Bu çalışma, multipl miyelom (MM) dahil olmak üzere lenfoid malignitelerde MRD tespiti için yeni bir NGS tabanlı BCR/TCR klonalite analizini (OriMIRACLE LTM) değerlendirmiştir. Hücre hatları ve klinik yaymalar kullanılarak yapılan çalışmada, [metin burada kesilmiş] olduğu gösterilmiştir. >%90 tespit oranı ve akış sitometrisi ile %81,36 uyum sağlanmıştır. Analiz yüksek hassasiyet sunmakta, nüksü öngörmekte ve tedavi kararlarını desteklemektedir.
Araştırma makalesi
Yeni Nesil Dizileme Klonalite Analizleri: Multipl Miyelomda Minimal Rezidüel Hastalık İzlemi için Klinik Validasyon
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Minimal kalıntı hastalık (MRD) tespiti, lenfoid malignitelerin yönetimi için kritik öneme sahiptir. Bu çalışma, MRD tespiti için geliştirilmiş, yeni nesil dizileme (NGS) tabanlı özgün bir B-hücre reseptörü (BCR) ve T-hücre reseptörü (TCR) klonalite testi olan OriMIRACLE LTM'yi tanıtmaktadır. Testi, Multipl Miyelom (MM) hastalarından alınan kalıntı yaymalar da dahil olmak üzere hücre hatları ve klinik örnekler kullanarak valide ettik. BCR/TCR klonalite testi, lenfoid malignitelerde %90'ın üzerinde pozitif tespit oranı göstermiştir. MM hastalarında yapılan validasyon çalışmaları, tümör hücresi tespitinde çok renkli akış sitometrisi (MFC) ile klinik yanıt değerlendirmesi arasında %81,36 (48/59) oranında bir uyumluluk olduğunu göstermiştir. Özellikle, hem NGS hem de MFC ile MRD pozitif olan MM hastalarının %61,11'i (11/18) hastalık progresyonu veya relaps yaşamıştır. Sadece NGS ile MRD tespit edilen hastalar, daha düşük klinik tam yanıt oranları sergilemiş ve başlangıçta yanıt veren bazı MM hastaları tedavi kesildikten sonra relaps yapmıştır. Bu bulgular, bu NGS tabanlı testin, MM hastalarından türetilen kalıntı yayma örneklerinde bile lenfoid malignitelerde yüksek hassasiyet ve özgünlükle MRD tespiti sunduğunu göstermektedir. Test, MFC'ye karşı avantajlar sergilemekte ve MRD takibi için değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Sonuç olarak, mevcut kanıtlar, NGS'nin özellikle MFC⁻/NGS⁺ hastalarda daha derin bir risk stratifikasyonu sunması nedeniyle MFC'ye tamamlayıcı bir araç olarak kullanılmasını desteklemektedir. Bununla birlikte, optimal müdahale eşiğinin prospektif çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.
Giriş
Multiple myelom (MM), kemik iliğindeki aberrant klonal plazma hücrelerinin proliferasyonu ile karakterize hematolojik bir malignitedir1. Çin'de 2022 yılında yaklaşık 22.450 yeni MM tanısı konulmuş ve 17.360 ilgili ölüm gerçekleşmiştir2. Geçtiğimiz on yılda MM tedavisinde, medyan hasta sağkalım süresini önemli ölçüde uzatan ciddi ilerlemeler kaydedilmiş olsa da hastaların çoğunluğu nihayetinde relaps yaşamaktadır3,4. Bu çarpıcı artış, hassas remisyon izleminin, erken relaps öngörüsünün ve zamanında terapötik müdahalelerin kritik ihtiyacını vurgulamaktadır.
Klinik kanıtlar, hematolojik malignitelerde minimal rezidüel hastalık (MRD) durumunun prognostik önemini kesin olarak ortaya koymuştur5,6,7. Bu önemi göz önünde bulunduran Uluslararası Miyelom Çalışma Grubu (IMWG), 2016 yılında MRD değerlendirmesini yanıt değerlendirme kriterlerine dahil etmiştir8. Kemik iliği MRD değerlendirmesi için mevcut yöntemler arasında allele özgü oligonükleotid polimeraz zincir reaksiyonu (ASO-PCR), dijital PCR (dPCR), multiparametrik akış sitometrisi (MFC) ve yeni nesil dizileme (NGS) analizleri yer almaktadır8. ASO-PCR hassas saptama imkanı sunsa da, hastaya özgü primer gereksinimi nedeniyle zaman alıcıdır ve standartlaştırılması zordur9,10. Benzer şekilde, dPCR'ın kullanımı allele özgü tasarımıyla sınırlıdır10,11. MFC, hücresel düzeyde hızlı bilgi sağlayarak MRD saptamasında önemli bir araç olmuştur12, ancak standartlaştırma ve tekrarlanabilirlik konusunda zorluklarla karşılaşılmaktadır.
NGS, hastaya özgü primerlere olan ihtiyacı ortadan kaldıran, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyete sahip bir yaklaşım sunar. Hematolojik malignitelerde benzersiz immünoglobulin yeniden düzenlemelerinin güvenilir şekilde tanımlanmasını ve miktarının belirlenmesini sağlar13. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA), akut lenfoblastik lösemi (ALL), MM ve kronik lenfositik lösemi (CLL) hastalarında MRD testi için Adaptive Biotechnologies'in ClonoSEQ ürünunu onaylamıştır14,15,16. Çok sayıda uluslararası klinik kılavuz, artık NGS'yi MRD izlemi için önerilen bir yöntem olarak içermektedir. Çin MM Tanı ve Tedavi Kılavuzları (Revize 2020) da MM hastalarında yeni nesil akış sitometrisi (NGF) ve NGS gibi yöntemlerle MRD değerlendirmesini desteklemektedir17.
Bildiğimiz kadarıyla, maliyet ve zaman kısıtlamaları nedeniyle NGS teknolojisi, klinik uygulamalarda lenfoid malignitelerde MRD tespiti için tercih edilen yöntem değildir. MFC sonuçları negatif olduğunda, MRD'yi tespit etmek için genellikle ek bir kemik iliği aspirasyonu gereklidir. Bu ek işlem, hastalar üzerinde önemli fiziksel ve psikolojik yükler oluşturabilir ve potansiyel olarak yaygın klinik uygulamasını sınırlayabilir.
Bu çalışmada, NGS tabanlı bir B veya T hücre reseptörü (BCR/TCR) klonalite analizi (OriMIRACLE LTM) geliştirilmiş, karakterize edilmiş ve performansı doğrulanmıştır. Bu çalışmanın temel amaçları, rezidüel yayma örnekleri kullanıldığında bile lenfoid malignitelerde MRD takibi için bu analizin duyarlılığını ve özgünlüğünü doğrulamaktır. Bu yöntem, rutin tanıdan artan rezidüel kemik iliği yaymalarını doğrudan kullanabilmekte ve böylece yayma örneklerinin doğal kısıtlamalarını aşmaktadır. Yaymalardaki DNA; fiksasyon, boyama ve uzun süreli saklama nedeniyle fragmente olmuş olsa, aşırı düşük miktarlarda bulunsa veya kısmen degrade olsa bile, optimize edilmiş nükleik asit ekstraksiyonu ve multiplex PCR amplifikasyonu ile güvenilir immün repertuvar profilleri elde edilebilmektedir. Bu yöntem, konvansiyonel akış sitometrisi tabanlı MRD'nin alt saptama sınırını aşarak, 10⁻5 ile 10⁻6 arası bir duyarlılıkla yüksek hassasiyetli klonal takip imkanı sunmaktadır. Bu çalışma, NGS tabanlı BCR/TCR klonalite değerlendirmesinin MRD takibini iyileştirme ve MM hastaları için tedavi kararlarına ışık tutma potansiyelini vurgulayarak, klinik uygulamadaki mevcut kısıtlamalara çözüm getirebileceğini göstermektedir.
Protokol
Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu prensiplerine uygun olarak yürütülmüş ve Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Etik onay numarası: 22SC-2023011201). Çalışmaya dahil edilmeden önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
Örnek seçimi
Klinik örnekler; ALL, MM, CLL ve lenfoma dahil olmak üzere çeşitli hematolojik malignitelerle tanı konulmuş 40 hastadan elde edilmiştir. Ayrıca, kronik miyeloid lösemili hastalardan eşleştirilmiş kronik ve blast fazı örnekleri toplanmıştır. Örnekler, Aralık 2016 ile Ağustos 2022 tarihleri arasında Çin'in Jiangxi eyaletindeki Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nden temin edilmiştir. Bu spesimenler kemik iliği aspiratlarından (BMA) veya periferik kandan elde edilmiştir. Ayrıca, tamamı American Type Culture Collection'dan (ATCC; Manassas, VA) temin edilen dört lenfoid malignite hücre hattı kullanılmıştır: B-ALL hatları REH ve NALM6, T-ALL hattı Jurkat ve lenfoma hattı H9.
Analitik validasyon çalışması için, yeni tanı konmuş veya nüksetmiş 30 MM hastasından tedavi öncesi ve sonrası toplanan eşleştirilmiş klinik rezidüel kemik iliği yaymalarının bir alt kümesi dahil edildi. Karşılık gelen zaman noktalarındaki BMA örnekleri üzerinde, 4 renkli akış sitometrisi kullanılarak MFC analizleri gerçekleştirildi.
Numuneler altı farklı 4 renkli antikor kombinasyonu ile boyanmıştır (dilüsyonlar üretici talimatlarına göre yapılmıştır): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR ve K/L/CD45/CD38. Boyama işlemi 4 °C'de karanlıkta 30 dk boyunca gerçekleştirilmiş, ardından iki kez PBS ile yıkama yapılmıştır (santrifüj işlemi 4 °C'de 5 dk boyunca 500 × g hızında uygulanmıştır). İmmünohematoloji laboratuvarlarında, kemik iliğinde MFC-MRD pozitifliği şu anda 10-4 (10.000 hücrede 1 hücre) eşik değeri kullanılarak tanımlanmaktadır. Akış sitometrisi veri toplama kalitesi, ileri/yan saçılımın (forward/side scatter) görselleştirilmesi ve tüp başına en az 10.000 CD45+ olayının onaylanmasıyla doğrulanmıştır.
NGS tabanlı klonalite testi ile klonalite tespiti ve MRD takibi
gDNA, üretici talimatlarına uygun olarak ilgili kit kullanılarak 200 µL BMA, periferik kan veya tüm rezidüel yaymadan (200 µL PBS içinde yeniden süspanse edilmiş) ekstrakte edildi. Minimum 20 ng/µL gDNA konsantrasyonu ve toplam verimin ≥ 1 µg olması gerekiyordu. 1,8–2,0 A260/A280 oranı doğrulandı. Bu analiz, primerler ile lokusa özgü multipleks PCR kullanarak gDNA'yı amplifiye eder ve ardından örnek tanımlaması için amplifiye edilen reseptör dizisine bir reaksiyon özgünlük indeks barkodu eklenir. Barkodlanmış, amplifiye DNA daha sonra sekanslama kütüphanelerini hazırlamak için havuzlanır ve Illumina platformu kullanılarak NGS'ye tabi tutulur. Nihai kütüphane boyutu 350–450 bp ve konsantrasyon ≥ 5 nM Bioanalyzer üzerinde doğrulandı. Sekanslama verileri, özelleştirilmiş biyoinformatik boru hatları ve titiz kalite kontrol önlemleri kullanılarak işlenir. Okumalar, her örnek için yeniden düzenlenmiş BCR'lere veya TCR'lere atanır ve klonal reseptör dizileri halinde birleştirilir. Bu diziler daha sonra hastalıkla ilgili potansiyelleri ve sonraki takip için uygunlukları açısından değerlendirilir. Uygun kabul edilmesi için bir dizinin, verilen lokustaki tüm BCR dizilerinin en az %10'unu oluşturması ve yeterli özgünlük göstermesi gerekir. Bir dizi MRD takibi için değerlendirilirken, özgünlüğü ImMunoGeneTics (IMGT) veri tabanı (http://www.imgt.org) gibi kapsamlı bir B veya T hücresi repertuar veri tabanı ile karşılaştırılarak belirlenir. Dizinin bu veri tabanındaki frekansı, ayırt ediciliğini değerlendirmek için kullanılır. Uygun hastalıkla ilgili diziler belirlendikten sonra, MRD'yi izlemek için sonraki örneklerle karşılaştırılırlar. Dizi eşleşmeleri bulunursa örnekler MRD-pozitif (+), eşleşme tespit edilmezse MRD-negatif (-) olarak sınıflandırılır. İzlenen her dizinin konsantrasyonu nicelleştirilerek, örnek düzeyinde konsensüs malign hücre ve toplam çekirdekli hücre sayılarının hesaplanması sağlanır. Bu rakamlar arasındaki oran, bir örnekteki tümör hücresi frekansına dair bir tahmin sağlayarak hastalık progresyonu veya remisyonu hakkında değerli bilgiler sunar. En az 50 destekleyici okuma tespit edilmişse ve dizi, tanı anındaki toplam BCR/TCR repertuarının ≥%10'unu oluşturuyorsa, klonal dizi takip için geçerli kabul edildi.
İnsan kaynaklı tüm örnekler, kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabininde (BSC) biyotehlikeli madde olarak işlenmiştir. Kontamine sarf malzemeleri imha edilmeden önce otoklavlanmış (121 °C, 20 dk), sıvı atıklar ise %10'luk çamaşır suyu ile tedavi edilmiştir.
Hassasiyet ve duyarlılık çalışmaları
Saptama sınırı (LOD), sağlıklı donörlerden alınan periferik kan gDNA'sı arka planı kullanılarak klinik örnekler ve hücre hatları üzerinden belirlenmiştir. Saptamanın lineerliğini kurmak için, birkaç büyüklük sırasını kapsayan klonal frekans aralıkları oluşturmak amacıyla hücre hattı gDNA'sı normal gDNA'ya eklenmiştir. Spesifik olarak, 10 hücreden başlanarak 10 katlı seri dilüsyonlar şeklinde malign hücreler eklenmiştir: 10, 100, 1.000 ve 10.000 hücre. LOD, uyumlandırılmış probit eğrisinin %95 saptama olasılığına ulaştığı beklenen malign giriş hücresi sayısı olarak hesaplanmıştır. Gözlemlenen ve beklenen frekanslar arasındaki tutarlılık lineer regresyon kullanılarak analiz edilmiştir. Bu parametreler, sonraki değerlendirme çalışmalarında örnek düzeyindeki MRD kestirimi için sağlam bir temel oluşturmaktadır. Bu geliştirilmiş versiyon, netliği ve özlüğü artırırken akademik tonu korumaktadır. Ayrıca bilimsel terminolojinin uygun kullanımını sağlar ve yaşam bilimleri ile tıp alanındaki akademik yazım kurallarına uygundur.
İstatistiksel analiz
İki taraflı p < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Doğrusallık değerlendirilmiş ve GraphPad Prism'de Pearson korelasyon katsayısı (r) kullanılarak hesaplanmıştır. İstatistiksel analiz R dili (versiyon 3.6.1) ile gerçekleştirilmiştir. Progresyonsuz sağkalım (PFS) hesaplaması, hastanın tam yanıt (CR), kısmi yanıt (PR) veya çok iyi kısmi yanıt (VGPR) elde ettiği anda başlar ve progresif hastalığın (PD) ortaya çıkışına veya herhangi bir nedenden kaynaklanan ölüme kadar devam eder. Sağkalımı analiz etmek için Kaplan-Meier eğrisi kullanılmış ve alt gruplar arasındaki sağkalım farkını karşılaştırmak için log-rank testi kullanılmıştır. Cox analizi, hem tek değişkenli hem de çok değişkenli analizler kullanılarak yürütülmüştür.
Sonuçlar
Klonalite tespitinin işlemleme, doğrusallık ve hassasiyeti
BCR/TCR klonalite analizleri, iki tur multipleks PCR ve ardından NGS uygulamasına dayanmaktadır (Şekil 1). BCR klonalite analizleri; ayrı reaksiyonlar veya tek bir ayarlı karışık reaksiyon kullanarak IGH (VH-DH-JH veya DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde ve intronRSS-Kde) ve IGL (Vλ-Jλ) yeniden düzenlemelerinin yanı sıra BCL1-IGH ve BCL2-IGH translokasyonlarını tanımlayabilmiştir. TCR klonalite analizleri ise TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) ve TCRG (Vγ –Jγ) yeniden düzenlemelerini tespit edebilmiştir. B hücreli lenfoid malignitelerin BCR klonalitesi %93,94'lük bir tespit oranı, T hücreli lenfoid malignitelerin TCR klonalitesi ise %90,91'lik bir tespit oranı göstermiştir (Tablo 1).
Hücre hattı testlerinin sonuçlarına dayanarak, birkaç büyüklük mertebesini kapsayan geniş bir örnek giriş aralığında (0.2 µg, 2 µg ve 20 µg) doğrusallık gösterilmiştir. Doğrusallığı belirlemek için, normal gDNA'ya 10 katlık seri dilüsyonlar (10, 100, 1.0 ve 10.0 hücre) kullanılarak malign hücreler eklenmiştir. 1 ile 10-6 arasındaki klonal frekanslarda, tahmini eğimlerin 0,93–1,06 arasında olduğu gözlemlenerek doğrusallık saptanmıştır (Şekil 2A). Hem BCR hem de TCR klonalite analizlerinde LOD'un 1 ile 2 malign hücre arasında olduğu tahmin edilmiştir (Şekil 2B). Ayrıca, BCR/TCR klonalite analizleri, doku örnekleri (BMA) ve eşleştirilmiş periferik kan kullanarak lenfomadaki klonaliteyi tespit edebilmiştir (Ek Tablo 1).
MRD tespitinin doğrulanması için kullanılan hastalar ve örnekler
MRD tespitinin doğrulanması, bir hastanın örnek hasarı nedeniyle hariç tutulmasıyla birlikte, toplam 29 MM'li hastayı kapsamıştır. Çalışma popülasyonu %65,52 (19/29) erkek ve %34,48 (10/29) kadınlardan oluşmuş olup, medyan yaş 65 yıl (aralık 3–82) olarak belirlenmiştir (Tablo 2). Kohort içinde, IMWG kriterlerine göre18 hastaların %31,03'ü (9/29) yüksek riskli, %24,14'ü (7/29) standart riskli ve %37,93'ü (1/29) düşük riskli olarak sınıflandırılmıştır. Revize edilmiş multipl myelom uluslararası evreleme sistemi (R-ISS) evre I, II ve III sırasıyla hastaların %10,34'ünü (3/29), %48,28'ini (14/29) ve %20,69'unu (6/29) temsil etmiştir19.
NGS ve MFC analizlerinin karşılaştırılması
OriMIRACLE LTM ve MFC analizlerinin kantitatif doğruluğunu değerlendirmek için doğrudan ikili bir karşılaştırma yapılmıştır. Sonuçlar, özellikle 10−4 üzerindeki MRD frekanslarında, test edilen aralık boyunca benzer kantitatif doğruluk göstermiştir ve Pearson R değeri 0,73 olarak bulunmuştur (Şekil 3). 29 MM hastasından alınan 59 örnekte tümör hücreleri hem MFC hem de NGS analizleri ile tespit edilmiş ve tutarlılık %81,36'ya (48/59) ulaşmıştır. Bu tutarlılık, yöntemler arasındaki gerçek uyumdan ziyade, farklı zaman noktalarında tespit edilebilir tümör hücrelerinin varlığını yansıtmaktadır. Örnekler arasında, %62,07'si (18/29) hem NGS hem de MFC analizleri ile MRD+ olarak test edilmiş, bir hasta her iki yöntemle de MRD− olarak test edilmiş ve 1 hasta NGS ile MRD+ ancak MFC ile MRD− olarak test edilmiştir. Tutarsız tespit sonuçları olan hastalar arasında, üçünün tespit frekansı 10-4 altında, sekizinin ise tespit frekansı 10-2–10-4 aralığındaydı (Şekil 3). Mümkün olduğunca fazla DNA elde etmek için rezidüel kemik iliği yayma örneklerinden DNA ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Tedavi öncesi klonalite tespiti için ortalama 91,95 ng (10,0 ng'ye kadar) DNA girdisi test edilmiştir. Sonraki MRD testleri için ortalama 1623,39 ng (50,1–1740,0 ng aralığında) DNA ekstrakte edilmiştir (Ek Tablo 2). Bu durum, rezidüel örnek yetersiz olduğunda bile NGS'nin MRD'yi tespit edebildiğini, MFC'nin ise bazı durumlarda MRD'yi tespit edemediğini ortaya koymuştur.
Lead interval için NGS analizi ile MRD saptamanın klinik geçerliliği
Tüm MM hastalarında başlangıç aşamasında klonal diziler saptanmış ve ardından MRD değerlendirmesi yapılmıştır (Şekil 4). On sekiz hastanın NGS ve MFC saptaması yoluyla MRD+ olduğu doğrulanmıştır. Hem MFC hem de NGS ile MRD+ olan hastaların %61,1'i (1/18) sonrasında PD veya nüks geçirmiştir. Hastaların %38,89'u (7/18) çalışma süresince stabil hastalık (SD) veya PR elde etmiştir. NGS ile MRD+ ancak MFC ile MRD− olduğu doğrulanan hastaların %36,36'sı (4/1), en son klinik değerlendirmede klinik CR elde edememiştir (Ek Tablo 2). Ayrıca, klinik yanıtı CR olan tüm hastalar arasında, hastaların %37,50'si (3/8) tedavi kesildikten sonra nüks yaşamıştır. Ayrıca, primer klinik özelliklerin ve MFC sonuçlarının PFS sonucu ile ilişkisini inceledik (Ek Şekil 1). PFS'nin tek değişkenli ve çok değişkenli analizleri, bunların anlamlı şekilde ilişkili olmadığını ortaya koymuştur. Bu çalışmada, yalnızca MFC'den elde edilen MRD sonuçları analiz edildiğinde PFS'de anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir.
VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ
Hasta gizliliği kısıtlamaları ve kurumsal politikalar nedeniyle, ham veriler halka açık değildir. Toplanan verilerin bir özeti Ek Dosya 1'de sunulmuştur.
Şekil 1BCR/TCR klonalite analizi, ardından NGS'nin uygulandığı multipleks PCR işlemini içermiştir. Birinci tur PCR, lokus spesifik primerler ve örneğe özel indeksler kullanılarak yeniden düzenlenmiş immün reseptör genlerinin CDR3 bölgesini amplifiye etti ve ikinci tur PCR sırasında NGS adaptörleri eklendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2Klonallık tespitinin lineeritesi, farklı klonal frekans aralıklarında hücre hattı gDNA'sının normal gDNA'ya eklenmesiyle değerlendirilmiştir.. (A) BCR ve TCR klonalite analizlerinin lineeritesi. (B) Sağlıklı donör periferik kan gDNA'sına eklenen klinik örnekler ve hücre hatları kullanılarak tahmin edilen saptama sınırı (LOD). Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 3MFC ile NGS MRD analizi arasındaki MRD frekans ölçümlerinin ikili karşılaştırması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4MM hastalarının MRD dinamikleri ve hastaların farklı klinik durumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Numune türleri | Hayır. | Hastalık türü | Baskın klonotip | |
| Hücre hatları | REH | 1 | B-ALL | IGH, IGK |
| NALM6 | 2 | B-Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi | IGH, IGK | |
| Jurkat | 3 | T-ALL (T-hücreli akut lenfoblastik lösemi) | TCRB, TCRG | |
| H9 | 4 | Lenfoma | TCRB, TCRG | |
| Klinik B-hücreli lenfoid maligniteleri | 5 | B-ALL | IGH | |
| 6 | B-SLL (B-hücreli akut lenfoblastik lösemi) | IGL | ||
| 7 | B-ALL | IGH | ||
| 8 | B-ALL | Saptanmadı | ||
| 9 | KLL | IGH, IGK | ||
| 10 | KLL | IGH, IGK | ||
| 11 | KML-K (Kronik Miyeloid Lösemi-Kronik Faz) | IGH | ||
| 12 | BP-CML | IGH | ||
| 13 | MM | IGK | ||
| 14 | MM | IGH, IGK | ||
| 15 | MM | IGK | ||
| 16 | MM | IGH | ||
| 17 | MM | IGH | ||
| 18 | MM | IGK | ||
| 19 | MM | IGH | ||
| 20 | MM | IGH, IGK | ||
| 21 | MM | IGH, IGK | ||
| 22 | MM | IGH | ||
| 23 | Lenfoma | IGH, IGK | ||
| 24 | Lenfoma | IGH, IGK, IGL | ||
| 25 | Lenfoma | IGH, IGK, IGL | ||
| 26 | Lenfoma | IGH, IGK, IGL | ||
| 27 | Lenfoma | IGH | ||
| 28 | Lenfoma | IGH | ||
| 29 | Lenfoma | IGH, IGK, IGL | ||
| 30 | Lenfoma | IGH, IGK | ||
| 31 | Lenfoma | IGH, IGK | ||
| 32 | Lenfoma | IGH, IGK, IGL | ||
| 33 | Lenfoma | IGK | ||
| 34 | Lenfoma | IGH | ||
| 35 | Lenfoma | Tespit edilmedi | ||
| Klinik T-hücreli lenfoid maligniteler | 36 | Lenfoma | TCGR | |
| 37 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 38 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 39 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 40 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 41 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 42 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 43 | Lenfoma | TCRB, TCRG | ||
| 44 | Lenfoma | Saptanmadı | ||
Tablo 1: 4 hücre hattı ve 40 klinik örnekte BCR/TCR klonalite analizleri kullanılarak yapılan klonalite tespiti.B-ALL: B-hücreli akut lenfoblastik lösemi; T-ALL: T-hücreli akut lenfoblastik lösemi; CP-CML: Kronik faz kronik miyeloid lösemi; BP-CML: Blast fazı kronik miyeloid lösemi; CLL: Kronik lenfositik lösemi; MM: Multipl miyelom.
| Karakteristik | Toplam (N = 29) |
| Medyan yaş, yıl (aralık) | 65 (33-82) |
| Cinsiyet, n (%) | |
| Erkek | 19 (65.52) |
| Dişi | 10 (34.48) |
| Ağır zincir tipi, n (%) | |
| IgG | 14 (48.28) |
| IgA | 7 (24.14) |
| IgE | 1 (3.45) |
| Hafif zincir tipi, n (%) | |
| k | 19 (65.52) |
| λ | 8 (27.59) |
| Sitogenetik anormallik, n (%) | |
| del17p | 2 (6.90) |
| del13q14 | 9 (31.03) |
| 1q21 kazancı/amplifikasyonu | 12 (41.38) |
| t (4;14) | 2 (6.90) |
| Anormallik saptanmadı | 9 (31.03) |
| ISS evresi, n (%) | |
| I | 4 (13.79) |
| II | 13 (44.83) |
| III | 12 (41.38) |
| R-ISS evresi, n (%) | |
| I | 3 (10.34) |
| II | 14 (48.28) |
| III | 6 (20.69) |
| Eksik | 6 (20.69) |
| IMWG, n (%) | |
| Yüksek riskli | 9 (31.03) |
| Standart risk | 7 (24.14) |
| Düşük riskli | 11 (37.93) |
| Eksik | 2 (6.90) |
Tablo 2: Bu çalışmaya dahil edilen 29 MM hastasının başlangıç özellikleri. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: Uluslararası evreleme sistemi; R-ISS: revize edilmiş Uluslararası evreleme sistemi; IMWG: Uluslararası Miyelom Çalışma Grubu
Ek Şekil 1: Klinik özelliklere ve MFC sonuçlarına dayalı sağkalım analizi. (A) PFS'nin tek değişkenli ve çok değişkenli analizleri. (B) MFC sonucuna göre Kaplan-Meier eğrisi. (C) NGS sonucuna göre Kaplan-Meier eğrisi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Doku örnekleri ve eşleşmiş periferik kanda BCR/TCR klonalite analizleri kullanılarak lenfomanın klonalite tespiti.NHL: non-Hodgkin lenfoma; HGBL: yüksek dereceli B-hücreli lenfoma; FL: foliküler lenfoma; DLBCL: diffüz büyük B hücreli lenfoma; ITLPD-GI: gastrointestinal sistemin indolent T-lenfoproliferatif bozuklukları. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 2: MFC ve NGS analizlerine dayalı MRD tespit sonuçları.ND: tespit edilmedi; Parsiyel yanıt: PR; Tam yanıt: CR; Stabil hastalık: SD; Çok iyi parsiyel yanıt: VGPR. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Bu çalışmada toplanan ham verilerin özeti. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Son yıllarda lenfoid malignitelerin klinik sonuçlarında önemli iyileşmeler kaydedilmiş, bu durum sağkalım son noktalarını daha erken öngörebilen ve yeni terapilerin değerlendirmesini hızlandıran alternatif markerların arayışını tetiklemiştir20. 8.098 hastayı kapsayan kapsamlı bir meta-analiz, MM hastalarında uzun süreli sağkalımı artırmada MRD negatifliğinin güçlü prognostik değerini yeniden doğrulamıştır21. Ayrıca BCR ve TCR klonal yeniden düzenlemeleri, lenfatik sistem malignitelerinde tedavi kararlarına yön veren kritik tanısal ve MRD takip markerları olarak ortaya çıkmıştır22.
Artan kanıtlar, özellikle yeterli miktarda DNA örneği mevcut olduğunda, NGS tabanlı BCR/TCR klonalite değerlendirmesinin MFC ve PCR tabanlı analizlere göre daha üstün olduğunu desteklemektedir. NGS, daha yüksek hassasiyet ve daha basit bir standardizasyon sunar10,23,24,25,26 ve idame terapisinin başlangıcında hem PFS hem de genel sağkalım için güçlü bir prognostik faktör olarak tanımlanmıştır27.
Bu çalışmada, lenfoid malignitelerde hem BCR hem de TCR klonalitesi için %90'ı aşan bir pozitif tespit oranı sergileyen NGS tabanlı analizi geliştirdik. Analizin LOD değeri, hem BCR hem de TCR klonalite analizleri için 1 ile 2 malign hücre arasında tahmin edilmektedir; bu değer, clonoSEQ Analizi'nin 1,903 malign hücrelik LOD'u ile sağladığı yüksek hassasiyetle karşılaştırılabilir düzeydedir16. 1 ile 10-6 arasındaki klonal frekanslarda, tahmini eğimleri 0,93 ile 1,06 arasında değişen bir lineerlik gözlemledik; bu durum, gözlemlenen ve beklenen klonal frekanslar arasında güçlü bir orantı olduğunu göstermektedir. Standartlaştırılmış tespit yöntemlerinin oluşturulmasının ve laboratuvar validasyonunun tamamlanmasının ardından, analizin klinik MRD izlemi için uygunluğunu sağlamak amacıyla klinik validasyon gerçekleştirdik.
Bu çalışma, NGS tabanlı analiz ile MFC arasında %81,36 (48/59) oranında bir tutarlılık olduğunu ortaya koymuştur. Her iki yöntem de yeni tanı almış veya nüksetmiş vakalarda tümör hücrelerini belirlemede %100 duyarlılık göstermiştir. Tedavi sonrası izlem için, muhtemelen sınırlı örneklem boyutuna bağlı olarak, MFC ile değerlendirilen MRD durumu ile PFS arasında anlamlı bir korelasyon saptanmamıştır. Sonuç olarak, tüm vakaların kapsamlı bir analizini gerçekleştirdik.
Her iki yöntemle de MRD-pozitif olarak tanımlanan 18 hasta arasında, MRD sonuçları klinik yanıt değerlendirmeleriyle uyumluydu. Bu hastaların dokuzu PD veya relaps yaşadı, dördü SD'ye ulaştı, dördü PR'ye ulaştı ve biri hayatını kaybetti. Bu durum, her iki yöntemle de MRD-pozitif test sonucu veren hastalarda, PD veya relapsın neredeyse her durumda gözlemlendiğini göstermektedir. Bu veriler, hem NGS hem de MFC analizlerinden elde edilen MRD pozitifliğinin, bu hastalarda çoğunlukla sınırlı etkinlik veya kötü prognozu yansıttığını düşündürmektedir. NGS ile MRD-pozitif ancak MFC ile MRD-negatif test sonucu veren 11 hastanın %36,36'sı CR'ye ulaşamadı. Bu bulgular, MFC'nin bazı vakalarda MRD'yi tespit edemediği durumlarda bile NGS'nin, sınırlı rezidüel örneklerle dahi 10-2 ile 10-6 arasındaki frekanslarda MRD tespit etme kapasitesini vurgulamaktadır. Bu durum, MRD tespitinde NGS'nin MFC'ye kıyasla daha yüksek sensitivite ve spesifiteye sahip olduğunu daha da desteklemektedir.
Önceki araştırmalar, MFC ile değerlendirilen MRD durumunun MM hastalarında PFS ve genel sağkalımın güçlü bir öngördürücüsü olduğunu göstermiş ve otonom kök hücre transplantasyonu sonrası tedavi kararlarını yönlendirmede ve prognozu değerlendirmede MRD izleminin önemini vurgulamıştır28. Buradaki sonuçlar, hastaların MFC ile MRD-negatif ancak NGS ile MRD-pozitif olarak test edildiği iki vaka (hasta 11 ve 14) ile örneklendiği üzere, NGS analizlerinin önemini daha da belirginleştirmektedir. Bu gibi durumlarda tedavinin kesilmesinin nüks riskine yol açabileceğini belirtmek kritik önem taşımaktadır; bu da çelişkili MRD sonuçları gözlemlendiğinde tedavi yanıtının dikkatle değerlendirilmesi gerektiğini vurgulamaktadır.
Bu çalışma, mevcut NGS ve MFC yöntemlerinin taze kemik iliği aspiratlarına veya dondurulmuş hücrelere olan bağımlılığını ortadan kaldırmakta ve rutin tanı sonrası kalan, boyanmış rezidüel kemik iliği yaymalarının, yüksek hassasiyetli MRD tespiti için güvenilir başlangıç materyali olarak kullanılabileceğini ilk kez sistematik olarak doğrulamaktadır. Bu durum, doğrudan şu klinik ve metodolojik boşlukları doldurmaktadır: (1) özellikle yaşlı hastalarda veya örneklemesi zor olan kişilerde, MRD izlemi için büyük hacimlerde kemik iliği sıvısı çıkarma ihtiyacını ortadan kaldırır; (2) arşivlenmiş yaymaların retrospektif analizine olanak tanıyarak, tarihsel kohortlarda MRD tabanlı prognostik kanıtlar oluşturmak için mevcut patolojik kaynaklardan yararlanılmasını sağlar; ve (3) 10-5-10-6 tespit hassasiyeti ile geleneksel MFC'den (genellikle 10-4-10-5) çok daha üstündür ve MFC'deki örnek kalitesi sorunlarının neden olduğu yanlış negatifleri bertaraf ederek klinik uygulama için DNA tabanlı, izlenebilir bir MRD değerlendirme aracı sunar.
Analizin başarısını ve güvenilirliğini sağlamak için birkaç kritik adım belirlenmiştir. Yeterli gDNA verimi elde etmek için kalıntı yaymaların nazikçe kazınması ve ardından derhal tampon uygulanması temel gereklilikti. Alel kayıplarını veya yanlı amplifikasyonu önlemek için hassas girdi DNA miktarı (reaksiyon başına 100 ng, ±10% dahilinde) gerekiyordu. Barkodlu ürünlerin ekimolar havuzlanması (2 nM), homojen sekanslama derinliğine katkıda bulundu ve biyoinformatik eşiklerin tutarlı uygulanması (tanı anında ≥10% klonal frekans ve takip için ≤5% uyumsuzluk), yanlış pozitif MRD çağrılarını önlemeye yardımcı oldu. Ek olarak, yaygın deneysel sorunları gidermek için standart protokole birkaç modifikasyon getirilmiştir. Final kütüphane konsantrasyonu 5 nM'nin altına düştüğünde, aşırı amplifikasyon yanlılığını önlemek için dikkatli bir şekilde 2–4 ek döngü içeren ikinci bir PCR turu eklenmiştir. Aşırı uyumsuzluklar nedeniyle (>5%) klonal takibin başarısız olduğu örneklerde referans IMGT veritabanı güncellenmiş ve keşifsel analizler için uyumsuzluk toleransı geçici olarak %8'e çıkarılmıştır, ancak klinik raporlama için standart sınır %5 olarak kalmıştır. Sekanslama derinliği örnek başına 50.000 okumanın altına düştüğünde, PCR adımı tekrarlanmadan yeniden havuzlama ve yeniden sekanslama işlemleri gerçekleştirilmiştir.
Genel olarak, bu gerçek dünya doğrulaması, artık kemik iliği yayma örneklerinin çeşitli tedavi ortamlarında tutarlı ve güvenilir test sonuçları verdiğini göstermektedir. Kemik iliği biyopsisi ve MFC'nin NGS yerine rutin olarak uygulandığı ekonomik açıdan dezavantajlı bölgelerde, bulgular, başlangıç sonuçlarının negatif olduğu durumlarda ileri moleküler değerlendirme için NGS'nin düşünülebileceğini öne sürmektedir. Artık örneklerin kullanılması, tekrarlanan kemik iliği aspirasyonu ihtiyacını ortadan kaldırarak hasta yükünü azalttığı için bu tür durumlarda uygundur.
Devam eden gerçek dünya çalışmamız, daha ileri analizler için örneklem boyutunu genişletmeyi amaçlasa da, birkaç sınırlamayı kabul ediyoruz. Özellikle hasta 10 için yapılan ikinci MRD tespitinde gözlemlendiği üzere, ekstrakte edilen DNA içeriği yetersiz olduğunda yanlış negatif sonuçlar ortaya çıkabilir. Ek olarak, NGS ile tespit edilen klonların oranı hücre sayımından etkilenmekte ve bu durum MRD hücre oranlarının olduğundan fazla tahmin edilmesine yol açabilmektedir. Validasyon öncelikle kemik iliği örneklerine odaklanmıştır. Ancak, NGS-MRD'nin uzun vadeli önemi, periferik kanın daha uygun olabileceği tedavi sonrası çoklu takiplerde yatmaktadır. Periferik kan örneklerinin validasyonu henüz gerçekleştirilmemiştir. Bu gerçek dünya çalışmasındaki sınırlı klinik validasyon örneği sayısı, rastgele hasta kaydı ve çeşitli tedavi yaklaşımları nedeniyle, ardışık MRD örnekleri toplamanın zor olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, erken MRD yanıtlarının sonraki progresyonla ilişkili önemi değerlendirmeye odaklandık ve kalıcı MRD durumunun uzun vadeli sonuçlar üzerindeki etkisini kanıtlayamadık. Dahası, karşılaştırmalı analize NGF dahil edilmemiştir. NGS ve konvansiyonel MFC sistematik olarak karşılaştırılmış olsa da, IMWG tarafından önerilen iki MRD yönteminden biri olan NGF'nin (diğeri NGS'dir) kullanımı, analiz performansına dair ek bilgiler sağlayabilirdi. Ayrıca, örneklem boyutu nispeten küçüktür (n = 40) ve kohort, çeşitli hematolojik maligniteleri içeren heterojen bir yapıdadır. Sonuçlarımızı doğrulamak ve genişletmek için NGF'yi kapsayan ve multipl miyelom gibi tek bir maligniteye odaklanan gelecekteki çok merkezli, büyük ölçekli çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.
NGS tabanlı BCR/TCR klonalite analizinin performansını kapsamlı bir şekilde karakterize edip doğruladıktan sonra, bu yöntemin MM hastalarının rezidüel kemik iliği yayma örneklerinde MRD'yi nicelleştirmek ve izlemek için yüksek hassasiyetli, doğru ve pratik bir yöntem olarak potansiyele sahip olduğunu gösterdik.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu araştırma; Jiangxi Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı Doğa Bilimleri Vakfı (No. 20232BAB206059), Jiangxi Eyaleti Eğitim Departmanı Bilim ve Teknoloji Araştırma Projesi (No. GJJ211518), Jiangxi Eyaleti Sağlık Komisyonu Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (No. 202310782), Jiangxi Eyaleti Ganzhou Bilim ve Teknoloji Bürosu Rehber Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (No. GZ2020ZSF027) ve Jiangxi Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı İdaresi Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (No. 2024B0710) tarafından desteklenmiştir.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-CD19 | Abcam | AB134114 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD20 | Abcam | AB64088 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD22 | Abcam | AB32123 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD33 | Abcam | AB134115 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD34 | Abcam | AB81289 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD38 | Abcam | AB183326 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD45 | Abcam | AB40763 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD56 | Abcam | AB75813 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-CD9 | Abcam | AB2215 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| Anti-HLA-DR | Abcam | AB20181 | Üretici talimatlarına göre seyreltme |
| GraphPad Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | NovaSeq 6000 | https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html |
| ImMunoGeneTics (IMGT) veri tabanı | ImMunoGeneTics (IMGT) veri tabanı | http://www.imgt.org/ | |
| Lenfoid malignite hücre hatları | ATCC | https://www.atcc.org/ | B-ALL hatları REH ve NALM6, T-ALL hattı Jurkat ve lenfoma hattı H9 (DSMZ) |
| Çok parametreli akış sitometrisi | BECKMAN COULTER | CytoFLEX | |
| OriMIRACLE LTM analizi | Origimed Co., Ltd., Şanghay, Çin | ||
| R dili | R Foundation for Statistical Computing | versiyon 3.6.1 |
Kaynaklar
- van de Donk N, Pawlyn C, Yong KL. Multiple myeloma. Lancet. 2021;397(10272):410-27.
- Xia C, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: Profiles, trends, and determinants. Chin Med J. 2022;135(5):584-90.
- Ricciuti G, Falcone A, Cascavilla N, Martinelli G, Cerchione C. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma. Panminerva Med. 2020;62(4):220-4.
- Feng D, Sun J. Overview of anti-BCMA CAR-T immunotherapy for multiple myeloma and relapsed/refractory multiple myeloma. Scand J Immunol. 2020;92(2):e12910.
- Ontario Health. Minimal residual disease evaluation in childhood acute lymphoblastic leukemia: A clinical evidence review. Ont Health Technol Assess Ser. 2016;16(7):1-52.
- Yanamandra U, Kumar SK. Minimal residual disease analysis in myeloma: When, why and where. Leuk Lymphoma. 2018;59(8):1772-84.
- Bassan R, Brüggemann M, Radcliffe HS, Hartfield E, Kreuzbauer G, et al. A systematic literature review and meta-analysis of minimal residual disease as a prognostic indicator in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2019;104(10):2028-39.
- Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328-e346.
- Dogliotti I, Drandi D, Genuardi E, Ferrero S. New molecular technologies for minimal residual disease evaluation in B-cell lymphoid malignancies. J Clin Med. 2018;7(9).
- Drandi D, et al. Highly sensitive MYD88(L265P) mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica. 2018;103(6):1029-37.
- Camus V, et al. Digital PCR for quantification of recurrent and potentially actionable somatic mutations in circulating free DNA from patients with diffuse large B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma. 2016;57(9):2171-9.
- Riva G, et al. Multiparametric flow cytometry for MRD monitoring in hematologic malignancies: Clinical applications and new challenges. Cancers. 2021;13(18).
- Anderson KC, et al. Minimal residual disease in myeloma: Application for clinical care and new drug registration. Clin Cancer Res. 2021;27(19):5195-212.
- ClonoSEQ cleared for residual cancer testing. Cancer Discov. 2018;8(12):OF6.
- Walzer S, Krenberger S, Vollmer L, Hewitt T, Eckert B. A cost impact analysis of clonoSEQ® as a valid and CE-certified minimal residual disease (MRD) diagnostic compared to no MRD testing in multiple myeloma in Germany. Oncol Ther. 2021;9(2):607-19.
- Ching T, et al. Analytical evaluation of the clonoSEQ assay for establishing measurable (minimal) residual disease in acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and multiple myeloma. BMC Cancer. 2020;20(1):612.
- Chinese Society of Hematology. The guidelines for the diagnosis and management of multiple myeloma in China (2020 revision). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2020;59(5):341-6.
- Chng WJ, et al. IMWG consensus on risk stratification in multiple myeloma. Leukemia. 2014;28(2):269-77.
- Hagen P, Zhang J, Barton K. High-risk disease in newly diagnosed multiple myeloma: Beyond the R-ISS and IMWG definitions. Blood Cancer J. 2022;12(5):83.
- Rawstron AC, et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: Impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol. 2013;31(20):2540-7.
- Munshi NC, et al. A large meta-analysis establishes the role of MRD negativity in long-term survival outcomes in patients with multiple myeloma. Blood Adv. 2020;4(23):5988-99.
- Brüggemann M, et al. Standardized next-generation sequencing of immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations for MRD marker identification in acute lymphoblastic leukaemia: A EuroClonality-NGS validation study. Leukemia. 2019;33(9):2241-53.
- Medina A, et al. Comparison of next-generation sequencing (NGS) and next-generation flow (NGF) for minimal residual disease (MRD) assessment in multiple myeloma. Blood Cancer J. 2020;10(10):108.
- Kruse A, Abdel-Azim N, Kim HN, Ruan Y, Phan V, et al. Minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Int J Mol Sci. 2020;21(3).
- Kriegsmann K, et al. Comparison of NGS and MFC methods: Key metrics in multiple myeloma MRD assessment. Cancers. 2020;12(8).
- Takamatsu H. Comparison of minimal residual disease detection by multiparameter flow cytometry, ASO-qPCR, droplet digital PCR, and deep sequencing in patients with multiple myeloma who underwent autologous stem cell transplantation. J Clin Med. 2017;6(10).
- Perrot A, et al. Minimal residual disease negativity using deep sequencing is a major prognostic factor in multiple myeloma. Blood. 2018;132(23):2456-64.
- de Tute RM, et al. Minimal residual disease after autologous stem-cell transplant for patients with myeloma: Prognostic significance and the impact of lenalidomide maintenance and molecular risk. J Clin Oncol. 2022;40(25):2889-900.