Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor

432 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69910

⸱

16 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu deneysel protokol, lncRNA'nın koloni oluşturan testlerle birleştirerek lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki etkisini niceleyen istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir yöntem sunar.

Özet

Sapkın uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar) ifadesi, osteosarkom hücrelerinin hücresel çoğalmasını derinden etkiler ve bu hücrelerin potansiyel terapötik hedef olarak hizmet edebileceğini öne sürer. Ancak, lncRNA'ların fonksiyonel çalışmaları büyük ölçüde teorik olmaya devam etmekte ve birkaç doğrulamayla sınırlıdır. Tek hücrelerin nihai proliferatif kaderini özellikle yansıtan koloni oluşum testleri, uzun vadeli proliferatif potansiyelin değerlendirilmesinde altın standart olarak kabul edilir. Burada, bu protokol, lncRNA'nın osteosarkom hücre proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için lncRNA-knockdown hücrelerinde koloni oluşumu testleri kullanılarak güvenilir bir deneysel protokol oluşturdu. Bu deneysel protokol, lncRNA'nın osteosarkom hücre çoğalması üzerindeki düzenleyici etkilerini değerlendirmek için istikrarlı, maliyet etkin ve verimli bir test sağlar. Bu yaklaşım sadece osteosarkom hücreleri üzerine araştırmalar için uygun olmakla kalmaz, aynı zamanda diğer tümörlerde lncRNA ile düzenlenmiş hücre proliferatif kapasitesi için uygulanabilir bir araç olarak da hizmet eder. Bu çalışma, lncRNA-knockdown ve koloni oluşumu testlerinin ayrıntılı bir tespit protokolünü ve osteosarkom hücrelerinde küçük nükleolar RNA konak geni 6 (SNHG6) knockdown örneğini içeriyordu (143B). Deneysel sonuçlar, SNHG6 ekspresyonunun etkin bastırılmasını doğruladı ve koloni sayısında ve boyutunda belirgin bir azalma ile birlikte görüldü. Bu bulgular, SNHG6'nın osteosarkom hücrelerinin uzun vadeli proliferatif potansiyelini sürdürmek için hayati olduğunu göstermektedir (143B).

Giriş

Protein kodlama potansiyeli olmayan 200 nükleotidden uzun transkriptler olarak tanımlanan uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), son yıllarda çeşitli biyolojik süreçlerin önemli düzenleyicileri olarak ortayaçıkmıştır 1,2. Osteosarkom, prostat kanseri ve akciğerkanseri 3,4,5 gibi çeşitli kanserlerin başlangıcında ve gelişiminde kritik roller oynarlar. Osteosarkomda, biriken kanıtlar, anormal uzun kodlamayan RNA (lncRNA) ekspresyonunun hücresel çoğalma üzerinde derin bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Örneğin, LNCRNA POU3F3'ün susturulması, osteosarkom hücrelerinin (MG63 ve U2OS) proliferasyonunu önemli ölçüde bastırdı ve apoptozunu teşvik etti. Benzer şekilde, lncRNA HOXA-AS3'ün etkisi koloni oluşumunu azaltmış ve U2OS ile SW1353 hücrelerinde büyümeyiengellemiştir 7. Kontrolsüz proliferasyonun kanser biyolojisinin bir özelliği ve terapötik stratejilerin önemli belirleyicisi olduğu göz önüne alındığında, özellikle osteosarkomda tümörlerde lncRNA tarafından düzenlenen hücre çoğalmasının aydınlanması büyük önem ve gereklilik teşkil etmektedir.

Hücre çoğalmasını değerlendirmek için çeşitli yaklaşımlar olsa da, her biri doğuştan gelen sınırlamalar taşır. CCK-8 ve MTT gibi kolorimetrik veya metabolik testler kullanışlı, hızlı ve yüksek verimliliğe sahiptir. Ancak, esas olarak kısa vadeli okumalar sağlar ve metabolik dalgalanmalarla kolayca karıştırılır; ayrıca kullanılan reaktiflerden kaynaklanan optik veya fotokimyasal girişim riskitaşır8. BrdU ve EdU dahil olmak üzere DNA sentezine dayalı yöntemler, S-faz girişinin anlık analizleriyle sınırlı kalırken daha fazla özgüllük sunar ve uzun vadeli proliferatif sonuçlarıyansıtmaz 9,10. Benzer şekilde, Ki-67 gibi proliferasyon belirteçleri için immünboyama sadece anlık hücre döngüsü aktivitesini gösterir ve klonojenikkapasiteyi tahmin edemez 10. RTCA gibi gerçek zamanlı izleme sistemleri, yüksek tekrarlanabilirlikle sürekli büyüme eğrisi analizini sağlar, ancak yüksek maliyetleri ve kısa veya orta vadeli değerlendirme kısıtlamaları pratiklikleriniazaltır 11. Buna karşılık, klonojenik test tek bir hücrenin sınırsız çoğalma ve görünür koloniler oluşturma kapasitesini benzersiz şekilde yakalıyor ve böylece nihai kaderini doğrudan yansıtıyor. Emek yoğun ve zaman alıcı olmasına rağmen, klonojenik test, uzun vadeli proliferatif potansiyeli değerlendirmede altın standart olmaya devam eder ve kısa vadeli veya vekil testlerle ulaşılamayan içgörülersunar 12.

Burada, bu makale, 143B osteosarkom hücrelerinde SNHG6-knockdown örneğiyle birlikte lncRNA-knockdown ve koloni oluşumu testleri için ayrıntılı bir tespit protokolünü içermektedir. Bu yaklaşım sadece osteosarkom araştırmalarına uygulanmakla kalmaz, aynı zamanda diğer tümörlerde lncRNA aracılı proliferasyonun araştırılması için uygulanabilir bir araç olarak da hizmet eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Plazmid transfeksiyonu

  1. Tohum 5 × 105 143B hücre, 10 cm kültür kabı başına (toplam iki tabak), hücreler tam ortamda (DMEM + %10 FBS) 37 °C'de %5CO2 kuluçka içinde.
  2. Transfeksiyon reaktifleri 24 saat sonra hazırlayın; plazmidler (shNC ve shSNHG6), PEI ve Opti-MEM dahil.
    NOT: Vortex yapın ve hepsinin oda sıcaklığında dengelendiğinden sonra kullanın.
  3. Dört adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü çıkarın, plazmidleri (shNC ve shSNHG6) ve PEI'yi (iki tüp) işaretleyici kalemle etiketleyin.
  4. Her tüpe 500 μL Opti-MEM ekleyin.
  5. Plazmid tüpüne 10 μg plazmid ekleyin (shNC veya shSNHG6) ve her PEI tüpüne 30 μL PEI (1μg/μL) ekleyin.
  6. Yukarı aşağı nazikçe karıştırın, oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
  7. Plazmid tüpü ile PEI tüpünü birleştirin, nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka edin.
  8. İnkübatörden 143B hücre çıkarın ve kültür ortamını nazikçe aspire edin. Her yemeğe 7 mL serumsuz medium ekleyin. Ekleyecek plazmidleri belirtmek için kapları etiketleyin (143B shNC veya 143B shSNHG6).
  9. Önceden hazırlanmış transfeksiyon karışımını ilgili kültür tabakına damla damla ekleyin.
    NOT: Karışımı pipetle dairesel hareketlerle yavaşça ekleyin ve dış kenardan tabakın ortasına doğru eşit şekilde dağıtın. %5CO2 içeren bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçka yapın.
  10. Üst yüzeyi 8-12 saat sonra atın ve her 10 cm kültür kabına 10 mL tam DMEM ortamı ekleyin. Hücreleri %5CO2 inkubatörde 37 °C'de kuluçka yapın.
  11. Süpernatan atıldıktan ve tam DMEM ortamıyla değiştirildikten sonra 72 saat sonra floresan mikroskopu altında gözlemleyin.

2. Koloni oluşumu testi

  1. 10 cm kültür kabından ortamı (shNC ve shSNHG6) çıkarın, hücreleri sindirmek için 1,5 mL tripsin-EDTA ekleyin, nazikçe pipetle ayırın ve ardından sindirimi sonlandırmak için 5mL tam ortam ekleyin.
  2. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  3. 20 μL hücre askıya alın ve hücre numaralarını sayın.
    NOT: shNC grubundaki ve shSNHG6 grubundaki hücre sayılarının tutarlı olduğundan emin olmak için hücre sayısı birden fazla kez yapılmalıdır. Burada, SNHG6 devre verimliliğinin RT-PCR doğrulaması için 3 ×10-5 hücre topluyoruz.
  4. Tohum 2 × 6 kuyu için 103 hücre 6 kuyu bir plakada. Tam DMEM ortamı 2 mL nihai hacme ekleyin ve hücreleri %5CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de kültürleyin.
    NOT: Medyumu her iki günde bir taze, tam DMEM ortamıyla değiştirin.
  5. Koloni oluşumunu günlük olarak izleyin.
    NOT: Kontrol grubundaki (shNC) koloninin çoğu ≥50 hücre içerdiğinde veya kuluçkadan sonra 10-14 gün sonra, hangisi önce gelirse, kültürü sonlandırın.
  6. Kuluçka makinesinden hücreleri çıkarın ve süpernatantı atın.
  7. Hücreleri her kuyu başına 1 mL PBS ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra PBS'yi atın.
  8. Hücreleri 1 mL %10 formalin çözeltisiyle 15 dakika sabitleyin, ardından %10 formalin çözeltisini atın.
  9. Hücreleri her kuyu başına 1 mL PBS ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra PBS'yi atın.
  10. Hücreleri 1 mL %0,5 kristal mor boyama çözeltisiyle 10-30 dakika boyunca boya, ardından boyama çözeltisini atın.
  11. Hücreleri yavaşça akan musluk suyla nazikçe yıkayın.
  12. Hücreleri oda sıcaklığında hava kurut.
  13. Bir kamera ile görüntü çekin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

LNCRNA SNHG6'nın osteosarkom hücrelerinin proliferatif kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, plazmid aracılı bir knockdown sistemi başarıyla kurduk ve koloni oluşumu testleri yaptık. Deneysel iş akışı, 143B hücrelerinin plazmid transfeksiyonu ve koloni oluşumu testini içeriyordu (Şekil 1).

143B hücrelerin transfeksiyon verimliliği, transfeksiyondan 72 saat sonra floresan mikroskopisi ile doğrulandı (

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kanserle ilişkili LNCRNA'ları terapötik olarak hedefleme, onların tanısal faydalarını biobelirteç olarak kullanmanın yanı sıra, kanser yönetiminde yeni bir yaklaşımı temsil eder. Osteosarkom patogenezindeki lncRNA'ların rollerinin tanımlanması, teşhisi, tedavisi ve prognozunu ilerletmek için çok önemlidir.

Bu testin başarısını sağlamak için kritik adımlar izlenmelidir. İlk olarak, tek hücreli bir askıya alma kurulması, güvenilir klonal testler için mutlak bir ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Doğa Bilimi Vakfı (82174408, 82374477, 82474535 ve 82205145) hibeleriyle desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL MİKROTÜPLERMerckAXYMCT150C
%10 Nötr Tamponlu FormalinVICTREX5205000
100 - 1000 μ L Extended Graduated Blue TipsŞanghay BiyoBilim Şirketi, LtdBS10401ML
100mm Hücre Kültürü Çanakları laboratuvarıWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
15 mL Santrifüj TüpüŞanghay BiyoBilim Şirketi, LtdBL2002150
6 Kuyu Hücre Kültür PlakasıWuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd703001
CO2 kuluçka makinesiThermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.300583057
Kristal MorTCI ŞanghayC0428
DMEM ortamıWISENT CORPORATION319-005-CL
Eppendorf Araştırma PlusEppendorf3123000233
FBS - Üstün kaliteWISENT CORPORATION086-150
Mark kalemZebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. YYST5
Opti-MEMGibco31985070
PASTEUR PIPETİLabgicBS-XG-O3L
PBS tamponu (kuru toz)LabgicBL601A
PEIÇok bilimler24765
Pipet uçlarıMerckAXYT200Y
TrypLE Express EnzimiGibco12604021
Tripsin/EDTAGibcoR001100

Kaynaklar

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
  2. Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
  3. Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
  4. Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
  5. Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
  6. Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
  7. Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
  8. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
  9. Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
  10. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
  11. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  13. Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
  14. Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
  15. Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cre ProliferasyonuSNHG6 NakavtUzun Olmayan Kodlayan RNAFloresan MikroskobisiRT qPCR AnaliziH cre TransfeksiyonuKristal Viyole Boyama
Koloni Oluşumu Testi LncRNA Knockdown Osteosarkom Hücrelerinin Proliferatif Kapasitesini Tespit Ediyor
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.