Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Bu protokol, akciğer adenokarsinomunu profillemek için yeni nesil dizileme ve çok renkli immünoflüoresansın entegrasyonunu sağlar. Genomik heterojenlik ile tümör sızdıran bağışıklık hücresi yoğunluğu arasındaki ilişkiyi analiz etmeyi amaçlar. Bu çok boyutlu yaklaşım, ameliyat sonrası prognostik değerlendirme için tümör mikro ortamının kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesini kolaylaştırır.
Akciğer adenokarsinomu (LUAD) prognozu geleneksel olarak tümör-düğüm-metastaz (TNM) aşamasıyla değerlendirilir; bu durum hastanın bağışıklık durumunu hesaba katmaz. Bu protokol, genomik profilleme ve bağışıklık mikroortam analizini entegre ederek daha kapsamlı bir ameliyat sonrası prognostik değerlendirmeyi kolaylaştırır. Bu yöntem, parafinle gömülü tümör dokularının iki ana tekniği kullanılarak retrospektif analizini içerir. İlk olarak, yeni nesil dizileme (NGS), belirleyici genler ve belirsiz varyantlardaki mutasyonları belirlemek için özelleştirilmiş 37 genlik bir panel ile gerçekleştirilir. İkinci olarak, çoklu immünoflüoresans (mIF), HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 ve PanCK gibi belirteçleri hedeflemek için kullanılır. Bu, çeşitli tümör bölgelerindeki belirli bağışıklık hücre alt popülasyonları için mekânsal dağılım ve yoğunluğun nicelendirilmesini sağlar. Bu entegre yaklaşım, genomik heterojenlik ve tümör sızdıran bağışıklık hücresi özelliklerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Ortaya çıkan veriler, EGFR durumu gibi mutasyonel profillerin ve bağışıklık hücre yoğunluklarının belirli kombinasyonlarını tanımlar. Bu entegre kombinasyonlar, hasta hayatta kalma üzerindeki kolektif etkilerinin incelenmesini mümkün kılarak gelecekteki akciğer kanseri prognostik modellerinin geliştirilmesi için umut verici bir yaklaşım sunar. Bu protokol, LUAD tümör mikro ortamının karmaşık biyolojik özelliklerini karakterize etmek için sağlam bir yöntem göstermektedir.
LUAD, akciğer kanserinin en yaygın alt tipidir, ancak ortalama 5 yıllık sağlık oranı yaklaşık %15 olarak düşüktür. Mevcut prognostik değerlendirme öncelikle TNM aşamalama sistemine dayanır; ancak bu yöntem genellikle hastanın genel bağışıklık durumunu göz ardı eder ve bu da tahmin doğruluğunu sınırlayabilir. Kanıtlar, hem genomik heterojenliğin hem de tümör mikroçevresinin (TME) LUAD tümörjenezisi ve hastalık ilerlemesinde kritik roloynadığını göstermektedir 2,3.
Son yıllarda, geleneksel Sanger dizilemesinden hedefli NGS'ye geçiş, EGFR, TP53 ve KRAS 4,5 gibi birden fazla sürücü genin yüksek duyarlı, eşzamanlı analizini mümkün kılmıştır. NGS, genetik değişikliklerin yüksek çözünürlüklü haritasını sunarken, genomik veriler tek başına TME içindeki karmaşık hücresel etkileşimleri ve mekansal organizasyonu yakalayamaz.
Bu karmaşıklıkları ele almak için mIF, geleneksel bağışıklık profilleme yöntemlerine göre önemli avantajlar sunar. Tek pleksli immünohistokimya (IHC) her bölüm başına bir belirteçle sınırlıdırken, mIF birden fazla protein belirteçinin aynı anda tespit edilmesini sağlar ve dokunun mekansal mimarisini korur. Doku bozulmasına veya akış sitometrisi ile toplu RNA dizileme (mekansal lokalizasyon ve tek hücre çözünürlüğü 6,7,8) kaybına yol açan ardışık IHC'nin aksine, mIF ile mekansal bölge açıklaması birleştiğinde, bağışıklık peyzajının yerinde çok parametreli karakterizasyonumümkün olur9.
Bu protokol, hedefli NGS, mIF ve mekânsal bölge değerlendirmesini (tüm doku, tümör sınırı ve tümör çekirdeğini kapsayan) entegre eden birleşik bir iş akışı oluşturur. Böyle çok boyutlu bir yaklaşım, genomik değişiklikler ile bağışıklık hücre yoğunluğu arasındaki etkileşimi araştırmak için gereklidir—tek mod yaklaşımları genellikle bu ilişkiyi yakalayamıyor. Bu entegre özellikleri değerlendirerek, bu protokol LUAD'ın biyolojik özelliklerini karakterize etmek için tamamlayıcı bir strateji sunar ve ameliyat sonrası prognostik tabakalaşma için daha sağlam bir çerçeve sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu retrospektif çalışma, Kunming Yan'an Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. 2021-140-01). Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alındı.
Çalışma tasarımı ve örnek toplama
2015 ile 2021 yılları arasında cerrahi rezeksiyon geçiren patolojik veya histolojik olarak doğrulanmış LUAD hastası 63 hasta kaydedildi. Dışlama kriterleri arasında ameliyat öncesi neoadjuvan kemoterapi, radyoterapi veya immünoterapi alınması yer alıyordu. Ayrıca, eşzamanlı maligniteleri, ağır eşzamanlı hastalıkları, düşük doku kalitesi veya eksik klinik kayıtları olan hastalar analizden çıkarıldı. Formalin sabitli parafinli (FFPE) tümör blokları, deparafinizasyon için 1 mm kesitlere işlendi. İş akışında gösterildiği gibi (Şekil 1), bu örnekler mIF ve hedefli NGS kullanılarak entegre bir analiz geçirildi. Bu birleşik yaklaşım, genomik değişikliklerin ve bağışıklık mikroçevre özelliklerinin eşzamanlı değerlendirilmesini sağlar ve tümör biyolojisini karakterize etmek için çok boyutlu bir çerçeve sağlar.
Devam
Hastanın hedeflenen ilaçları, immünoterapisi ve hastalık ilerlemesi veya ölümü telefon takibiyle takip edildi ve hastaların sağ kalma durumu, hastalık ilerlemesi veya tekrarı, ameliyat sonrası alınan yardımcı tedaviler ve yeni teşhis edilen eş hastalıkları hakkında ayrıntılı bilgiler elde edildi. Takip süresi Temmuz 2023'te sona erdi ve nihai gözlem son noktası hastalık ilerlemesi veya ölüm oldu. Genel sağlık, ameliyatın başlamasından hastanın ölümüne kadar olan süre olarak tanımlandı. Takip için kaybedilen hasta yoktu. Minimum takip süresi 21 aydı.
NGS kütüphane hazırlığı ve dizilemesi
FFPE doku kesitlerinden DNA çıkarımı
Patolojik örneklerden 3–10 μm kalınlığında FFPE doku kesitleri alın. Bölümleri steril mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. Her tüpe ksilen ekleyin ve oda sıcaklığında 5–10 dakika kuluçka yapın, böylece parafin alın. 12.000 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın. Ksilen tedavisini tam deparafinizasyon sağlamak için 1 kez tekrarlayın. Pelleti ardışık olarak %100 etanol ile 2 kez yıkayarak kalan ksileni çıkarın. Pelleti oda sıcaklığında hava ile kurutarak kalan etanol tamamen buharlaşana kadar kurutun. Uygun liz tamponu ve proteinaz K (DNA çıkarma kitinde sağlanmıştır) ekleyin ve doku tam lizize olana kadar 56 °C'de 1–3 saat (veya gerekirse gece boyunca) kuluçka yapın. Formalin çapraz bağlama için 90 °C'de 1 saat boyunca ek bir kuluçka yapın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir FFPE DNA çıkarma kiti ( bkz. Malzemeler Tablosu) kullanarak genomik DNA çıkarın. FFPE örneklerinden alınan DNA kalitesi genellikle parçalanır; bu nedenle, hedeflenen NGS için başarılı kütüphane hazırlığını sağlamak amacıyla DNA kalitesi minimum bütünlük eşiklerini (örneğin DIN ≥ 5) karşılamalıdır.
DNA niceliklendirme ve normalleştirme
Doğru konsantrasyon ölçümü için florometrik yöntemle DNA'yı nicelikle ölçebilirsiniz. DNA örneklerini Tris-HCl tamponu (pH 8.5) kullanarak yaklaşık 5–10 ng/μL nihai konsantrasyona normalize edin. DNA konsantrasyonunun doğruluğunu ve stabilitesini sağlamak için gerekirse seyreltme adımlarını kademeli olarak gerçekleştirin.
Kütüphane hazırlığı ve hedef zenginleştirme
FFPE dokusundan çıkarılan DNA üzerinde hibrit yakalama tabanlı hedefli NGS kullanarak dizileme kütüphanelerihazırlamak 10. Tümör gelişimiyle ilişkili seçilmiş genlerin ekzonik bölgelerini kapsayan özel bir prob paneli kullanarak hedef zenginleştirme gerçekleştirin. Gerekirse standart yöntemlerle (örneğin, elektroforez tabanlı sistemler) kütüphane kalitesini ve parça boyutu dağılımını değerlendirin.
Kütüphane toplama ve dizilemesi
Her kütüphaneyi florometrik bir test kullanarak nicelikle hesaplayın. Dizileme kiti gereksinimlerine göre havuz kütüphanelerini ekvimoler konsantrasyonlarda kullanın. Havuzlu kütüphaneleri Illumina dizileme platformuna yükleyin ve 150 bp çift uçlu dizileme deseniyle dizileme yapın.
Veri işleme ve varyant tespiti
Ham dizileme okumaları, adaptör kesme, kalite filtreleme ve insan referans genomuna hizalama (GRCh37/hg19) dahil olmak üzere standart biyoinformatik boru hatları kullanılarak işlenmiştir. Kalite kontrol metrikleri şöyleydi: Q20 > %85, ortalama dizileme derinliği 2500x >, hedefe ulaşma oranı %65 >ve Fold 80 taban cezası ≤ 2. Kalite kontrolü ve hizalama: Ham FASTQ verileri, adaptör kirlenmeleri ve düşük kaliteli diziler gidermek için FastQC ve Trim Galore (veya Trimmomatic) kullanılarak kalite kontrolünden geçti. Temizlenmiş okumalar, Burrows-Wheeler Aligner (BWA) kullanılarak GRCh37 (hg19) insan referans genomuna hizalanmıştır. Hizalama sonrası işleme: Yanlış pozitif çağrıları en aza indirmek için Picard ve Genom Analiz Araç Seti (GATK) kullanılarak sıralama, tekrarlanan işaretleme ve temel kalite puan yeniden kalibrasyonu (BQSR) gerçekleştirildi. Varyant çağrısı: Germline tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) ve InDel'ler BWA MEM (0.7.16a - r1181) kullanılarak tespit edildi. Somatik SNV'ler ve InDel'ler, Mutect2 ve VarScan2 kullanılarak uzlaşı bir yaklaşımla tanımlanmıştır. Düşük frekanslı mutasyonlar Freebayes (v 1.3.2) istatistiksel modeliyle daha fazla değerlendirildi. Açıklama ve filtreleme: Varyantlar, gnomAD, ClinVar ve COSMIC verilerini entegre eden ANNOVAR kullanılarak notlandırıldı. Germline varyantları, yüksek frekanslı popülasyon SNP'leri filtreleyerek ve varyant allel frekanslarının (VAF) değerlendirilmesiyle somatik mutasyonlardan ayrıldı. VAF eşikleri: Klonal olaylar (örneğin, ROS1 ve ALK) için %≥5 VAF sınırı kullanılırken, gen mutasyonlarına (örneğin EGFR) düşük frekanslı değişikliklerin tespitini sağlamak için %1 eşik uygulandı; bu, >500x yüksek ortalama dizileme derinliği sayesinde mümkün oldu. Germline mutasyonları, laboratuvarımızda kurulan 1000 Genom Projesi (1000G) verileri ve sağlıklı Han Çinli bireylerin yerel temel veri tabanı kullanılarak somatik mutasyonlardan ayırt edildi. Tespit edilen somatik varyantların patojenlik değerlendirmesi, somatik varyantlar için kanıt derecelendirmesini kademeli, kanıta dayalı bir yaklaşımla iyileştiren AMP/ASCO/CAPçerçevesi 11'e göre gerçekleştirilmiştir. Patojenik/muhtemelen patojenik (P/LP) varyantlar korunur; sınıflandırmaları Seviye I/II kriterlerine dayanır ve derecelendirme için A/B (FDA onayı, klinik denemeler) veya C/D (preklinik/vaka çalışmaları) kanıtı gerektirir. Seviye III (VUS) kesin kanıtlardan yoksunken, Seviye IV nüfus sıklığı (örneğin, gnomAD) veya fonksiyonel çalışmalar yoluyla iyi huylu varyantları gösterir; Bu mutasyonlar sonraki analizlerden hariç tutulur. Tespit edilen germ hattı varyantlarının patogenlik değerlendirmesi ACMG/AMPyönergeleri 12'ye göre gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada patojenik (P), muhtemelen patojenik (LP) ve belirsiz anlamlılık (VUS) varyantları kaydedilmiştir. Sadece kalite kontrol kriterlerini geçen yüksek güvenli varyantlar sonraki analizlere dahil edildi (QUAL ≥1; germline mutasyonu için kapsama derinliği >10 ve somatik mutasyon için kapsama derinliği >500x)
FFPE dokusundan örnek hazırlama
Parafin kesitlerinin hazırlanması
FFPE doku bloklarını mikrotom kullanarak 3 μm kalınlığında kesimlere kesin. Bölümleri 40–45 °C su banyosu üzerinde yüzdürerek dokunun düzleştirilmesi. Bölümleri yapışkan mikroskop slaytlarına monte edin ve oda sıcaklığında kurutun. Sürgüleri 65 °C kurutma fırınına 1 saat koyarak doku kesitlerinin slaytlara sıkı yapışmasını ve fazla parafini eritmesini sağlayın.
Deparafinizasyon ve rehidrasyon
Sürgüleri boyama rafına yerleştirin ve 5 dakika boyunca temizleme çözümü I'de batırın. Slaytları sıralı olarak, parafin tamamen çözünür ve parafin tamamen çözülür olarak çözme çözeltisi II ve çözme III'ü temizlemeye 5 dakika aktarın. Slaytları %100 etanole 3 dakika aktararak kalıntı temizleme reaktifini çıkarın. Doku kesitlerini derecelendirilmiş etanol serisiyle yeniden hidretleyin: %95 etanol 3 dakika ve %80 etanol 3 dakika. Slaytları damıtılmış suda 2 kez durulayın, yıkamalar arasında 3 dakika bekle. Deparaffinizasyon sırasında kullanılan ksilen ve etanol, uçuculuk ve toksisite nedeniyle kimyasal bir buhar kapasasıyla işlenmiştir. Organik çözücüler içeren tüm atık çözeltileri ayrı ayrı toplanıp kurumsal tehlikeli atık bertaraf yönergelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.
HE boyama bölmesi
Hematoksilin ve Eosin boyama
Deparafinizasyon ve rehidrasyondan sonra slaytları oda sıcaklığında 5–10 dakika boyunca hematoksilin çözeltisine daldırın. Sürgüleri akan musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları birkaç saniye (3–10 saniye) boyunca %1 hidroklorik asit alkolle ayırt edin. Hemen akan musluk suyunda durulayın. Mavi çekirdekleri musluk suyuna veya mavi çözeltiye 5 dakika boyunca batırarak elde edin. Slaytları oda sıcaklığında 1–3 dakika boyunca eosin çözeltisine batırın. Gerekirse damıtılmış suyla kısaca durulayın.
Susuz kalma ve temizlik
Derecelendirilmiş etanolden dehidratör sürüşmeler: 1 dakika boyunca %80 etanol; 1 dakika boyunca %95 etanol ve 1 dakika boyunca 2 kez %100 etanol. Ksilen I–II'de şeffaf slaytlar, her biri 2–5 dakika.
Montaj
Bir damla nötr balsam uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatlice bir örtü kullanabilirsiniz. Slaytların oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
FFPE doku kesitlerinin çoklu immünfloresans boyaması
Aynı doku bölümünde birden fazla bağışıklık ve tümör belirteçini tespit etmek için ardışık multipleks immünoflüoresans boyama yapıldı. Bu yaklaşım, farklı hücre popülasyonlarının yerinde görselleştirilmesini sağlarken mekânsal bağlamıkorurken 13. Antijen Toplama: Bir boyama kavanozunu antijen geri alma tamponu ile doldurun. Kavanozu mikrodalga fırına koyup yüksek güçte 3-5 dakika ısıtın, ta ki çözelti kaynamaya başlayana kadar. Deparafinizasyon ve rehidrasyondan sonra sürgüleri dikkatlice ısıtmalı alma tamponuna aktarın, doku bölümlerinin tamamen suya battığından emin olun. Düşük mikrodalga gücünde 15 dakika boyunca ısıtarak verimli antijenin açılmasını sağlar. Isıttıktan sonra, sürgüleri oda sıcaklığında doğal olarak 30 dakika soğutmaya bırakın. Antijen toplama sürecini durdurmak için slaytları 5 dakika buzlu suya aktarın.
Yıkama ve hidrofobik bariyer hazırlığı
Slaytları 1 kez damıtılmış suyla durulayın, böylece kalan geri alma tamponunu çıkarın. Her doku kesitinin etrafına bir daire çizmek için hidrofobik bariyer kalemi kullanın. Slaytları tekrar kısa süreliğine damıtılmış suyla durula. TBST tamponu ile slaytları 2 kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, tamponun tamamen çıkarılmasını sağlamak için sürgüleri yatay olarak 3 dakika boyunca yerleştirin.
Bloklama
Doku kesitini tamamen kapatmak için bloklayıcı tampon uygulayın (~100 μL her slayt). Slaytları nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka edin.
Birincil antikor kuluçka
Bloklayıcı tamponu, emici kağıda sürgü kenarına hafifçe vurarak çıkarın. HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 ve PanCK'ye karşı birincil antikorlar, 1:100 ile 1:400 arasında optimize edilmiş çalışma seyreltimelerinde uygulandı. Her doku bölümüne ~100 μL seyreltilmiş primer antikor çözeltisi uygulayın. Nemlendirilmiş bir odada kuluçka slaytları: 1 saat boyunca 37 °C veya hassasiyeti artırmak için gece boyunca 4 °C.
Yıkama
Slaytları TBST tamponu ile 3 kez yıka, her yıkamada 3 dakika süre. Her yıkamadan sonra tampon drenajı için kaydırakları yatay olarak yerleştirin.
İkincil antikor kuluçka
İkincil antikor çözeltisini TBST tamponunda 1:3 seyrelterek hazırlayın. Her slayta yaklaşık 100 μL ikincil antikor çözeltisi uygulanır. Nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 10 dakika süren slaytları kuluçka yapın. Slaytları TBST ile 3 kez yıkayın, her yıkamada 3 dakika.
Floresan sinyal güçlendirme
Floresan amplifikasyon reaktifini amplifikasyon tampponunda 1:100 seyreltirin. Her slayta 100 μL seyreltilmiş reaktif uygulayın. Foto ağartmayı önlemek için slaytları oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta kuluçka yapın. Slaytları TBST ile 3 kez yıkayın, her yıkamada 3 dakika.
Belirteçler arasında antijen alımı
Tanımlandığı gibi mikrodalga antijen alımını gerçekleştirin. Isıttıktan sonra, kaydırakları sırayla soğutun: 5 dakika sıcak suda, 5 dakika buzlu suda.
Ek işaretlerin ardışık boyama
Her ek antikor belirteci için birincil ve ikincil antikor kuluçka adımlarını tekrarlayın. Her işaretleyici boyandıktan sonra antijen alımının yapıldığından emin olun, sonra bir sonraki antikora geçin.
Nükleer karşı boyama
Sürgüleri TBST tampon ile 1 kez yıkayın. DAPI nükleer leke uygulayın. Oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın. Slaytları 3 kez damıtılmış suyla yıkayın. Uç nokta belirleme: Çekirdekler floresan mikroskopisi altında açıkça boyalı görünmelidir.
Sadece son marker boyama
1:200 derecesinde seyreltilmiş biotin çözeltisi amplifikasyon tamponunda uygulayın, oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın. Sürgüleri TBST tamponu ile 3 kez yıkayın. Tarif edildiği gibi antijen toplama işlemi yapılsın. Sürgüleri TBST tamponu ile 3 kez yıkayın. Endojen biotin bloklayıcı reaktif uygulayın, 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın. Boyama boyasını TBST'de 1:100 süreliğinde uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka yapın. Sürgüleri 1 kez TBST ile yıkayın ve 3 dakika boyunca boşaltın.
Montaj
Doku bölümüne bir damla Antifade Montaj Malzemesi ekleyin. Kaydırığın üzerine dikkatlice bir örtü yerleştirin. Görüntülemeden önce slaytların kurumasına izin verin.
H&E ve mIF bölümlerinin görüntü alımı
H&E boyalı ve mIF FFPE doku kesitlerinin tam slayt görüntüleri (WSI) slayt tarayıcı kullanılarak alındı. H&E kesitleri için parlak alan taraması yapılırken, mIF kesitleri için floresans taraması kullanıldı. Amaç: Genel Bakış taraması için 20x büyütme; Yüksek çözünürlüklü bölgesel görüntüleme için 40x büyütme. Uyarılma ve emisyon ayarları: Üreticinin spesifikasyonlarına göre her florofor için optimize edilmiştir. Pozlama süresi ve kazancı: Görüntüleme yazılımı tarafından otomatik olarak ayarlanarak yeterli sinyal yoğunluğu sağlanır ve doygunluk yoktur.
mIF kalite kontrolü ve görüntü değerlendirilebilirliği
mIF sonuçlarının güvenilirliğini sağlamak için, doku sınıflandırması ve hücre nicelenmesinden önce HALO dijital patoloji sistemi kullanılarak titiz bir QC protokolü uygulandı. Eser çıkarma ve değerleme alan tanımı: Tüm slayt görüntüleri (WSI'lar), doku kıvrımları, boyama eserleri ve spesifik olmayan arka plan sinyalleri içeren bölgeleri manuel olarak dışlamak için titizlikle incelendi. Bu adım, yanlış pozitif sinyalleri önlemek ve mekânsal analizin doğruluğunu sağlamak için çok önemliydi. Bu taramanın ardından, tüm örneklerde doku alanının ortalama %80'i (%50–%95) değer verilen mİIF bölgesi olarak belirlendi. Patolojik doğrulama ve bölümleme: Tümör ve stromal bölmeleri doğru şekilde ayırt etmek için, mIF kesitleri bitişik seri kesitlerle çapraz referanslandırıldı, H&E ile boyandı. Notasyonlar iki deneyimli patolog tarafından bağımsız olarak incelendi ve tutarsızlıklar uzlaşıyla çözüldü. Tümör dokusu alanı %30'dan az olan örnekler, analitik sıkılığı korumak için çalışmadan çıkarıldı. Nicel sonrası doğrulama: Otomatik hücre fenotiplendirmesi ve niceliklendirmesinin ardından, bağışıklık hücre alt popülasyonlarının mekânsal dağılımı ve ifade desenleri patologlar tarafından yeniden değerlendirildi. Bu inceleme, dijital nicel verilerin temel histomorfolojik özelliklerle tutarlı olmasını sağladı ve böylece bulguların güvenilirliği ve doğruluğunu garanti altına aldı.
Dijital patoloji analizi ve bölge açıklaması
Panoramik taramalı görüntüler, işleme için dijital patoloji görüntü analiz platformuna aktarıldı. HALO AI Nuclei Seg-Plugin, hücreleri segmente etmek ve tanımlamak için kullanıldı. H&E boyama referans olarak kullanılarak, aşağıdaki ilgi çekici bölgeler (ROI) manuel olarak notlandı: Tüm tümör bölgesi (WSIT); Tümör sınırı (TB); Tümör çekirdeği (TC). Pozitif sinyal tespiti, floresans yoğunluk eşikleri ve her belirteçin beklenen hücrealtı lokalizasyonuna göre belirlendi. Bu bölme-spesifik yaklaşım, arka plan parazitini en aza indirmek ve bağışıklık hücresi tanımlamasının doğruluğunu artırmak için uygulandı. Bağışıklık hücre yoğunluğu, seçilmiş tümör bölgesi başına belirteç pozitif hücre sayısı olarak nicelendirildi. mIF görüntülerini, doku morfolojisine dayalı ilgili H&E kaynaklı açıklamalarla hizalamak. Hastalar, her belirteç için bağışıklık hücresi yoğunluğunun medyan değerine göre yüksek yoğunluklu ve düşük yoğunluklu gruplara ayrıldı.
İstatistiksel analiz
Analiz için SPSS 17.0 yazılımı kullanıldı. Normal dağılımlı veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilirken, normal dağılım olmayan nicel veriler medyan (%25-%75) olarak ifade edilmiştir. Her gen mutasyon tipi, bağışıklık hücre yoğunluğu ve klinik özellikler arasındaki korelasyon, python can hatları modeli kullanılarak Cox orantılı riskler regresyon modeliyle analiz edilmiştir. Örneklem büyüklüğüne ve verinin normal dağılıma uyup uymadığına göre, sürekli değişkenler arasında karşılaştırma için Student testi veya Mann-Whitney U testi kullanıldı. Rütbe değişkenlerinin karşılaştırılması için Wilcoxon imzalı rütbe testi kullanılmıştır. Ki-kare testi veya Fisher tam testi, örneklem büyüklüğüne ve teorik sıklığa göre sıralanmamış kategorik değişkenlerin analizi için seçilmiştir. Korelasyon analizi için Spearman testi veya Pearson testi kullanıldı. Hastaların genel sağkalma oranı Kaplan-Meier yöntemiyle elde edildi ve test için Log-rank testi kullanıldı. Hayatta kalma eğrileri, RStudio yazılımına dayalı R dili kullanılarak çizildi. P-değeri <0.10 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Pratik uygulanabilirlik ve sınırlamalar
Bu entegre iş akışının güvenilir şekilde uygulanması için, FFPE doku bloklarının %≥30 ideal tümör hücreselliği ve yaygın nekroz veya önemli doku artefaktlarının olmaması gibi katı kalite standardlarını karşılaması gerekir. mIF'in teknik başarısı büyük ölçüde doku korunmasına bağlıdır; Aşırı fiksasyon, aşırı hasar veya yüksek arka plan otofloresansı gibi faktörler yetersiz antikor penetrasyonuna ve optimal olmayan sinyal yoğunluğuna yol açabilir. Ayrıca, bu çalışmanın birkaç temel sınırlaması da göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, analiz retrospektif, tek merkezli 63 hasta kohortuna dayanıyor ve bu da bulguların istatistiksel gücünü ve genel genellenebilirliğini diğer popülasyonlara sınırlayabilir. İkinci olarak, değerlendirmenin kapsamı sabit 37 genli NGS paneli ve belirli bir bağışıklık belirteç setiyle (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 ve PanCK; Ek Tablo 1). Kaynaklarda belirtildiği gibi, bu birleşik yaklaşım prognostik tabakalaşma için daha sağlam bir çerçeve sağlarken, bu ilişkileri daha da doğrulamak ve tanımlanan biyobelirteçlerin öngörücü faydasını geliştirmek için daha geniş prospektif, çok merkezli çalışmalar gereklidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Akciğer adenokarsinomlu hastaların klinik özellikleri
Bu çalışmada 2015-2021 yılları arasında hastanemizde LUAD tanısı konmuş ve cerrahi üç kez tedavi görmüş, dahil etme kriterlerini karşılayan toplam 63 hasta toplanmıştır. Dahil edilen hastaların klinik özellikleri Tablo 1'de gösterilmiştir. Kayıtlı hastalar arasında medyan yaş 60 (47-73 yaş) idi; bunların arasında 30/63 erkek hasta (%46,2) ve %33/63'ü kadın hasta (%53,8) vardı. Sigara geçmi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
LUAD'ın entegre genomik ve mekansal olarak çözülen immünolojik profillenmesi
Bu çalışma, hedefli NGS ve mIF'i birleştirerek LUAD'ın çok boyutlu manzarasını karakterize eden entegre bir iş akışını göstermektedir. Genomik bulgularımız, özellikle mutasyon sıklıklarındaki etnik varyasyonlarla ilgili önceki literatürle örtüşmektedir. Gözlemlenen EGFR mutasyon oranı (yaklaşık %40-%60), Asya popülasyonlarındaki bildirilen sıklıklarla tutarlıdır; bu sıklıklar Batı ko...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar, potansiyel çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek ticari veya finansal ilişkiler belirtmemektedir.
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Tıp ve Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Planı Projesi (2022KY1237) tarafından desteklenmiştir; Yunnan Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Fonu Projesi (2025Y0387); Yunnan'ın Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (202403AC100002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA Çoklu Çoklu IHC Kiti | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Çoklu immünoflüoresans boyama |
| Antifade Montaj Ortamı | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lot0525A17 | Çoklu immünoflüoresans boyama |
| CD163 | Pekin Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Şirketi Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| CD206 | Abcam, Inc | Cat# 5307-1 | RRID:AB_10896526; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| CD68 | Pekin Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Şirketi Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| Özel Kanser Gen Paneli | TWIST Co., Ltd. | NGS Kütüphane Hazırlığı | |
| Deparafinizasyon Buffe | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | DNA Ekstraksiyonu HE boyama; FFPE doku kesitlerinden çoklu immünoflüoresans boyama |
| Dynabead M-270 streptavidin | Thermo Co., Ltd. | 65602 | NGS Kütüphane Hazırlığı |
| Fluorometre | ThermoFisher Bilimsel Şirketi, Ltd. | QUBIT 4.0 | NGS Kütüphane Hazırlığı |
| HALO dijital patoloji görüntü analiz platformu | Indica Labs, Inc., Albuquerque | version 3.6.4134 | HE boyama ve Multipleks immünofluoresans boyama analizi |
| Hematoksilin-Eozin Boyama Kiti | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | HE boyama |
| HiPure FFPE DNA Kiti | Guangzhou Magen Biyoteknoloji Şirketi, Ltd. | D6323 | FFPE doku kesitlerinden DNA çıkarımı |
| HLA-DR | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| Illumina DNA dizileyicisi | Illumina, Inc | 550DX | Dizileme |
| Nötr balsam | Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd. | G8590 | HE boyama |
| Panck | Pekin Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Şirketi Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| PD-L1 | AR-GE Sistemleri | Katalog # AF1019 | RRID:AB_354540; Çoklu immünoflüoresans boyama |
| TBST tamponu | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | HE boyama ve Multipleks immünofluoresans boyama |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | NGS Kütüphane Hazırlığı | |
| VAHTS DNA Temiz Boncuklar | Vazyme Co., Ltd. | N411 | NGS Kütüphane Hazırlığı |
| VAHTS uniersal DNA kütüphanesi illumina için hazırlık kiti | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | NGS Kütüphane Hazırlığı |
| Tam slayt görüntüleme sistemi | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 sürüm 3.3 | HE boyama ve Multipleks immünofluoresans boyama analizi |
| xGen Hibritleşme ve Yıkama Kiti | IDT Co., Ltd. | 1080577 | NGS Kütüphane Hazırlığı |
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste