Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Küresel N 6-metiladenosin RNA modifikasyon seviyelerini tespit etmek için nokta lekesi testi

553 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69860

⸱

6 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, nokta blot kullanarak küresel m⁶A seviyelerini yarı nicel olarak değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Toplam RNA çıkarılır, denatüre edilir, naylon zar üzerinde lekelenir, anti-m⁶A antikoru ile incelenir ve kemilyümüsans ile görselleştirilir. Sinyal yoğunluğu, ImageJ gri tonlama analiziyle ölçülür, göreli metil bolluğunu yansıtır ve araştırma için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Özet

N 6-metiladenosin (m⁶A), ökaryot haberci RNA'da (mRNA) en bol bulunan iç modifikasyondur ve transkripsiyon sonrası gen ifadesinin ana düzenleyicisi olarak hizmet eder. M⁶A'yı incelemek için yöntemler, küresel nicelik, nükleotid spesifik tespit ve ilgi gören belirli transkriptlerin analizi dahil olmak üzere birden fazla çözünürlük seviyesinde uygulanabilir. Bunlar arasında, nokta leke testi, küresel m⁶A modifikasyon seviyelerinin yarı nicel değerlendirmesi için basit, hızlı ve maliyet etkin bir yaklaşım sunar. Bu testte, hücreler önce toplam RNA çıkarılması için işlenir, ardından bu seyreltilir ve denatüre edilir. RNA örnekleri naylon zara yerleştirilir, anti-m⁶A antikoru ile incelenir ve kemilyünüsans ile görselleştirilir; sinyal yoğunluğu metilasyonun göreceli bolluğunu gösterir. Son olarak, sinyal yoğunluklarının nicelendirilmesi ve karşılaştırılması, gri tonlu değerlerin ImageJ ile ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Dizileme veya kütle spektrometrisi tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, nokta lekesi minimum enstrümantasyon ve teknik uzmanlık gerektirir; bu nedenle rutin tarama, ön fonksiyonel çalışmalar ve karşılaştırmalı analizler için özellikle uygundur. Bu protokol, m⁶A nokta leke testini hem temel araştırma hem de çeviri uygulamalarında uygulamak için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Giriş

N 6-metiladenosin (m⁶A), ökaryot haberci RNA'da (mRNA) en yaygın iç modifikasyondur ve transkripsiyon sonrası düzenlemede önemli rol oynar; RNA stabilitesi, splicing, bozunma, translasyon veihracat 1,2,3 dahildir. M⁶A modifikasyonunun düzensizliği, tümör başlatılması, ilerlemesi vemetastaz 4,5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde rol oynamıştır. Osteosarkomda, hem hücre hatlarında hem de dokularda yüksek m⁶A seviyeleri gözlemlenmiştir; bu da hastalık biyolojisinde anormal RNA metilasyonununrolünü göstermektedir 6,7. Bu nedenle, küresel m⁶A bolluğunun sistematik olarak değerlendirilmesi, osteosarkomla ilişkili transkriptler ve düzenleyici yollardaki değişikliklerle birlikte, osteosarkomda RNA metilasyonunun biyolojik mekanizmalarını ve klinik etkilerini netleştirmek için gereklidir.

m⁶Amodifikasyonları 8,9'u incelemek için çeşitli analitik yöntemler mevcuttur. Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi/kütle spektrometrisi (LC-MS/MS)10 ve enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) tabanlıtestler 11 küresel m⁶A seviyelerini ölçmek için kullanılır. İlki yüksek hassasiyet sunar ancak özel ekipman ve uzmanlık gerektirirken, ikincisi görecelim 6A seviyeleri sağlar ve dot blot testinden daha yüksek maliyete katkıda bulunur. MeRIP-qPCR, belirli transkriptlerin hedefli değerlendirilmesini sağlar, ancak immünopresipitasyon etkinliğinden güçlü şekildeetkilenir. MeRIP-seq13, m⁶A-seq14 ve m⁶A-SAC-seq15, m⁶A metilasyon noktalarını tam olarak haritalayabilen dizileme tabanlı yaklaşımlardır; ancak pahalıdırlar ve kapsamlı biyoinformatik analiz gerektirirler.

m⁶A nokta leke testi, RNA'da küresel m⁶A modifikasyon seviyelerini belirlemek için basit, hızlı ve maliyet etkin bir yöntem sunar. Yarı nicel bir immünoanaliz olarak, temel avantajı, özel ekipman veya karmaşık biyoinformatik analiz gerektirmeden m⁶A bolluğunun genel bir görünümünü üretmektir. Bu da m⁶A nokta leke testini rutin tarama, ön fonksiyonel doğrulama ve klinik araştırmalar için değerli bir araç olmanın yanı sıra gelişmiş dizileme ve kütle spektrometrisi tabanlı yaklaşımlara pratik bir tamamlayıcı yapar. Mevcut protokol, tekrarlanabilir algılama ve geniş uygulama sağlayacak ayrıntılı adım adım iş akışı sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Protokol üç bölüme ayrılmıştır: RNA hazırlanması, nokta leke testi ve nicelik. Materyal Tablosu gerekli malzemeleri özetler, Ek Tablo 1 reaktif formülasyonlarını detaylandırır ve Şekil 1 deneysel iş akışını gösterir.

1. RNA hazırlığı

  1. Hücre hazırlığı
    1. Stabil SNHG21-knockdown (shSNHG21), negatif kontrol hücreleri (shCtrl) ve 3-deazaadenosin (3-DAA; [100 μM, 24 h]) ve meklofenemin asit (MA; [100 μM, 24 h]) 37 °C kuluçka makinesinden.
    2. Hücre birleşiminin yaklaşık %80-90 olduğunu ve hücrelerin iyi durumda olduğunu mikroskop altında doğrulayın.
    3. Kültür ortamını çıkarın, ardından hücreleri 1 mL PBS ile iki kez durulayın.
    4. PBS'yi çıkarın, ardından 6 cm tabağa 1 mL tripsin ekleyin.
    5. Tripsini eşit dağıtmak için hafifçe çalkalayın ve 1 dakika kuluçka yapın.
    6. Tripsini çıkarın, ardından sindirimi sonlandırmak için %10 FBS içeren 1 mL ortam ekleyin.
    7. Hücreleri dağıtmak için hücre askısını birkaç kez pipetleyin.
    8. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL RNase-free mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Tüpü kullanmadan önce etiketleyin. 1.1.3'ten 1.1.8'e kadar olan adımlar steril koşullarda yapılmalıdır.
    9. 1000 × g seviyesinde 3 dakika boyunca santrifüj yapın, sonra süpernatantı tamamen çıkarın.
  2. RNA çıkarımı
    NOT: RNA çıkarımı EZ-press RNA arıtma kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
    1. Pellet ve vortex'e iyice 600 μL lizis tamponu (RNA arıtma kitinde bulunan) ekleyin ve hücreleri tamamen lizize etmek için iyice ekleyin ve 5 dakika bekletin.
      NOT: RNA izolasyonu için yaklaşık 2 × 106 hücre kullanılır.
    2. Eşit hacimde %100 etanol ekleyin ve iyice vortex ekleyin.
    3. 600 μL karışımı, toplama tüpünle birleştirilmiş bir spin kolonuna ekleyin.
      NOT: Kullanımdan önce spin kolonunu ve toplama tüpünü birleştirin ve kullanımdan önce boruyu etiketleyin.
    4. 12.000 × g seviyesinde 1 dakika santrifüj yapın ve sıvıyı toplama tüpüne atın.
      NOT: Kolonun alt kısmı ile sıvı veya operatör arasında temas kurmayın.
    5. Kalan karışım için yukarıdaki 1.2.3-1.2.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. Her dönme kolonuna 500 μL yıkama tamponu (RNA arıtma kitinde bulunan) ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika bekletin.
    7. 12.000 × gr'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve sıvıyı toplama tüpüne atın.
    8. Boş kolonu 12.000 × g ile tekrar santrifüjlenerek kalan sıvıyı çıkarabilirsiniz.
    9. Spin kolonunu yeni 1.5 mL RNase içermeyen bir tüpe aktarın, kapağı açın ve 2 dakika boyunca hava kurutmasında kurutun.
      NOT: Tüpü kullanmadan önce etiketleyin.
    10. Spin kolonunun ortasına 25-50 μL elusiyon tamponu (Enzimsiz su) ekleyin.
    11. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın.
    12. 12.000 × g sıcaklıkta santrifüj ile RNA'yı üütlemek için 1 dakika kullan.
    13. Spin sütununu atın ve RNA'yı buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: RNA'yı kullanana kadar -80 °C'de sakla.
  3. RNA seyreltme
    1. 143B shSNHG21 hücreleri, 143B shCtrl hücreleri ve 3-DAA ile MA ile işlenmiş hücrelerin RNA konsantrasyonu DS-11 spektrofotometresi kullanılarak ölçülüyor.
    2. Her hücre hattından 1 μg toplam RNA hazırlayın.
    3. RNA'yı dietil pirokarbonat (DEPC) ile arındırılmış suyla 400 ng, 200 ng ve 100 ng'ye seri seyreltirin.
      NOT: Konsantrasyon gradyanını gerektiğinde ayarlayın.
  4. RNA denatürasyonu
    1. 95 °C'de 3 dakika boyunca ısıya seyreltilmiş RNA örnekleri alın.
    2. Numuneleri hemen buza aktararak soğutun.
      NOT: Denatüre RNA 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.

2. Nokta leke

  1. RNA gözlemi
    1. Pozitif yüklü naylon zarı istenen boyuta kesin.
    2. Referans çizgileri çizin ve zarı örnek adıyla etiketleyin.
    3. RNA'yı nazik vorteks veya pipetle iyice karıştırın.
    4. Her RNA örneğinden 1-2 μL membran üzerinde belirlenen pozisyonlara yerleştirin.
      NOT: Her zaman RNase içermeyen pipet uçları kullanın. Pipet ucu ile membran arasında doğrudan temas kurmayın. RNA'nın zar üzerinde doğal olarak yayılmasına izin verin. Her örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. Düzensiz difüzyonu önlemek için her nokta 2 μL'yi aşmayın.
  2. RNA çapraz bağlanması
    1. Membranı 3 dakika hava ile kurut.
    2. Zarı UV çapraz bağlayıcıda 254 nm, 120 mJ/cm² hızında ışınlayarak RNA çapraz bağlama gerçekleştirin.
      NOT: Alternatif bir seçenek olarak zarı 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka edin.
    3. Membranı, bağlanmamış RNA'yı çıkarmak için sallanan bir platformda 10 mL 1x TBST ile 5 dakika boyunca yıkayın.
  3. Membran blokajı
    1. %5 BSA çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Bu çözeltiyi kullanmadan önce taze hazırlayın.
    2. Zarı bloklama çözeltisinde oda sıcaklığında 2 saat kuluçka yapın.
  4. Antikor kuluçka
    1. Zarı anti-m⁶A antikoruyla gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: Kullanmadan önce %5 BSA çözeltisinde 1:1000 antikor sulandırın. Zarı hafif sallama (50 rpm) ile sallama platformunda kuluçka yapın.
    2. Zarı 10 mL 1x TBST ile sallanan bir platformda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    3. Zarı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş ikincil antikorla kuluçka yapın.
      NOT: Kullanmadan önce %5 BSA çözeltisinde 1:1000 antikor sulandırın.
    4. Zarı 10 mL 1x TBST ile sallanan bir platformda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  5. Kemilyümünsans tespiti
    1. Kemimilüminesans HRP substratını zarın üzerine damla olarak eşit şekilde uygulayın.
      NOT: Zarı oda sıcaklığında nazikçe sallayarak alt tabaka ile 1 dakika kuluçka edin.
    2. Kemilyüminsans görüntüleme sistemi kullanarak sinyali tespit edin.
    3. Kimyasal lüminesans görüntüleme sisteminde otomatik pozlama fonksiyonunu ilk ön tarama olarak kullanın.
      NOT: Otomatik zamanı yalnızca en parlak sinyal %65'ten az doygunluksa kabul edin; aksi takdirde, poziyeti yarıya indirin ve tepe sinyal %30-60 aralığına düşene kadar tekrar elde edin.
  6. Metilen mavisi (MB) boyama
    1. Zarı MB boyama çözeltisinde 1 dakika kuluçka yapın.
    2. Zarı 10 mL 1x TBST ile sallanan platformda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve yükleme kontrolü olarak görüntüleyin.
      NOT: Kemilyümüsans için kullanılan aynı membranı boyayın. Boyama çözeltisinde rahatsız edici tortulardan kaçının. Koruyucu giysi ve maske giyin, çünkü MB'yi çıkarmak zordur.
    3. MB ile lekelenmiş zarı, %1 SDS içeren bir çözeltiyle 15 dakika boyunca sallanma platformunda deplasman yaptırarak belgeleme veya potansiyel yeniden araştırmayı kolaylaştırmak için depreslenin.

3. Nicelik

  1. Gri tonlu değer ölçümü
    1. Görseli ImageJ yazılımına aktarın.
    2. Görüntüyü 8-bit formatına dönüştürün > Tip > 8-bit kullanarak.
    3. Arka planı Süreç > Arka Plan Çıkar ile çıkar.
      NOT: Yarıçap: 50.0 piksel, Açık arka planı kontrol et.
    4. Analiz alanını seçmek için Dikdörtgen aracını kullanın.
    5. Analiz > Gels ile > Birinci Şeridi Seç ile şeritleri sıralı tanımlayın.
    6. Analyze > Gels > Plot Lanes kullanarak yoğunluk profilleri oluşturun ve zirveleri ölçin.
    7. Sırasıyla m⁶A ve MB'nin gri tonlu değerlerini ölçün.
  2. Verileri analiz için bir tabloya kopyalayın.
  3. Sinyal yoğunluklarını karşılaştırarak küresel m⁶A modifikasyon seviyelerini değerlendirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Nokta leke testinin performansını titizlikle doğrulamak ve SNHG21'in küresel m6 A seviyelerini düzenlemedeki rolünü incelemek için, 143B hücreleri, m6A metilasyonunu bastıran veya artıran farmakolojik bozulmalara maruz kalmış ve her iki yönde de m6A bolluğu izlenmiştir.

Küresel m6 Bolluğun nokta lekesi nicelenmesi
İlk olarak, bu testin m6A seviyelerindeki azalmalarım6A metilasyonunu inhibe ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, osteosarkom 143B hücrelerinde SNHG21'in etkisi m⁶A sinyal yoğunluğunun azalmasına yol açmış ve bu testin genetik modifikasyonların RNA metilasyonunu etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için değerini göstermiştir. Ayrıca, bu test aşağıdaki gibi birçok uygulama için bir araç olarak hizmet eder: 1) Fonksiyonel çalışmalar ve mekanik doğrulama: Bu test, küresel m⁶A seviyelerinin hücre farklılaşması, stres yanıtı veya tümör ilerlemesi gibi belirli biyolojik süreçlerle ilişkil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Doğa Bilimi Vakfı'ndan (82174408, 82374477 ve 82474535) alınan hibelerle desteklendi. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-deazaadenosine (3-DAA)MCEHY-W013332A1 mg
Anti-m6A Monoklonal antikorProteintech68055-1-Ig50 μ L
Sığır serum albümini (BSA, Fraction V)BioFroxx4240GR100 100 g
ChemiDoc MP görüntüleme sistemiBIO RAD12003154
DMEM Yüksek GlikozWISENT319-005-CL500 mL
DS-11 spektrofotometresiDeNOVIXDS-11
EZ-press RNA Temizleme KitiEZB B0004DP100 Hazırlık
FBS- Üstün kaliteWISENT086-150500 mL
HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG (H+L)BeyotimeA02161 mL
Immobilon Western kemimilüminesans HRP Substratı MilliporeWBKLS05002 & Times; 250 mL
Meklofenemik asit (MA)MCEHY-1172751 mg
Metilen mavisi boyama çözeltisiSolarbioG1300%0,1, 100 mL
Naylon transfer membranıLABSELECTTM-NY-XS-457.4 & Times; 8,5 cm, 0,45 μ m, 10 PCS/ÇANTA
PBS tamponu (kullanıma hazır kuru toz)biosharpBL601ApH: 7.2-7.4, 2 L/torba
Sodyum dodesil sülfat (SDS)SigmaL5750-500G500 g
TBS tampon Premix tozuSangon  A510025-00011EA (243.9 g barıt)
TrypLE Express EnzimiGibco12604-0211×, 500 mL
Tween-20SangonA600560-0500500 mL
UV çapraz bağlayıcıUVPCL-1000

Kaynaklar

  1. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  2. Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).
  3. Hsu, P. J., et al. The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs. J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).
  4. Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. The role of m6A RNA methylation in human cancer. Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).
  5. Li, Y., et al. Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types. Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).
  6. Hu, Y., Zhao, X. Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review). Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).
  7. Zhang, Y., et al. N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review. Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).
  8. Zhu, W., et al. Detection of N6methyladenosine modification residues (review). Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).
  9. Wang, Y., Jia, G. Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine. Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).
  10. Stejskal, S., et al. Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence. RNA. 31 (4), 514-528 (2025).
  11. Ensinck, I., et al. m6A-ELISA, a simple method for quantifying N6-methyladenosine from mRNA populations. RNA. 29 (5), 705-712 (2023).
  12. Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nat Cell Biol. 20 (9), 1074-1083 (2018).
  13. Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data. Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).
  14. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  15. Mishra, T., Phillips, S., Zhao, Y., Wilms, B., He, C., Wu, L. Epitranscriptomic m6A modifications during reactivation of HIV-1 latency in CD4+ T cells. mBio. 15 (11), e0221424(2024).
  16. Li, J., et al. METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression. Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).
  17. Ren, F., Cai, Y., Song, Y. OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).
  18. Chen, Y., et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).
  19. Gu, Y., et al. Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma. Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).
  20. Ura, Y., et al. Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues. Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).
  21. Reed, K. C., Mann, D. A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).
  22. Herrin, D. L., Schmidt, G. W. Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).
  23. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  25. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate. Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).
  26. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N6 Metiladenozin TespitiGlobal m6A SeviyeleriRNA EkstraksiyonuKemil minesans G r nt lemeAntikor SondalamasMetilen Mavisi BoyamaImageJ KantifikasyonuTranskripsiyon Sonras D zenleme
Küresel N 6-metiladenosin RNA modifikasyon seviyelerini tespit etmek için nokta lekesi testi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.