Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Osteosarkom Hücrelerinde Spesifik RNA Modifikasyon Seviyeleriiçin MeRIP-qPCRTesti

861 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, MeRIP-qPCR kullanılarak belirli RNA'nın m6Amodifikasyon seviyelerini değerlendirmek için ayrıntılı bir yaklaşım sunar.

Özet

RNA epitrankriptomik modifikasyonu, çeşitli kanserlerin başlangıcında ve gelişiminde kritik bir rol oynar; bunlar arasında en yaygın ve fonksiyonel olarak çeşitli modifikasyon olan N 6-metiladenozin (m6A). Burada, osteosarkom hücrelerindeki spesifik transkriptlerin m6Amodifikasyon seviyelerini değerlendirmek için MeRIP-qPCR kullanarak sadeleştirilmiş ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Bu testte, toplam RNA alındı ve ardındanm6Amodifikasyonunun immünocapture RNA'sına karşı spesifik bir anti-m6Aantikoru ile kuluçka yapıldı. Daha sonra RNA parçalandı ve m6A-modifiye RNA parçalarının zenginlenmesi protein G manyetik boncukları kullanılarak sağlandı. Zenginleştirilmiş RNA, proteinaz K sindirimiyle serbest bırakıldı ve RNA bağlayıcı boncuklarla saflaştırıldı. Son olarak, RNA, aday genlerde m6Aseviyelerini değerlendirmek için ters transkripsiyon ve nicel polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) tabi tutuldu. Sonuçlar, bu yöntemin metilasyon farklılıklarını etkili bir şekilde ayırt ettiğini ve osteosarkom hücrelerinde m6Amodifikasyonunun fonksiyonel mekanizmalarını araştırmak için güvenilir bir araç sağladığını göstermiştir. Sonuç olarak, MeRIP-qPCR osteosarkom hücrelerinde m6Amodifikasyonunu incelemek için basit ve son derece spesifik bir yaklaşım sunar. Bu protokol, m6Adüzenleyici ağlarını aydınlatmak ve yeni terapötik hedefleri belirlemek için büyük potansiyele sahiptir.

Giriş

En son epitranskriptom araştırmaları, RNA N 6-metiladenozin (m6A) modifikasyonunun, yaniadenosen üzerindeki N 6 pozisyonunun metilasyonunun, ökaryot hücrelerde mRNA'nın bilinen en yaygın içsel kimyasal modifikasyonuolduğunu ortaya koymaktadır 1. m6A, mRNA kararlılığı, ekleme, nükleer ihracat ve çeviri verimliliği gibi geniş bir biyolojik süreçteyer alır 2. Önemli olarak, biriken kanıtlar, m6Amodifikasyonunun düzensizliğinin, ağırlıklı olarak ergenleri ve genç yetişkinleri etkileyen son derece agresif ve kötü huylu kemik tümörü osteosarkom dahil olmak üzere çeşitli kanserlerin başlangıcına ve gelişimine katkıda bulunduğunugöstermektedir.

m6A modifikasyonunun incelenmesi sağlam ve güvenilir metodolojiler gerektirir. m6A modifikasyon seviyelerini tespit etmek için m6A nokta lekesi, m6A ELISA ve MeRIP-seq gibi çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. m6nokta leke testi basit ve maliyet etkin, ancak sınırlı hassasiyet ve kötü nicelik açısından mücadele eder. Belirli birRNA 4'ün m6Amodifikasyon seviyesi yerine toplam RNA'nın m6A modifikasyon seviyesini sağlar. m6A ELISA, nispeten pratik ve yüksek verimli algılama sunar; Ancak, çapraz tepkiye ve düşük doğruluk önemli endişeler olmaya devam eder ve benzer şekilde, transkript veya siteye özgü değişiklikleri ortaya koyma kapasitesindenyoksundur 5. MeRIP-seq, m6A'nın transkriptom çapında eşlenmesini sağlar; ancak büyük RNA girdisi, nispeten düşük çözünürlük ve antikor bağımlılığı gereksinimleri MeRIP-seq hassasiyetini vetekrarlanabilirliğini sınırlar 6. Buna karşılık, MeRIP-qPCR, immünüprecipitasyonu nicel PCR ile birleştirerek, spesifikRNA 7 üzerindem6A'nınhedefli tespiti için daha yüksek hassasiyet ve spesifiklik sağlar. Bu yöntem, aday genlerde diferansiyel m6A zenginleşmesinin hassas ve hedefli tespitini sağlar ve özellikle m6A ile ilgili kanser araştırmalarında doğrulama çalışmaları için uygundur. Bu yöntem, m6A aracılı düzenleyici mekanizmaları araştırmayı amaçlayan laboratuvarlar için maliyet etkin ve erişilebilir bir alternatif sunar.

Burada, osteosarkom hücrelerindem6Ac-Myc modifikasyon seviyelerini değerlendirmek için MeRIP-qPCR örneği kullanılarak ayrıntılı bir protokol (Şekil 1) sunduk. MeRIP-qPCR, metillenmiş RNA parçalarının antikor bazlı zenginlenmesine dayanarak, ters transkripsiyon ve nicel PCR ile birlikte, spesifik RNA'da m6A'nınvarlığını ve göreceli bolluğunu değerlendirir. Bu yaklaşımın c-Myc'nin metilasyon farklılıklarını etkili bir şekilde ayırt ettiğini ve osteosarkom hücrelerinde m6A'nınfonksiyonel rolünü araştırmak için güvenilir bir platform sağladığını gösterdik. Bu çalışma, MeRIP-qPCR'ninosteosarkomda m6Amodifikasyon araştırmaları için pratik ve spesifik bir araç olarak potansiyelini vurgulamaktadır ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi için zemin hazırlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. RNA'nın hazırlanması

NOT: RNA çıkarımı bir RNA çıkarma kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreler ve RNA reaktifleriyle çalışırken temiz bir biyogüvenlik kabini içinde çalışın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven, koruyucu gözlük) giyin. Santrifüjü çalıştırmadan önce 4 °C'ye kadar önceden soğutun.

  1. Hücreleri hazırlayın.
    1. 3,5 cm tabaktan kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile nazikçe yıkayın. Hücreleri tam olarak lizlemek için uygun miktarda RNA lizis tamponu doğrudan tabağa ekleyin ve homojenleşmek için nazikçe pipet yapın.
    2. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. 1000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Rotorun dengeli olduğundan ve kapağın sıkıca kapalı olduğundan emin olun.
    4. Santrifüjlemeden sonra mikrosantrifüj tüpünü dikkatlice çıkarın.
    5. Üst yüzeyi tabandaki pelleti bozmadan 1 mL pipet kullanarak tamamen aspire edin.
      NOT: Hücre pelletine pipet ucu ile dokunmayın.
  2. Liz hücreleri.
    1. Hücre pelletine 300 μL Lysis Buffer ekleyin.
    2. Tüpü 30 kez ters çevirerek iyice karıştırın, ta ki çözelti şeffaf ve yapışkan hale gelene kadar, görünür kümeler olmadan.
    3. Tüpü oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın.
  3. Çökeltme RNA.
    1. Lizata %100 etanol 300 μL ekleyin (eşit hacimde Lizis Tamponu).
    2. Hemen yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın (yaklaşık 8-10 kez) tam karıştırmak için.
  4. RNA sütun bağlamasını gerçekleştirin.
    1. Verilen 2 mL'lik toplama tüpüne bir RNA arıtma kolonu yerleştirin.
    2. Tüm karışımı arıtma kolonuna aktarın.
      NOT: Merkezdeki beyaz zara dokunmaktan kaçının.
    3. Kapağı kapatıp 12.000 × gr'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Alt sıvıyı atın ve toplama tüpünü emici kağıda nazikçe ters çevirerek kalan sıvıyı çıkarın.
    5. Arıtma kolonunu toplama tüpüne geri götürün.
  5. Safsızlıkları yıkayın.
    1. Arıtma kolonuna 500 μL Yıkama Tamponu (Nukleazsız su) ekleyin.
      NOT: Merkezdeki beyaz zara dokunmaktan kaçının.
    2. 12.000 × g seviyesinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve alt sıvıyı atın.
    3. Kalan sıvıyı çıkarmak için 12.000 × g ile tekrar santrifüj yapın.
    4. Arıtma kolonunu temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    5. Kapağı açın ve kolonun oda sıcaklığında 2 dakika beklemesine izin verin.
  6. Elute RNA.
    1. Arıtma kolonunu yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    2. Zarın merkezine doğrudan 25 μL Elution Buffer ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
    4. 12.000 × g seviyesinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın, alt tüpte RNA toplanın.
    5. Elüatı membrana tekrar uygulayın ve 12.000 × g boyunca 1 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece verim maksimize ediler.
      NOT: Her zaman sütun zarının merkezine doğrudan elusyon tamponu ekleyin. Yan duvara eklemekten kaçının, çünkü bu RNA'nın çözünmesini engelleyebilir ve verimi büyük ölçüde azaltabilir. Ayrıca, pipet ucu ile zarı delmeyin.
  7. RNA konsantrasyonunu ölç.
    1. Spektrofotometre örnek portunu 1.5 μL Elution Buffer ile durulayın.
    2. 1.5 μL Elution Buffer'ı boş olarak kullanın. Okumanın sıfıra yakın olduğunu doğrulayın.
    3. 1,5 μL RNA örneği yükleyin ve konsantrasyonu ölçün.
    4. RNA örneklerinin kalitesini spektrofotometre (A260/A280 = 1.8-2.2, A260/A230 = 2.0-2.5) ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak değerlendirin.

2. Metillenmiş RNA immünopresipitasyonu (MeRIP)

  1. İmmünocapture karışımının hazırlanması
    1. Yeni bir 0.2 mL PCR tüp alın.
    2. Tablo 1'de listelenen bileşenleri ekleyin (örneğin bir reaksiyon için).
  2. İmmünocapture
    1. Tüp kapağını sıkıca kapat. PCR tüpünü rotator veya rulo çalkalayıcıya yerleştirin.
    2. Oda sıcaklığında 90 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Çözeltinin sürekli ve nazikçe karıştırıldığından emin olun.
  3. RNA bölünmesi
    1. Kuluçkadan sonra, her tüpe 10 μL Nükleer Sindirim Güçlendirici (NDE) ve 2 μL Kesinti Enzim Karışımı (CEM) ekleyin.
    2. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetle nazikçe karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında 4 dakika kuluçka yapın.
    4. Giriş RNA kontrolünün hazırlanması
      1. İmmünopresipitasyon (IP) ve Giriş örnekleri arasında tutarlılığı sağlamak için, RNA'nın bir kısmını Giriş kontrolü olarak paralel olarak işleyin.
      2. Her örnekten 1 μg toplam RNA (%10 girdi) ayrı bir PCR tüpüne aktarın. 20 μL immüno yakalama tamponu (ICB), 1,5 μL NDE, 1 μL CEM ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçka yapın.
  4. Manyetik zenginleştirme ve yıkama
    1. PCR tüpünü manyetik bir standa yerleştirin.
    2. Tüpün 2 dakika beklemesine izin verin, ta ki çözelti berrak hale gelene ve boncuklar tüp duvarına yakalanana kadar.
    3. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.
    4. Tüpü manyetik bir standda tutun ve 150 μL Yıkama Tamponu (WB) ekleyin.
    5. Tüpü manyetik standdan çıkarın ve boncukları tamamen yeniden asmak için hafifçe ters çevirin.
    6. Tüpü manyetik standa geri getirin. Çözelti temizlenene kadar 1-2 dakika bekleyin, sonra üst maddeyi atın.
    7. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
    8. Boncukları aynı yöntemle 150 μL Protein Sindirim Tamponu (PDB) ile bir kez daha yıkayın.
  5. Zenginleştirilmiş RNA'nın serbest bırakılması ve geri kazanılması
    1. Protein Sindirim Çalışma Çözeltisi'ni Proteinaz K ve PDB'yi 1:9 oranında karıştırarak hazırlayın. (Her reaksiyon için 20 μL: 2 μL Proteinaz K + 18 μL PDB hazırlanın).
    2. Son yıkamadan sonra tüpü manyetik standtan çıkarın.
    3. 20 μL taze hazırlanmış Protein Sindirim Çalışma Çözeltisi boncuk peletine ekleyin ve nazikçe karıştırın.
    4. PCR tüpünü termal döngüye yerleştirin ve 55 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
    5. PCR tüpünü manyetik standa geri yerleştirin. Çözelti geçene kadar bekle (yaklaşık 2 dakika).
    6. Tüm süpernatantı (yaklaşık 20 μL) dikkatlice yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
      NOT: RNA artık süpernatanta. Boncukları at.
  6. RNA arındırması
    1. Her örnek tüpüne, negatif kontrol tüpüne ve giriş tüpüne 20 μL RNA Arıtma Çözeltisi (RPS) ekleyin.
    2. 160 μL %100 etanol ekleyin.
    3. Vortex RNA Bağlayıcı Boncukları onları yeniden süzüldürmek için.
    4. Her tüpe 2 μL yeniden askılanmış RNA Bağlama Boncukları ekleyin.
    5. En az 10 kez iyice karıştırın.
    6. RNA bağlanması için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
    7. Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin. Çözelti geçene kadar bekle (yaklaşık 2 dakika).
    8. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice atın.
    9. Tüpü manyetik bir standda tutun ve 150 μL taze hazırlanmış %90 etanol ekleyin. 30 saniye kuluçka yapın.
    10. %90 etanolü at. %90 etanol yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (toplamda iki yıkama).
    11. Tüpü manyetik standdan çıkarın.
    12. Kurutulmuş boncuklara 13 μL Elution Buffer ekleyin.
    13. RNA'yı elüasyon etmek için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
    14. Tüpü manyetik standa geri koyun. Çözelti geçene kadar bekle (yaklaşık 2 dakika).
    15. Tüm süpernatantı (yaklaşık 13 μL) dikkatlice yeni bir RNase-free PCR tüpüne aktarın.
    16. Hemen kullanın veya RNA'yı -20 °C'de sakla.

3. RT-qPCR

  1. m6A-zenginleştirilmiş RNA'yı cDNA'ya ters transkribe edin
    1. Ters transkripsiyon için m6A-IP, Input veya IgG grubundan arındırılmış RNA kullanın.
    2. Ters transkripsiyon (RT) reaksiyonunu kurun.
      NOT: Tüm gruplar arasında eşit RNA girdisini sağlamak için aşağı akış qPCR analizinde güvenilir karşılaştırma sağlanır.
  2. qPCR amplifikasyonu
    1. SYBR Yeşil Kimyası kullanarak qPCR reaksiyonlarını hazırlayın. Her tüpe 10 μL SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL ön primer (10 μM), 0,5 μL ters primer (10 μM), 7 μL ddH2O ve 2 μL cDNA ekleyin, iyice karıştırın ve kısa süreliğine santrifüj yapın, ardından qPCR cihazına yüklenin.
      NOT: Her cDNA örneği için üç replikasyon kuyusu ayarlayın (Giriş, IgG, m6A-IP). Astarlar listesi için Tablo 2'ye bakınız.
    2. QPCR programını çalıştır.
      1. Gerçek zamanlı termal döngücü üzerinde qPCR reaksiyonlarını şu programla gerçekleştirin: İlk denatürasyonu 30 saniye boyunca 95 °C'ye ayarlayın; 40 döngü çalıştırılır; bunlar arasında denatürasyon 95 °C'de 15 saniye, tavlama 58 °C'de 10 saniye ve 72 °C'de 30 saniye uzatma yapılır.
      2. Amplifikasyondan sonra, denaturasyonu 95 °C'ye 15 saniye ayarlayarak, 60 °C'de 1 dakika soğutarak ve ardından sürekli floresans alımı ile 0,5 °C/s rampa hızında sıcaklığı kademeli olarak 95 °C'ye yükseltirerek erime eğrisi analizi yapın; böylece amplifikasyonlu ürünlerin özgüllüğünü doğrulayın.
  3. Veri analizi
    1. Hedef ve kontrol gruplarının CT değerlerini analiz edin.
    2. Zenginleştirmeyi aşağıdaki yöntemlerden biriyle hesaplayın:
      1. Yöntemler 1: % Giriş yöntemi
        %input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        NOT: Ct (Giriş) ve Ct (IP), sırasıyla Giriş ve IP örneklerinin döngü eşik değerlerini temsil eder ve seyreltme faktörü (DF), qPCR için kullanılan giriş fraksiyonunun karşılıklıdır (örneğin, toplam RNA'nın %10'u Girdi olarak kullanıldıysa, DF = 10).
      2. Yöntemler 2: Karşılaştırmalı Ct yöntemi (2^-ΔΔCt yöntemi)
        ΔCtsample=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCt işlendi−ΔCt kontrolü, Fold=2−ΔΔCt.
        NOT: Tüm örneklerde RNA giriş miktarlarını, reaksiyon kurulumunu ve primer verimliliğini tutarlı tutun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, MeRIP-qPCR analizinin temsilci bir sonucunu, hFOB1.19 ve 143B hücrelerinde c-Myc'nin m6A modifikasyon seviyesini sunuyoruz. Şekil 2'de gösterildiği gibi, anti-m6Aantikoru ile c-Myc zenginleşmesi, sadece arka plan seviyelerini gösteren IgG kontrolüne kıyasla anlamlı derecede yüksektir; bu daanti-m6Aantikorun hem etkili hem de özgül olduğunu gösterir. Ayrıca, c-Myc'ninm6A modifikasyon seviyesinin 143B'de hFOB...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

MeRIP-qPCR, geniş uygulamalara sahip RNAm 6Amodifikasyonlarını incelemek için değerli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mekanik çalışmalar sırasında yüksek verimli dizileme sonuçlarının doğrulanması ve hedef genlerin belirli bölgelerinde modifikasyon alanlarının tam olarak yerləşdirilmesinde özellikle faydalıdır. Ayrıca, bu yöntem nispeten düşük maliyeti ve operasyonel basitliği nedeniyle çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında kolayca uygulanabilir; bu da epitrankriptomik ara...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Doğa Bilimi Vakfı (82174408, 82374477, 82474535 ve 82205145) hibeleriyle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
%100 etanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd., Amerika1158566
143BATCC, AmerikaATCC CRL-8303TM
2&Times; SYBR Yeşil qPCR KarışımıPekin Qihengxing Biyoteknoloji Şirketi, Ltd., ÇinFS-Q1002
Denovix DS-11 DenovixDS-11 Spektrofotometre
DMEM ortamıWISENT CORPORATION, Çin319-005-CL
DMEM/F-12 ortaGibco, Amerika11320033
EpiQuik CUT& RUN m6A RNA Zenginleştirme (MeRIP) KitiEpigentek, AmerikaP-9018-24
Fetal Sığır SerumuWISENT CORPORATION, Çin086-150
hFOB1.19Çin Bilimler Akademisi'nin Hücre Bankası, ÇinGNHu14
m6A RNA Metilasyon Test KitiAbcam, İngiltereAB185912
microRNA Ters Transkripsiyon KitiEZBioscience-EZB, AmerikaA0010CGQ
Gerçek Zamanlı SistemBIO-RAD, AmerikaCFX96
Toplam RNA Çıkarma KitiEZBioscience-EZB, AmerikaB0004DP
TrypLE Express EnzimiGibco, Amerika12604021

Kaynaklar

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA mm nopresipitasyonuN6 MetiladenozinRNA EkstraksiyonuProtein G BoncuklarAntikor Zenginle tirmeTers Transkripsiyon PCRRNA Fragmantasyonu
Osteosarkom Hücrelerinde Spesifik RNA Modifikasyon Seviyeleriiçin MeRIP-qPCRTesti
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.