojik boyamasında kullanılan kit.
İmmünoflüoresans Antikorlar (CD206)	14693-1-AP	Proteintech	M2 makrofaj belirteci CD206'nın doku kesitlerinde tespit edilmesinde kullanılan antikor.
Lipopolisakkarit (LPS)	L2630	Sigma-Aldrich	LPS, RAW264.7 hücrelerinde inflamatuar makrofaj polarizasyonunu indüklemek için kullanılır.
miR-181a-5p Taklit	Yok	Yok	miR-181a-5p seviyelerini modüle etmek için kullanılan sentetik miR-181a-5p taklit.
NEAT1 İfade Plazmidi	Yok	Yok	RAW264.7 makrofajlarında NEAT1'in aşırı ekspresyonunda kullanılan plazmid.
RAW264.7 Makrofaj Hücreleri	TIB-71	ATCC	In vitro deneyler için kullanılan fare makrofaj hücre hattı.
RIPA Liz Tamponu	89901	Thermo Fisher	Hücrelerin lizlenmesinde kullanılan tampon, toplam protein çıkarmak.
RPMI-1640 Orta	11875-093	Gibco	RAW264.7 makrofajları için kültür ortamı.
SYBR Yeşil Ana Karışımı	4385612	Thermo Fisher	Gerçek zamanlı PCR analizinde kullanılan reaktif.
Transwell Göç Test Odaları	3422	Corning	Makrofaj göçünü değerlendirmek için transwell göçü testleri için kullanılan odalar.
TUNEL Apoptoz Tahlil Kiti	ab66110	Abcam	RAW264.7 hücrelerinde apoptozu TUNEL boyama ile tespit etmek için kullanılan kit.
Western Blot Antikorları (HMGB1)	AB18256	Abcam	Western blotting'de kullanılan HMGB1'e karşı birincil antikor.