Gualou Guizhi Antispazmodik Granüllerinin Spinal Kord Yaralanması Bir Fare Modelinde Spastisite ve PANoptoz Üzerindeki Terapötik Etkileri

Özet

Bu çalışma, Gualou Guizhi Antispasmodik Granüllerinin (GLGZ) omurilik yaralanması (SCI) kaynaklı spastisite üzerindeki etkilerini davranışsal, biyomekanik, görüntüleme ve histolojik yöntemlerle değerlendirir ve PANoptoz ile ilgili mekanizmaları inceler.

Özet

Omurilik yaralanması (SCI) sonrası kas spastisitesi, yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler ve etkili tedaviler sınırlı olur. Gualou Guizhi Antispasmodik Granülleri (GLGZ), hastanede geliştirilen geleneksel Çin tıbbı (TCM) formülasyonu, spazmları hafifletebilir. Bu çalışma, GLGZ'nin SCI kaynaklı spastisitedeki etkinliğini ve PANoptoz (apoptoz, nekroptoz ve piroptozu içeren yeni programlanmış hücre ölümü) ile ilişkisini değerlendirmeyi amaçladı.

180-200 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley fareleri kullanıldı. SCI, Allen kilo bırakma yöntemiyle indüklendi. Başarılı model fareler, rastgele bir model grubuna veya GLGZ doz gruplarından birine atandı: yüksek, orta veya düşük. Sahte fareler omurilik yaralanması olmadan laminektomi geçirdi. Müdahaleler 4 hafta sürdü. Müdahaleden sonra, uzuv motor fonksiyonu Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) ölçeği kullanılarak değerlendirildi. Femoral kas sertliği ultrason kesme dalgası elastografisi (SWE) ile değerlendirildi, omurilik bütünlüğü ise manyetik rezonans görüntüleme (MR) ile belirlendi. Histopatolojik değişiklikleri gözlemlemek için hematoksilin-eozin (HE), Nissl ve Luxol hızlı mavi boyama yapıldı. CARD (ASC, yeşil), Kaspaz-8 (turuncu) ve reseptör etkileşimli serin/treonin-protein kinaz 3 (RIPK3, sarı) içeren apoptozla ilişkili benek benzeri proteini etiketlemek için çoklu immünoflüoresans boyama kullanıldı ve PANoptoz değerlendirildi.

GLGZ, BBB puanlarını doza bağlı olarak iyileştirdi: sahte (21,00 ± 0,00), model (5,8 ± 1,1), yüksek doz (10,6 ± 1,3), orta doz (8,5 ± 1,2), düşük doz (7,1 ± 1,0). SWE, kas sertliğinin azaldığını gösterdi: model (6,68 ± 0,74 m/s), yüksek doz (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), orta doz (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), düşük doz (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) vs model. Model grubuyla karşılaştırıldığında (3,65 ± 1,03 mm²), GLGZ doz bağımlısı olarak tüm doz gruplarında omurilik lezyonu boyutunu azalttı (tüm doz gruplarında < 0,05), (yüksek dozda 1,33 ± 0,79 mm², orta dozda 1,94 ± 0,67 mm², düşük doz grubunda 2,50 ± 0,79 mm². Histoloji, GLGZ'nin nöronları korduğunu ve mielin onarımını teşvik ettiğini ortaya koydu. GLGZ doz bağımlısı olarak ASC, Kaspaz-8 ve RIPK3 ekspresyonunu azaltmıştır.

Giriş

Kas spazmı, omurilik yaralanmasının (SCI) yaygın bir komplikasyonudur ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Patolojik süreci arasında ilk mekanik hasar, ikincil iltihaplanma, oksidatif stres, apoptoz ve sinir yenilenmesinin bozulması gibi ^1,2 gibi sorunlar yer alır. Mevcut tedaviler (cerrahi dekompresyon, farmakoterapi, rehabilitasyon) sınırlı etkililiğe sahiptir ve uzun vadeli ilaçlar ilaç direnci gibi yan^{etkilere yol açmaktadır 3}. Bu nedenle, yeni mekanizmaları ve tedavileri keşfetmek kritik öneme sahiptir.

Son çalışmalar, SCI'de ikincil yaralanmanın önemli patolojik mekanizmalarından biri olarak apoptozu (kaspaz-bağımlı), nekroptozu (RIPK3/MLKL-bağımlı) ve piroptozu (kaspaz-8/GSDMD-bağımlı)⁴ entegre eden programlanmış bir hücre ölümü olan PANoptosis'i tespit etmiştir. (ASC, kaspaz-8 ve RIPK3) anormal aktivasyonu nöron kaybı ve glial yara oluşumuna yol açar, spazsiteyi daha da kötüleştirir⁵. Bu nedenle, PANoptozu hedeflemek, SCI'nin ikincil yaralanma^{zincirini kesmek} için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), çok hedefli etkiler (örneğin, anti-iltihab, antioksidan stres) nedeniyle nörolojik hastalıklar için ilgi ^{çekmiştir.6}. Gualou Guizhi antispazmodik granülleri (GLGZ), Zhang Zhongjing'in Altın Odanın Özeti'nden türetilmiş ve hastane preparatı olarak optimize^{edilmiştir 7}. Bileşenleri arasında Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube ve zencefil⁸ bulunur. Ön çalışmalar, GLGZ'nin merkezi sinir sistemi hasarı sonrası spazmları nörotransmitterleri düzenleyerek ve iltihabı inhibe ederek^{hafiflettiğini göstermiştir9}. Ancak, SCI kaynaklı spastisite üzerindeki etkileri ve PANoptoz ile olası ilişkisi henüz açıklanamamıştır.

Tek hedefli geleneksel ilaçların aksine, GLGZ'nin çok bileşenli yapısı, SCI'nin karmaşık patolojik ağıyla uyumludur — inflamasyon, nöronal kaybı, miyelin hasarı ve potansiyel olarak PANoptozu aynı anda ele alır. Bu çalışma, GLGZ'nin SCI sıçanlarında kas spastisitesini omurilik patolojik onarımını teşvik ederek (iltihabı azaltmak, nöronları korumak, mielini onarmak) ve PANoptozu inhibe ederek iyileştirdiğini öne sürmektedir. Bu hipotezi doğrulayarak, GLGZ'nin SCI için semptomları hafifletme ve temel patolojik onarımı bütünleyen umut vadeden bir tedavi olduğunu deneysel kanıtlar sunmayı hedefliyoruz.

Protokol

Hayvan modelleme
Bu çalışma, Fujian Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nin İkinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. FJPSPH-IAEC2024114) ve hayvan refahı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 180-200 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley fareleri, 22-26°C ve %40-70 nemde kontrollü koşullarda tutuldu. SCI, Allen ağırlık bırakma^{yöntemi 10} ile indüklendi: %3-4 isofluran inhalasyon anestezisi, T10'da orta hat kesi, T9-T11 segmentlerinin maruziyeti, laminektomi (dura mater sağlam) ve darbe (2 mm uç, 0,5 m/s hız, 1,3 mm derinlik, 1 s süre). Sahte fareler laminektomi yaptırıldı ve çarpmadan yapıldı. Dahil etme kriterleri: Ameliyattan 24 saat sonra BBB puanı < 8; Dışlama kriterleri: enfeksiyon, omurilik kesimiyeti. Ameliyat sonrası bakım: analjezi (buprenorfin, 0.1 mg/kg s.c., 3 gün 12 saat boyunca), mesane ifadesi (1 hafta 6 saat sürer) ve steril yara bakımı. Başarılı model fareler rastgele bir model grubuna ve yüksek (2,32 g/kg, n = 10), orta (1,16 g/kg, n = 10), düşük dozlu (0,58 g/kg, n = 10) GLGZ gruplarına atandı.

Motor fonksiyon analizi
Basso, Beattie ve Bresnahan (BBB) skorları körü körüne yapıldı. Fareler açık bir alanda 5 dakika boyunca gözlemlendi; arka ayak eklemlerinin hareketi, ağırlık taşıma, yürüyüş ve koordinasyon puanlandı.

Rectus femoris sertliğini ölçmek için kesme dalgası elastografisi
Doğrusal dizi problu Doppler ultrason sistemi (18L6) kullanıldı. Fareler yan yatma pozisyonuna (kas gevşemes) yerleştirildi. SWE, prob kas ile 90° açıda, 1-2 cm derinlikte konumlandırılarak gerçekleştirildi. İlgi alanı (ROI) 0,5 × 0,5 cm olarak ayarlandı ve her ölçüm için on çerçeve alındı. Son sertlik değeri, üç geçerli ölçümün ortalamasını temsil ediyordu. Kayma dalgası hızı (SWV) kaydedildi; Yeşil kalite kontrolü geçerli^{görüntüleri gösterdi 11}.

MRI muayenesi
MRG, 7.0T tarayıcı ile T2 ağırlıklı yağ baskısı dizisi ve hayvana özgü bir bobin kullanılarak gerçekleştirildi. Alım parametreleri şöyleydi: tekrar süresi (TR) 3.800 ms, yankı süresi (TE) 72 ms, dilim kalınlığı 1 mm, voxel boyutu 0.1 × 0.1 × 1 mm, matriks 256 × 256, görüş alanı (FOV) 25.6 × 25.6 mm, dört sinyal ortalaması ve solunum kapıları. Lezyon alanı görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü.

Histolojik boyama
HE boyama, ardışık deparafinizasyon, rehidrasyon, hematoksilin boyama 5 dakika süreli, akan suda durulama, %1 hidroklorik asit-etanol ile 30 saniye diferensiye, 2 dakika eosin boyama, dehidrasyon, temizleme ve montaj yoluyla gerçekleştirildi. Görsel bir kontrol noktası olarak, boyalı bölümlerde mavi çekirdekler ve kırmızı sitoplazma gösterildi.

Nissl boyama, %0,1 toluidin mavisi renkte 50-60 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca deparafinizasyon, rehidrasyon, kuluçka ile yapıldı, ardından damıtılmış suyla durulama, etanol farklılaştırılması, dehidrasyon, temizleme ve montaj yapıldı. Görsel bir kontrol noktası olarak, sahte grupta koyu mavi Nissl cesetleri açıkça gözlemlendi.

Luxol hızlı mavi-kresil mor boyama, deparafinizasyon, rehidrasyon, Luxol hızlı mavisinde 60 °C'de 2 saat kuluçka, %95 etanol ile durulama, 30 saniye lityum karbonatla farklılaştırma, ardından %70 etanol farklılaştırma, kresil violet karşı boyama 10 dakika yapılmış, dehidrasyon, temizleme ve montaj edilmiştir. Kresil menekşesinin çalışma konsantrasyonu %0,1'di. Görsel bir kontrol noktası olarak, sahte grupta koyu mavi miyelin gözlemlendi.

Çoklu immünfloresan boyama, deparafinizasyon, rehidrasyon ve antijen geri alımıyla başlangıç olarak sitrat tamponu (pH 6.0) ile 95 °C'de 20 dakika boyunca gerçekleştirildi. Bölümler 10 dakika boyunca %3 hidrojen peroksit ile işlendi, ardından %5 BSA ile 37 °C'de 1 saat bloklandı. Birincil antikorlar gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). PBS-T (%0,1 Tween-20, 3 x 5 dakika) ile yıkamadan sonra, bölümler HRP etiketli ikincil antikorlarla (1:1000) 37 °C'de 1 saat kuluçka edildi. Florokrom etiketleme uygulandı: ASC için YTR520 Plus, Caspase8 için TYR570 Plus ve RIPK3 için TYR690 Plus (30 dakika), ardından 5 dakika DAPI nükleer boyama yapıldı. Slaytlar monte edildi ve görüntüleme, 500 ms pozlama, kazanç 1.0, büyütme ×200 ile ayarlanmış floresan mikroskobu kullanılarak yapıldı; filtre setleri ilgili florokromlarla eşleşti.

Ksilen ve etanol için tüm işlemler bir duman kapasası içinde yapıldı ve kullanım sırasında eldiven ve gözlük takıldı. Boyama reaktifleri için doğrudan cilt teması kesinlikle kaçınıldı. Tüm atık reaktifleri belirlenmiş tehlikeli atık konteynerlerine atıldı. Biyolojik tehlikeli maddeler için, nihai bertaraf öncesinde biyolojik kontaminasyonu önlemek amacıyla kapsamlı otoklav sterilizasyonu yapıldı.

İstatistiksel analiz
Grup karşılaştırmaları için LSD ile tek yönlü ANOVA post-hoc testi kullanıldı. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

BBB puanı
Sahte grup BBB puanı 21,00 ± 0,00 olup, modelin (5,8 ± 1,1, P < 0,001) oldukça yüksekti. GLGZ doza bağlı olarak artan BBB puanları: yüksek doz (10,6 ± 1,3, P < 0,001), orta doz (8,5 ± 1,2, P = 0,003), düşük doz (7,1 ± 1,0, P = 0,028) modele göre (Şekil 1).

Rectus femoris sertliğinin kesme dalgası elastografisi analizi
Kayma dalgası elastografisi (SWE), kas sertliğindeki değişiklikl...

Tartışma

Bu çalışma, SCI olan sıçanlarda GLGZ'nin kas spastisitesi üzerindeki iyileştirici etkilerini sistematik olarak değerlendirmiş ve nörokoruma ile PANOptozis ile ilişkisini incelemiştir. Sonuçlar, GLGZ'nin SCI sıçanlarında BBB puanlarını iyileştirebileceğini ve kas sertliğini doza bağlı olarak azaltabileceğini gösterdi. Çalışma ayrıca GLGZ'nin etki mekanizmasının nöroprotektivasyon, miyelin onarımı ve PANoptoz inhibisyonu ile ilişkili olabileceğini ortaya koydu. Şu anda, SCI sonrası kas spa...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ansusuz etanol	240403A1		Susuz kalma
Ansusuz etanol	241101A1		Boyama
Antifloresans zayıflatılmış film kaplama ajanı (DAPI içerir)	MA0221		İmmünoflüoresans Boyanması
ASC Antikor	BS-6741R		PANoptoz analizi (1:300)
Kaspaz-8 Antikor	13423-1-AP		PANoptoz analizi (1:400)
Floresans mikroskobu	NIKON		ECLIPSECi-L
Tam otomatik dijital cam kaydırma tarayıcı	GCell-60		Kaydırma tarayıcı
Hematosilin-Eosin kiti	R23718		Hematoksilin-Eozin (HE) Boyama
Görüntü Analiz Yazılımı	NIH		ImageJ 1.53k
Luxol Hızlı Mavi	R23193		Luxol Hızlı Mavi-Krizil Mor Boyama
MRI Tarayıcı	Bruker		7.0T
Çoklu Flüoresans Boyanma Kiti	240522		İmmünoflüoresans Boyanması
Miyeloid boyama kiti	G3245		Miyeloid boyama
Neutral  balsam	MB9899		Boyamadan sonra montaj
Nissl boyama kiti	R23093		Nissl Boyama
RIPK3 Antikor	BS-3551R		PANoptoz analizi (1:400)
SPSS 22.0			istatistiksel analiz yazılımı
Sprague-Dawley fareleri	Fuzhou'daki Hangyi Biyoteknoloji şirketi
Tartarik asit, sodyum tripolifosfat	10019418		Boyama
Ultrason Sistemi	SIEMENS Acuson		Doğrusal dizi probu (18L6)
ksilen	240904A2		Boyama