Yöntem makalesi

İnsan Cilt Hücrelerinde Tünel Nanotüplerinin Tespit Edilmesi İçin Doku Mühendisliği Uygulamaları İçin Standartlaştırılmış Yöntem

790 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

Bu makalede

Özet

Burada, insan epidermal keratinositleri ile dermal fibroblastlar arasında tünel nanotüplerinin görselleştirilmesi için zar ve F-aktin etiketleme ile z-stack konfokal görüntüleme ile standartlaştırılmış bir protokol gösterilmiştir; isteğe bağlı olarak α-tubulin ko-boyama ile doku mühendisliği uygulamaları için tekrarlanabilir tespit ve sitoskelet karakterizasyonu sağlanmaktadır.

Özet

Tünel nanotüpleri (TNT'ler), organellerin ve sinyal yükünün uzun menzilli transferini mümkün kılan ince, aktin bazlı hücrelerarası kanallardır. Birçok hücre tipinde yaygın olarak bildirilse de, insan cilt hücrelerindeki varlıkları iyi tanımlanmamıştır. Bu makale, insan epidermal keratinositleri ile dermal fibroblastlar arasında TNT'lerin in vitro olarak tespit edilmesi ve karakterize edilmesi için standartlaştırılmış bir protokolü tanımlar. Yöntem, birincil hücrelerin ortak kültürünün hazırlanmasını, hassas TNT'leri korumak için nazik fiksasyonu, buğday tohumu agglutinini ile membran etiketlemesini, falloidin ile F-aktin boyamasını ve substratın üzerinde asılı kalan TNT'leri yapışkan filopodialardan ayırt etmek için ters konfokal mikroskopiyle sistematik z-stack görüntülemeyi içerir. α-tubulin için isteğe bağlı immünboyama, mikrotübul entegrasyonunun değerlendirilmesini sağlar. TNT'ler üç özellikle tanımlanır: iki veya daha fazla hücreyi birbirine bağlayan ince, düz çıkıntılar, F-aktin varlığı ve seri optik bölümlerde hücre çiftleri arasında süreklilik. Temsilci sonuçlar, TNT'lerin dermal-dermal, epidermal-epidermal ve dermal-epidermal çiftleri birbirine bağladığını ve değişken sitoskelet bileşimine (F-aktin tek başına veya F-aktin artı α-tubulin) sahip olduğunu göstermektedir. Kritik adımlar arasında nazik fiksasyon, taze reaktiflerin kullanımı ve yanlış sınıflandırmayı önlemek için yeterli z-düzlemlerinin elde edilmesi bulunurken, yaygın eserler arasında TNT kırılması ve eksik boyama yer alır. Bu optimize edilmiş adımlar birlikte, cilt hücresi sistemlerinde tekrarlanabilir TNT tespitini sağlar ve cilt biyolojisi ve yenilenmesinde TNT aracılı iletişimin gelecekteki araştırmaları için metodolojik bir temel sunar.

Giriş

Tünel nanotüpleri (TNT'ler), organellerin ve sinyal moleküllerinin doğrudan hücreler arası transferini mümkün kılan nano ölçekli, aktin bazlı kanallardır. Genellikle 6-100 μm uzunluğunda ve 50-500 nm çapındadır; bazıları 700nm kalınlığına kadarulaşır. Boş zar çıkıntılarının aksine, TNT'ler genellikle yapısal ritimatı sağlayan ve mitokondriyaltaşınım 2,3,4'ü destekleyen F-aktin gibi sitoskelet filamentleri içerir. İki boyutlu kültürde, TNT'ler üç özellikle tanımlanır: ince (20-700 nm), substratumun üzerinde asılı olan düz çıkıntılar ve iki veya daha fazla hücreyi birbirinden kurar; F-aktin filamentlerinin varlığı; ve yük aktarma yeteneği.

Rustom ve ark.5 tarafından PC-12 hücrelerinde ilk kez tanımlanmalarından bu yana, TNT'ler kardiyovasküler6, bağışıklık7 ve solunum8 sistemleri, korneaepiteli 9,tümörler 10 ve sinir sistemi11,12 dahil olmak üzere birden fazla sistemde incelenmiştir. Bağışıklık sinyalizasyonu, apoptoz, madde taşınımı ve anjiyogenez gibi fizyolojik ve patolojiksüreçlere katkıda bulunurlar 13,14,15. TNT'ler, mitokondriler, endoplazmik retikulum, nüklein asitler, iyonlar ve hattavirüsler 5,16,17 dahil olmak üzere çeşitli yüklerin uzun menzilli transferini aracılık edebilir.

Deri, yapısal olarak karmaşık bir organdır; epidermis ve dermis homeostaz, yara iyileşmesi ve uzantıların yenilenmesi için sürekli iletişim gerektirir 18,19,20. TNT'ler bağışıklık sistemi, nöronal sistem ve kornealepiteli 7,9,12 dahil olmak üzere birçok dokuda tanımlanmış olsa da, insan cilt hücrelerinde varlıkları yayımlanmış literatürde bildirilmemiştir. Sáenz-de-Santa-María ve ark.21 tarafından tanımlanan metodolojik çerçeve üzerine inşa ederek, epidermal keratinositler ile dermalfibroblastlar 22 arasındaki TNT'lerin tespiti için immünofluoresans boyama ile ters konfokal mikroskopi kombinasyonu kullanılarak standartlaştırılmış ve optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Alternatif TNT algılama yaklaşımlarıyla karşılaştırıldığında, bu protokol hassasiyet ve erişilebilirlik arasında pratik bir denge sunar. Canlı hücre görüntüleme TNT dinamiklerini yakalayabilir, ancak fototoksisite veTNT'ler 1,23'ün kısa ömürlülüğü nedeniyle sınırlıdır. Elektron mikroskopisi ultrastruktural detaylar sağlar ancak genellikle uzun TNT aralıklarını korumakta başarısız olur ve birincil cilt hücrelerinin rutin analizi için pratikdeğildir 24,25. Reporter tabanlı nanotüp sistemleri gerçek zamanlı takip sağlar ancak genetik manipülasyon gerektirir; bu genellikle birincil keratinositlerde ve fibroblastlarda verimsizdir 24,26. Buna karşılık, mevcut protokol standart immünoflüoresans ve konfokal mikroskopi kullanır; bağımsız hazırlanmış cilt hücresi kültürlerinde tekrarlanabilir TNT tespitini sağlarken, kırılgan birincil hücrelerle uyumluluğu korur.

Bu yöntem, özellikle sitoskelet bileşimi ve TNT yaygınlığının ilgi çekici olduğu sabit örnek analizi için uygundur. TNT'ler son derece kırılgan olduğundan, sabitleme ve işleme adımları temel sınırlamalar olarak kalır ve yaklaşım gerçek zamanlı TNT dinamiklerini yakalayamıyor. Buna rağmen, birincil insan deri hücreleriyle çalışan laboratuvarlar için bu standartlaştırılmış iş akışı, TNT'leri görselleştirmek için erişilebilir ve tutarlı bir yol sunar ve doku mühendisliği ve yenilenmesindeki potansiyel işlevlerinin sonraki çalışmalarını destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm cilt hücreleri, sünnet prosedürlerinden atılan sünnet örnekleri olarak alınan insan deri dokularından izole edilmiş dondurulmuş birincil hücrelerdi ve tamamen kimliği yokedildi 22. İnsan derisi örneklerinin alınması, Ningbo Üniversitesi Bağlı Halk Hastanesi Üroloji Bölümü'nde gerçekleştirildi ve çalışma protokolü kurumsal etik komitesi tarafından onaylandı (Protokol No. 2024104; onay tarihi: 30 Ekim 2024).

1. İnsan birincil deri epidermal keratinositlerinde ve dermal fibroblastlarda TNT'lerin tanımlanması

  1. Çözelti hazırlığı
    1. Fiksatif çözelti 1 (200 μL) için %4 PFA (100 μL), %2,5 glutaraldehit (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) ve 1x PBS (56 μL) eklenerek hazırlanın. Taze hazırlayın ve kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
    2. Fiksatif çözelti 2 (200 μL) %8 PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL) eklenerek hazırlanır. Taze hazırlayın ve kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
    3. Fiksatif çözelti 3 (200 μL) için %8 PFA (100 μL), %2,5 glutaraldehit (4 μL), 1x PBS (96 μL) eklenerek hazırlanın. Taze hazırlayın ve kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.
  2. Hücre kültürü
    1. İnsan epidermal keratinositlerini ve dermal fibroblastları 60 mm kaplarda uygun büyüme ortamı kullanılarak eritip kültürlendirin. Y-27632 ile keratinosit kültürlerini 5 μM nihai konsantrasyonda takviye edin. Kültürleri nemlendirilmiş bir kuluçka içinde 37 °C sıcaklıkta tutun, hücreler %80 birleşime ulaşana kadar.
    2. Ortamı çıkarın ve hücreleri kısa süreliğine 1 mL 1x PBS ile yıkayın (yıkama sırasında fizyolojik pH ve osmolariteyi korumak için kullanılır). PBS'yi aspire edin.
    3. 1 ml %0,05 tripsin-EDTA ekleyin, eşit şekilde dağılıp 37 °C'de 1,5-2,5 dakika kuluçka yapın.
    4. Hücreleri pipetle nazikçe yeniden süslü olarak yerleştirin. 2 mL büyütme ortamı ekleyin, 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 200 x g sıcaklığında 5 dakika santrifüj yapın.
    5. Üst yüzeyi atın ve pelleti 1-2 mL orta seviyede tekrar askıya alın. Otomatik sayaç kullanarak hücreleri sayın.
    6. Son olarak 400 μL hacimli 8 delikli oda slaytının her kuyusunda 12.000 dermal fibroblast veya 20.000 keratinosit tohumlanın. Tohumlama yaptıktan sonra, hücrelerin eşit dağılımı için odayı iyi çapraz sallayın. 37 °C'de ~24 saat kuluçka yapın.
    7. Yaklaşık 24 saatlik kuluçkadan sonra, hücre birleşimini mikroskop altında gözlemleyin. Eğer ~%80'e ulaşırsa, sonraki sabitleme adımlarına geçin.
  3. Takıntı
    1. Kültürler %80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri önceden sabitlemek için birkaç damla Fiksatif Çözüm 1'i doğrudan odaya nazikçe ekleyin. Oda sıcaklığında 4 dakika kuluçka yapın. Fiksantörün hücreleri rahatsız etmeden eşit şekilde yayılmasını sağla.
      DIKKAT: TNT'lerin kesilmesini önlemek için dikkatli kullanın. Fiksatif çözeltiler PFA ve glutaraldehit gibi toksik bileşenler içerdiği için, her zaman koruyucu eldiven, koruyucu giysi ve maske takın ve bunları duman kapüşonunda kullanın. Sonrasında ellerinizi iyice yıkadığınızdan emin olun. PFA ve glutaraldehit fiksör atıklarını tehlikeli kimyasal bertaraf için etiketli kaplarda ayrı ayrı toplayın.
    2. Ön fiksatifi aspire edin ve yerine 140 μL taze Fiksatif Çözüm 1 ekleyin, böylece tüm kuyu kaplı olur. 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın.
    3. Fiksasyonel Çözelti 1'i çıkarın ve 140 μL Fiksatif Çözelti 2 ekleyin. 37 °C'de 15 dakika kuluçka yapın. Çözeltinin hücreleri tamamen kapladığından emin olun ki sabit sabit kalsın.
    4. Fiksörü çıkarın, ardından kalıntı aldehitleri söndürmek için 140 μL 100 mM NH₄Cl ekleyin. Oda sıcaklığında 10-30 dakika kuluçka yapın.
    5. Numuneleri oda sıcaklığında 1x PBS ile 3 kez durulayın, hücrelerin yıkanmasını veya TNT'lerin kırılmasını önlemek için odanın duvarı boyunca nazikçe pipet yapın.
  4. Zar ve sitoskelet boyama
    1. Plazma zarı glikoproteinlerini etiketleyen ve membran kaynaklı TNT'lerin görselleştirilmesini sağlayan 140 μL WGA (Buğday Tohumu Agglutinin)-Alexa Fluor konjugatı ile hücreleri, oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca 1x PBS ile kuluçka yapın.
      NOT: Sonraki adımlar karanlık bir ortamda yapılmalıdır.
    2. 3 kez 1x PBS ile (her biri 30 saniye) yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1:250 (v/v) oranında 1:250 (v/v) salınmış falloidin konjugatı ile inkübe yapın.
    3. 3 kez 1x PBS ile (her biri 30 saniye) yıkayın. 140 μL DAPI çözeltisiyle oda sıcaklığında karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın.
    4. 1× PBS ile 3 kez yıkayın. 2-3 damla montaj ortamı ekleyin, oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın ve görüntülemeye kadar en az 20 dakika karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  5. Görüntüleme
    1. 40x hedefli ters konfokal mikroskopla görüntü alın. Rastgele alanlar seçin ve hücrelerin altından en üstüne doğru 10-20 katmanlı Z-yığınları toplayın. Görüntü alımı için kullanılan özel mikroskop parametreleri aşağıda listelenmiştir:
      Konfokal lazer tarama mikroskobu: ZEISS LSM 900
      Lazer çizgileri: Pist 1 (561 nm, %4,0), Takip 2 (488 nm, %16,0), Ray 3 (405 nm, %60,0)
      Dedektör kazancı: 525 V
      Z-step boyutu: 20 optik kesit (toplam derinlik: 5.32 μm)

2. Epidermal ve dermal hücrelerin ortak kültürü

  1. Keratinositler ve fibroblastlar 1.2.1-1.2.5. adımlardaki gibi hazırlayın.
  2. Her odada 10.000 keratinosit ve 6.000 fibroblast 400 μL ortamda iyi tohumlanacaktır. Tohumlama yaptıktan sonra, hücrelerin eşit dağılımı için odayı iyi çapraz sallayın. 37 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
  3. Yaklaşık 24 saatlik kuluçkadan sonra, hücre birleşimini mikroskop altında gözlemleyin. Eğer ~%80'e ulaşırsa, sonraki sabitleme adımlarına geçin.
  4. Membranları adımlar 1.3-1.4'te açıklandığı gibi sabitleyin ve boyayın.
  5. Hücreleri %0,1 Triton X-100 ile permeabilize ederek antikorların hücre içi hedeflere ulaşmasını sağlayacak şekilde oda sıcaklığında 3 dakika boyunca kullanın, ardından 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
    NOT: %0,1 Triton X-100 kullanımdan önce taze hazırlanmalıdır.
    DIKKAT: Sucul yaşama zararlı olan Triton X-100, kimyasal atık olarak da bertaraf edilmeli ve asla kanalizasyona dökülmemelidir.
  6. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için PBS içinde 140 μL %2 BSA ile blok yapın.
    NOT: %2 BSA kullanımdan önce taze hazırlanmalıdır.
  7. Gece boyunca 4 °C'de anti-sitokeratin 5 antikoru ile %2 BSA ile 1:200 (v/v) seyreltiltilerek inkübe edin.
  8. 1x PBS ile 3 kez yıkayın, ardından Alexa Fluor 594 ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında karanlıkta 1-2 saat kuluçka yapın.
  9. 1× PBS ile 3 kez yıkayın. Çekirdekleri DAPI ile boyamak ve görüntüyü 1.4.5-1.5.2. adımlardaki gibi yapın.

3. TNT'lerin sitoskelet bileşenlerinin tanımlanması

  1. Hücre kültürü
    1. Hücreleri 1.2-1.3. adımlardaki gibi kültürleyin ve sabitleyin. Oda sıcaklığında %0,1 Triton X-100 ile 3 dakika geçirimli, ardından 1x PBS ile yıkayın.
    2. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %2 BSA ile bloklayın. Anti-α-tubulin antikoru ile 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
    3. 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve Alexa Flor ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında karanlıkta 1-2 saat kuluçka yapın.
      NOT: Sonraki adımlar karanlık bir ortamda yapılmalıdır.
    4. 1x PBS ile 3 kez yıkayın. F-aktini falloidin ile etiketleyin ve 1.4.3-1.5 adımlardaki gibi görüntü
  2. Hücrelerin birlikte kültürlenmesi
    1. Ortak kültürleri 2.1-2.2. adımlarda olduğu gibi hazırlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca fiksatif çözelti 3 ile düzeltin.
    2. 140 μL 100 mM NH4Cl ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10-30 dakika kuluçka yapın. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
    3. İlk olarak, epidermal hücreleri permeabilizasyon, bloklama ve CK5 immünboyama işlemleriyle tam olarak 2.4-2.8. adımlarda tanımlandığı şekilde tanımlayın.
    4. Sonra, 3.1.2-3.1.4 adımlarını takip ederek α-tubulin immünboyama işlemi yapılacaktır.
    5. Son olarak, F-aktini falloidin ile boyandırın ve 1.4.2-1.5.2 adımlarında açıklandığı şekilde görüntülemeye devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu standartlaştırılmış protokol kullanılarak, tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) insan cilt hücrelerinde hem tek kültür hem de ortak kültür koşullarında başarıyla tanımlanmıştır. Antikor özgüllüğünü doğrulamak için, deneysel analizlerden önce tüm antikorlar için hem pozitif hem de negatif kontrol boyama yapıldı; bu, Ek Şekil 1, Ek Şekil 2, Ek Şekil 3 ve Ek Şekil 4'te gösterilmiştir. Temsilci görüntüler, TNT'lerin hücreleri birbirine bağlayan ince, aktin içe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokoldeki kritik bir adım, fiksasyon ve boyama sırasında TNT'lerin korunmasıdır; çünkü bu yapılar son derece kırılgan ve kolayca bozulur. Fiksasyon sırasında nazik müdahale, uygun zamanlama ve yeni fiksantların kullanılması TNT bütünlüğünü korumak için gereklidir. Z-stack konfokal görüntülemenin kullanımı, substratın üzerinde asılı kalan TNT'leri filopodilerden veya diğer yapışkan çıkıntılardan ayırt etmek için de aynı derecede önemlidir; aksi takdirde yanlış yorumlanmaya yol açabi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek rakip finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu proje, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 82273554) tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Ningbo Stomatoloji Hastanesi'ndeki Biyomalzemeler ve Doku Yenileme Mühendisliği Laboratuvarı'na sürekli destek için teşekkür ediyor ve hem mevcut hem de eski ekip üyelerine değerli tartışmaları için teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca Hangzhou Tıp Fakültesi Araştırma ve Deney Merkezi'nden Öğretmen Feng Li'ye konfokal mikroskopa erişimi kolaylaştıran cömert yardımı ve güçlü desteği için teşekkür etmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15-mL tüpKIRGENKG2611Steril, RNaz/Dnase ve pirojenik içermiyor
37 ve derece; C kuluçka makinesiTermo Bilimsel5103287737 derecelik CO2 kuluçka makinesi, ideal bir in vitro ortam sağlar.
Aktin-İzleyici Kırmızı-RodaminBeyotimeC2207'lerActin-Tracker Red-Rhodamine probu, floresan boya Rhodamine ile etiketlenmiş bir falloidindir; maksimum uyarılma dalga boyu 540nm ve maksimum emisyon dalga boyu 565nm'dir.
Buğday tohumu agglutinin (WGA) Alexa Fluor konjugatıMoleküler ProblarW11261  Alexa Fluor 488 Eşleme
Anti-alfa Tubulin antikoruAbcamAB7291Anti-alfa Tubulin antikoru - Loading Control (ab7291), alfa Tubulin algılayan bir fare monoklonal antikorudur. İnsan, fare, fare için uygun.
Anti-sitokeratin 5 antikor Abcamab52635Anti-Sitokeratin 5 antikoru - Sitoskelet Belirteci (ab52635), Sitokeratin 5'i tespit eden bir tavşan monoklonal antikorudur. İnsan, fare, fare için uygun.
Aqua-Poly/MountÇok bilimler18606Suda çözünebilen, floresan olmayan montaj ortamı, sulu çözeltilerden bölümlerin montajı için formüle edilmiştir. İmmünofluoresan teknikler için faydalıdır çünkü floresan lekeleri güçlendirir ve korur.
Otomatik hücre sayacıCountstarIC1000Hızlı ve hassas hücre sayımı için otomatik hücre sayacı
Tezgah üstü santrifüjBIORIDGETD5Laboratuvar ortamlarında hızlı ve verimli örnek ayrımı için tezgah üstü santrifüj
Biyolojik güvenlik kabiniTermo Bilimsel1379Biyolojik Güvenlik Dolabı, havadaki patojenleri filtreleyerek ve mikrobiyolojik çalışmalar sırasında çapraz kontaminasyonu önleyerek operatörleri, örnekleri ve çevreleri biyolojik tehlikelerden koruyan steril bir muhafaza cihazıdır.
Sığır serum albümini (BSA)YOBIBIOU5010-10gBSA, sığır serumunda bulunan ve moleküler ağırlığı 66.430 kDa ve izoelektrik noktası 4.7 olan 583 amino asit kalıntısı içeren bir globulindir
Hücre Kültürü Çanakı (60X15 mm)Eppendorf30701119İşlenmiş doku kültürü Steril, tespit edilebilir pirogenler, RNaz ve DNA, DNA.
Cellvis Chamber Slide-8 ChamberCellvisC8-1.5H-NKonfokal mikroskopi gibi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için tasarlanmıştır.
DAPI boyama çözeltisiBeyotimeC1006-10 mLDAPI Boya Çözeltisi, tüm yaygın hücreler ve dokuların nükleer boyaması için uygundur.
Keçi Fare Karşıtı IgG H& L (Alexa Fluor 405) AbcamAB175660Keçi Fare Karşıtı IgG H& L (Alexa Fluor 405), maksimum soğurma dalga boyuna 401nm ve maksimum emisyon dalga boyuna 421nm olan ikincil bir antikordur.
Keçi Anti-Tavşan IgG H&; L, Alexa Fluor 405'e konjuge edildiAbcamAB175652Keçi Anti-Tavşan IgG H&; L (Alexa Fluor 405), maksimum soğurma dalga boyuna 401nm ve maksimum emisyon dalga boyuna 421nm olan ikincil bir antikordur.
Keçi Anti-Tavşan IgG H&; L, Alexa Fluor 594'e konjuge edildiAbcamab150080Keçi karşıtı tavşan IgG H& L (Alexa Fluor 594), maksimum soğurma dalga boyu 590nm ve maksimum emisyon dalga boyu 617nm olan ikincil bir antikordur.
Ters konfokal floresans mikroskobuLeicaTCS SP8 XLeica SP8 X lazer taramalı konfokal mikroskopu, gelişmiş floresan tespiti ve canlı hücre analizi yetenekleriyle eşsiz yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunar.
Ters konfokal floresans mikroskobuAndorBC43Andor BC43, geleneksel sistemlere göre 10 kat daha hızlı görüntüleme sunan, tek tıkla 2D/3D görüntüleme yeteneğine sahip kompakt, yüksek hızlı bir konfokal mikroskoptur
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 pH düzenlemek için polar bileşik olarak amonyum klorür.
Phalloidin konjugatları Oregon GreenTM488Yaşam TeknolojileriO7466Renk: Yeşil. Uyarılma dalga boyu aralığı: 496/520.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Görevi, ortamın pH'ını fizyolojik aralıkta tutmak ve hücre içinde ve dışında osmotik basınç dengesini sağlamaktır.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlHafif denatürasyon koşullarında membran bileşenlerini onarmak için kullanılan çok yönlü bir noniyonik yüzeyaktif maddedir.
Tripsin-EDTA ÇözümüGIBCO25300054Sindirim gücü nedeniyle tripsin, hücre ayrışması, rutin hücre kültürü geçişi ve birincil doku ayrışması için yaygın olarak kullanılır.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632, ROCK-I ve ROCK-II'nin ağızdan aktif, ATP-rekabetçi bir inhibitörüdür

Kaynaklar

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Keratinosit Fibroblast Kok lt rF Aktin BoyamasBu day Germi Agl tininKonfokal MikroskopiNazik FiksasyonAlfa T bulin mm nboyamaCilt H cresi leti imi

İlgili makaleler