Toprakta büyüyen köklerden salgılanan karboksilatların mekansal çözümlü örnekleme için poliakrilamid ZrOH hidrojelleri

Mirriam Chishala Chibesa; Raphael Tiziani; Tobias Reineke; Mahdi Jalali; Jakob Santner; Tanja Mimmo

doi:10.3791/69921

Method Article

Toprakta büyüyen köklerden salgılanan karboksilatların mekansal çözümlü örnekleme için poliakrilamid ZrOH hidrojelleri

DOI:

10.3791/69921

⸱

April 24th, 2026

Mirriam Chishala Chibesa¹ , Raphael Tiziani¹^,² , Tobias Reineke³ , Mahdi Jalali³ , Jakob Santner³ , Tanja Mimmo¹^,²

¹Faculty of Agricultural, Environmental and Food Sciences, Free University of Bolzano, ²Competence Centre for Plant Health, Free University of Bolzano, ³Institute of Plant Nutrition, Justus Liebig University Giessen

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, farklı tarım gelişim aşamalarında sağlam toprakta yetiştirilen köklerden kök süzülmüş karboksilatların örneklenmesi için yıkıcı olmayan, yerinde bir yöntem olarak poliakrilamid zirkonyum hidroksite hidrojellerinin (ZrOH hidrojelleri) kullanımını detaylandırıyoruz. Ayrıca, bu karboksilatların İyon Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi (IC-MS) kullanılarak sonraki lokal haritalanması ve nicelendirilmesini de belirtmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bozulmamış toprakta yetiştirilen bitki köklerinden alınan kök ekzudalarının örnekleme ve güvenilir şekilde nicelendirilmesi hâlâ zordur. Rizoboxta yetiştirilen bitki köklerinden salgılanan yedi karboksilatın (akonitat, sitrat, fumarat, laktat, malat, oksalat, süksinat) örnekleme, 2D haritalanması ve nicelendirilmesi için yıkıcı olmayan bir yöntem geliştirdik. Burada açıklanan yöntem, test edilen tüm karboksilatları alan poliakrilamid zirkonyum hidroksit hidrojelleri (ZrOH hidrojelleri) kullanır ve %95,3 ± %3,12'den %111'e ± %1,99 verimliliğiyle elüasyon yapılabilir. ZrOH hidrojelleri, çözelti pH ve karboksilat türlerine bağlı olarak 1,82 μmol ^cm-2'ye kadar yüksek bağlanma kapasitesine sahiptir; bu konsantrasyon genellikle rizosferde bulunan seviyeden daha yüksektir. Ayrıca, ZrOH hidrojellerindeki bağlı karboksilatlar stabil kalır ve analiz öncesi birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir. Uygulama için, bitkiler kök sistemine minimum bozulma ile kolay erişim sağlayan toprak dolu rizoboxlarda yetiştirilir. Kökten salınan karboksilatları örneklemek için, ZrOH hidrojelleri ilgi alanına 24 saat boyunca dikkatlice uygulanır. ZrOH hidrojelleri alındıktan sonra, haritalama amacıyla kesilir ve jel parçaları sonraki karboksilat analizi için (örneğin İyon Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi ile) elut edilir. Bulgularımız, ZrOH hidrojellerinin rizosferde karboksilat konsantrasyonlarını yakalamak ve belirlemede etkili olduğunu göstermektedir. Bu yöntemin yeniliği, sağlam toprakta yetiştirilen bitki köklerinden kök ekzudatlarını örnekleyebilme yeteneğinde ve genellikle yıkıcı olan ve yalnızca tek zamanlı örnekleme imkanı veren geleneksel yöntemlere (toprak-hidroponik hibrit yaklaşım) kıyasla zaman çözünürlüğüyle örnekleme olasılığında yatmaktadır. En önemlisi, niceliksel, yüksek çözünürlüklü, milimetre ölçeğinde 2B görüntülerin oluşturulmasını mümkün kılarak kök ekseni boyunca karboksilat süzümünün görselleştirilmesini ve rizosfer içindeki mekânsal dağılımını kolaylaştırır. Ayrıca, bu yöntem, büyüme döngüsündeki çeşitli büyüme evrelerinde kök ekzudalarının örneklenmesini kolaylaştırır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki kökleri, rizosfere çeşitli bileşikler salgılar ve bu da onların fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini^{şekillendirir.} Bitkiler abiyotik ve biyotik stres koşullarına maruz kaldığında, kök süzümü özellikle tetiklenir. Kök söküntleri, aslında, besin veya metal erişilebilirliği ve hareketliliğini, mikrobiyal toplulukları ve aktivitesini, toprak agregat stabilitesini ve bitkilerin patojenlere karşı doğrudan veya dolaylı olarak savunmasını^{etkileyebilir} ^1,2,3. En önemli kök eksüdatları arasında, besin çözünürlüğünde (fosfor (P), demir (Fe), bakır (Cu) ve çinko (Zn) dahil), ağır metal toleransı ve rizosferde faydalı mikroorganizmaların artırılmasında rolleri nedeniyle ^{karboksilatlar yer alır} 2,3,4,5.

Özellikle süzulanmış karboksilatlar arasında sitrat, laktat, oksalat, malat, süksinat ve^fumarat ^6,7,8 bulunur. Örneğin, sitrat, Fe veya alüminyum (Al) (^{hidrooksitler)} ^7,9 ile bağlı P'yi harekete geçirerek P alımında hayati bir rol oynar. Ancak, toprakta yetiştirilen bitkilerden doğru şekilde örnekleme ve kök söküntülerinin nicelendirilmesi, çoğunlukla toprakta yetiştirilen kök sistemlerine fiziksel erişim sağlama ve kök eksüdat örnekleri elde etmedeki zorluklar nedeniyle^{deneysel bir zorluk olarak kalmaktadır 10,11}. Ayrıca, süzümlenen bileşikler hızla mikrobiyal bozulmaya (dakikalar ile saatler arasında)¹² ve toprak mineral yüzeylerine güçlü şekilde adsorbe^olur ^1,10. Kök süfürasyonu çalışmalarında bir diğer zorluk, çoğu toplama yöntemi kökleri rahatsız eder veya toprakta yetiştirilen bitkilerin hasatını gerektirir, bu da aynı kökü tekrar değerlendirmeyi^{zorlaştırır} ^1,11. Bu nedenle, kök süzümlerinin doğru örnekleme, nicelik ve izlenmesi, mekânsal değişimi yakalayan ve bitki büyümesi sırasında tekrar örneklemeyi kolaylaştıran bir teknik gerektirir¹¹.

Mevcut çalışmada, Tiziani ve ^ark.12 tarafından başlangıçta sitrat için geliştirilen, şimdi daha da geliştirilen ve daha da geliştirilen ve kök köklerinden salgılanan altı ek karboksilatın (akonitat, fumarat, laktat, malate, oksalat ve süksinat) örnekleme, hassas mekansal lokalizasyonu ve nicelendirilmesi için uygulanan bir yöntem sunuyoruz. Yöntem, kök eksüdatlarının¹³ örneklenmesinde zirkonyum hidroksit bazlı poliakrilamid hidrojelleri (ZrOH hidrojelleri) kullanır. ZrOH hidrojelleri, kolayca elule edilebilen anionlar (karboksilatlar dahil) için güçlü bir bağlanma yeteneği^gösterir 12,13,14. ZrOH hidrojelleri (1), toprakta yetiştirilen bitki köklerinden kök karboksilatların örneklenmesine olanak tanır; hidrojel kök sistemine minimum bir bozulma ile yerleştirilir, (2) bağlı karboksilatları mikrobiyal mineralizasyona karşı en az 6 hafta etkili koruma sağlar, (3) karboksilatların rizosferdeki mekânsal dağılımı jel üzerine bağlandığında korunur ve (4) karboksilatların mm ölçeğinde 2D ^{haritalanmasına izin verir 12}.

Kök ekzudalarının örneklenmesi için mevcut yöntemler, toprakta yetiştirilen bitkilerden elde edilen toprak tabanlı teknikler (örneğin, kök yıkama veya toprak-hidroponik hibrit, toprak-kök eksüdat toplayıcı (SOIL-REC) cihazları, mikro emzik bardaklar, filtre kağıdı/agar levhaları, dışkı tuzakları ve RHIZOtest tekniği) veya hidroponik eksüdat örnekleme yöntemleri olarak sınıflandırılır. Kök yıkama veya toprak-hidroponik hibrit yaklaşım, tüm bitkinin topraktan dikkatlice çıkarılmasını, kök sisteminin yıkanmasını ve ardından örnekleme çözeltisine daldırarak kök^{ekzümiyetlerinin 15} toplanmasını içerir. Toprakta yetiştirilen bitkilerden ekzyut örnekleri için en çok kullanılan yöntemdir, çünkü sadeliğidir. Ancak, köklerin topraktan çıkarılması, kök tüylerinin ve daha ince köklerin kaybı riski taşır. Ayrıca, köklerin kapsamlı temizlenmesi gereklidir; bu da köklere zarar verebilir, kök süzümlerinin kalitesi ve miktarını bozabilir ve zamanla belirlenmiş örnekleme ^8,11 yapılmasını engeller. SOIL-REC yöntemi, bitkilerin özel tasarlanmış bir rizobox sisteminde yetiştirilmesini ve kök eksütü toplama aracı kullanılarak (30 μm ≤ kök eksüdaları toplama aracı^{kullanılarak} ^{toplanmasını içerir}. Bu yaklaşım kök sistemini korur, toprak kirliliğini en az tutar ve kök eksütülerinin tekrar toplanmasını mümkün kılar. Ancak, karmaşık bir yapısı vardır (sadece az sayıda çoğaltma ile), örnekleme için kullanılan daha büyük hacimlerden çıkan ekzudatların daha yüksek seyreltilmesi ve yine de optimizasyon gerektirir; çünkü tekrarlanabilirliği zordur ve çoğaltmalar^{arasında büyük farklılıklar vardır 8}.

Erişilebilen sağlam toprakta yetiştirilen köklerin ilgi gören kök segmentlerine (örneğin, rhizobox veya kök pencereleri kullanılarak) çevredeki çözeltiyle dengelenebilen küçük reçine parçaları, agar jel levhaları veya filtre kağıdı ^{uygulanır.18,19}. Bu yöntem, düşük mekansal çözünürlükle birlikte alınan zaman çözünürlüğüyle örnekleme ve yerel eksyut bileşiminin kısmi ölçümü sağlar. Öte yandan, mikrobiyal mineralizasyondan kaynaklanan artefaktlara karşı hassastır ve kullanımı zahmetlidir. Benzer şekilde, eksüdat tuzakları, tek bir kökün yatay yan odalarda hapsedildiği ve örnekleme çözeltisini içeren kapalı Perspex halkaları ile mühürlenmiş Perspex halkaları ile örnekleme parçalarından örneklemek için kullanılır; bu halkalar yerel^{olarak konumlandırılmıştır 8}. Yöntem hem hidroponik hem de toprakta yetiştirilen köklere uygulanabilir ve yerel örnekleme¹² sağlar. Ancak, düşük hacimler toplanır, zamanla çözümlü örnekleme neredeyse imkansızdır ve bireysel köklerin izole edilmesi mekanik strese hassastır; bu da kök metabolizmasını ve süfürasyonu^{etkileyebilir 8}. Mikro emzik kaplar rizosferde toprak çözeltisi toplamak için kullanılır; böylece toprakta yetiştirilen köklerden yerinde örnekleme^{yapılabilir 20}. Ancak, küçük hacimler toplanır, örnekleme kısmen zamanla çözülür ve eksüdatlar adsorbsiyon ve mikrobiyal bozulmaya yatkındır¹⁶. RHIZOtest tekniği, köklerin hidroponik olarak küçük silindirlerde büyütülmesini ve altının 30 μm naylon bir ağla kaplanmasını içerir; böylece kök ile toprak arasında çözünen^{değişimi sağlanır} ^8,21,22. Ekzudatlar, kök matı örnekleme çözeltisine batırılarak toplanır. Bu yöntem kökler ve toprakla temas sağlar ancak yapay büyüme koşulları kullanır. Kısa vadeli deneylerle sınırlıdır ve zaman çalınımlı örnekleme yoktur. Bu yöntemler arasında sadece reçineler, agar jel levhaları, filtre kağıdı, süfürasyon tuzakları ve mikro emzik kaplar mekansal süflenme desenlerini belirlemek için kullanılabilir.

Hidroponik eksüdat örnekleme yöntemleri hidroponik ve yarı-hidroponik teknikleri kapsar. Hidroponik, kök eksüdatlarının toplanmasında sıkça kullanılan ve doğrudan bir yöntemdir; burada bitkiler bir besin çözeltisinde yetiştirilir ve ardından bir örnekleme çözeltisi (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, mikropur) ile değiştirilerek eksüdat^{örnekleri elde edilir 15,23}. Yöntem basittir ve köklere minimum mekanik baskı uygular. Gerekirse son derece tekrarlanabilir ve sterildir, bu da kök eksüdatlarının kalitesini artırır ve zaman çözünürlüğüyle örnekleme^{mümkün kılmaktadır} ^5,16. Buna rağmen, bitki fizyolojisini, morfolojisini (örneğin, kök tüylerinin gelişimi) ve kök dışkı süreçlerini değiştirebilen son derece yapay^{bir sistemdir} ^6,15. Yarı-hidroponikte, bitkiler cam boncuklar, kum veya sürekli süzülen besin çözeltisi ile vermikülit üzerinde yetiştirilir ve süzücüler ^8,18 süzme^{çözeltisinde} toplanır. Bu yaklaşım, hidroponiğe kıyasla biraz daha az yapay olup zaman çalınımına izin verir. Ancak sistem neredeyse tamamen suya doygundur ve bu nedenle kısmen anaerobik koşullara toleranslı bitkiler gerektirir.

Alternatif yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, ZrOH hidrojel yöntemi çeşitli avantajlar sunar. ZrOH hidrojelleri, kök eksüdatlarının doğal koşullara yakın toprak kültüründe (doğal koşullara yakın) en az bozulma ile örneklenmesine, bitkinin yaşam döngüsünde zaman çalınmasına ve mikrobiyal bozulmanın azalması ve yüksek karboksilat bağlanma kapasitesi¹² sayesinde kök eksüdatlarının 24 saatten fazla toplanmasına olanak tanır. Ayrıca, hidrojelleri örneklemek veya korumak için biyosid (örneğin mikropur,_{NaN 3}) gerekmez; bu hidrojeller uzun vadede analitik cihaz üzerinde potansiyel etkiye sahip ve kimyasal analizi engelleyebilir. Bunun nedeni, karboksilatların kimyasal olarak ZrOH hidrojeline bağlanmasıdır. Ayrıca, örnekler analiz öncesinde birkaç hafta ila ay boyunca saklanabilir ve bu nedenle tek bir deneysel^{düzen 12'den} birçok örnek alınabilir ve bu, hidrojel 24,25'teki Zr'nin antimikrobiyal özelliklerine bağlanabilir. Ayrıca, ZrOH hidrojelleri, rizosferdeki süzümlenen bileşiklerin ve diğer anyonların 2D milimetre çözünürlükte haritalanmasını sağlar ve tüm kök^sisteminin 12,14,26 örneklenmesi imkânı sağlar. ZrOH hidrojelleri, klasik yöntemlerle genellikle dondurucuda saklanan büyük hacimlere (-20 °C) kıyasla buzdolabında daha az depolama alanı (4 °C) kaplar. Ana sınırlama, minimum veya hiç hava kabarcıkları olmadan yüksek kaliteli ZrOH hidrojelleri üretmeye alışmak ve rizoboxların yapay yetiştirme ortamı sistemleri olarak kalmasıdır. Bir diğer sınırlama ise, yöntemin yalnızca yedi karboksilat (akonitat, sitrat, fumarat, laktat, malat, süksinat ve oksalat⁾¹², sülfonamidler (sülfadiazin, sülfatametazin, sülfakloropiridazin ve klindamisin)²⁷ ve inorganik anyonlar (P, V-vanadium, As-arsenik, Se-selenyum, Mo-molibden, Sb-antimon) sülfür ve oksiyanyonları için geliştirilmiş olmasıdır^. ZrOH hidrojel, askıda bulunan partikül reaktif – iminodiasetik asit ile birlikte rizosferde (Al, Fe, Ca-kalsiyum, Mg-magnezyum, Mn-manganez, Ni-Nikel ve Zn-Çinko) kasyonları (Al, ^Fe, Ca-kalsiyum, Mn-manganez, Ni-Nikel ve Zn-Çinko) ile birlikte kullanılmıştır^.

Burada, toprakta yetiştirilen kök sistemlerinden karboksilatların zaman ve mekansal olarak çözülen, yerinde örneklemesini sağlayan ZrOH hidrojel tabanlı bir yöntem sunuyoruz. Kök eksüdatlarının örnekleme ve ZrOH hidrojel tekniğiyle 2D haritalanması dahil olmak üzere rhizobox deneyinin nasıl yapılacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz. Bu süreç, hidrojel hazırlanması, rizokutu doldurma, bitki yetiştiriciliği, hidrojel uygulaması, geri alma ve kesme, hidrojelden karboksilat elüsyonunu ve analizi kapsar ve ardından 2B görüntü üretimi devam eder. Ayrıca, iyon kromatografisi-kütle spektrometrisi (IC-MS) kullanılarak karboksilat analizi gibi kritik adımlar hakkında notlar da verilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ZrOH hidrojel hazırlığı

NOT: Jel hazırlamada kontaminasyonu önlemek için temiz bir ortam ve malzemeler gereklidir. Çözeltileri hazırlarken, jel durulama ve kalite güvencesi için nemlendirme için sadece laboratuvar grade I suyu (≤18 MΩ·cm) kullanın. Hidrojel hazırlığına başlamadan önce zehirli atık kaplarının (sıvı ve katı) duman davlumbazlığına önceden yerleştirildiğinden emin olun. Jelleri hazırlamaya başlamadan önce fırını yaklaşık 42─45 °C'ye kadar 1 saat boyunca ısıtın. Malzemeler ve kimyasallarla ilgili detaylar Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir.

Cam montaj hazırlığı
1. Buharlı bir davlumbonda 153,8 ml %65 HNO₃ ile 846,2 mL laboratuvar grade I suyu ekleyerek %10 (w/v) HNO₃ asit banyosu hazırlayın.
2. Cam plakaları (6,1 x 17 cm), cımbızları, Teflon U şeklindeki ara parçaları (0,25 mm veya 0,4 mm) ve plastik klipsleri en az 4 saat asit banyosunda bekletin.
3. Cam plakaları, cımbızları, plastik klipsleri ve Teflon ara parçaları asit banyosundan çıkarın ve ardından laboratuvar kalitesi I suyla en az üç kez yıkayın. Sonra laminar akış veya temiz tezgahta iyice hava kurumasına izin verin.
  NOT: Cam tabaklar jel hazırlama ile aynı gün hazırlanmalı ve kirlenmeyi azaltmak için kağıtla kurutulmaktan kaçınılmalıdır.
4. "U" şeklindeki ara parçayı kuru cam plakaya yerleştirin, ikinciyi ekleyin ve klipslerle birbirine sabitleyin. Pipetleme kolaylaşması için cam plakaları yaklaşık ~1 mm kaydırın (bkz . Şekil 1A).
5. Cam plaka montajını, jel çözeltisi dökmeden önce film kapağının altına temiz bir plastik folyo üzerine koyun.
Poliakrilamid jel^{hazırlama 31}
1. Jel çözeltisi: 100 mL jel çözeltisi, 15 mL Difüzyon Gradientleri ince filmler (DGT) jel çapraz bağlayıcıda 47,5 mL laboratuvar seviyesi I suyu ile temiz plastik bir şişede karıştırarak hazırlanın ve ardından 37,5 mL akrilamid çözeltisi (%40) ekleyin. Her çözelti eklendikten sonra karışımı iyice karıştırın. Jel çözeltisi en az üç ay buzdolabında (4 °C) saklanabilir.
  NOT: Her çözeltinin doğru miktarını pipet/tartma yapın ve sadece bis-akrilamid olmadan akrilamid çözeltisi kullanın, çünkü bu 2-(N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) tamponuna yerleştirildiğinde yumuşak jeller üretir.
2. %10 (w/v) amonyum persülfat (APS) çözeltisi hazırlamak için 0.1 g APS'yi 1 g H₂O içinde çözünürtün. Çözeltiyi her gün taze hazırlayın ve kullanımdan önce tamamen çözündüğünden emin olun.
3. 4 mL jel çözeltisini 28 μL %10 APS ile karıştırarak bir jel kokteyli hazırlayın ve ardından temiz plastik şişelere 10 μL %99 N,N,N'N'-Tetrametilletilendiamin (TEMED) ekleyin. Her çözelti eklendikten sonra karıştırın. Karışım hızla polimerize olurken çözelti 3 jele kadar hazırlanabilir. Bir kokteylin hacmi, kullanılacak plaka ve ara parçaların boyutuna göre ayarlanabilir.
  NOT: Çeşitli reaktifleri karıştırırken kabarcık ve köpükten kaçının.
4. Cam plaka montajı arasındaki jel karışımını ortadan yavaşça pipetleyin; Şekiller 1B,C^26'da gösterildiği gibi. Hava kabarcıkları varsa, cam panelini nazikçe eğerek veya cam plakalara kalemle vurarak onları çıkarın.
  NOT: Köpükten arınmayan jeller elde etmek için, çizilmiş cam plakaları kullanmaktan kaçının ve kullanımdan sonra asit banyosunda saklayın; bir sonraki kullanımdan önce yıkamak, polietilen torbalarda saklamak yerine yıkamak için kullanın. 1 mL veya 5 mL pipet kullanarak jeli küçük bir uçla dökün ve jel kokteylini ortadan yavaşça ekleyin, böylece plakalar 45° açıda eğildiğinde eşit şekilde yayılsın.
5. Montajı önceden ısıtılmış fırına yerleştirin ve jelin tamamen sertleşmesini sağlamak için en az 1 saat 42─46 °C sıcaklığında tutun (sıvı damlaması).
6. Temiz, passız bir jilet bıçağıyla montajı köşelerden nazikçe kaldırın ve jelleri laboratuvar kalite I suyla yıkama şişesinde yıkayın (Şekil 1D–F). Jelin kolayca çıkarılması için birkaç dakika suyla islatın ve ardından laboratuvar sınıfı I suyu içeren 1-L bir beakerde yıkayın.
  NOT: Jeli cımbızla çekmekten kaçının, çünkü plakaya yapışırsa, bu jel deformasyonuna yol açabilir. Polimerizasyondan sonra, görünür olan baloncuklar genellikle jelin içinde değil, jel ile cam plaka arasında bulunur; plaka çıkarıldığında bu tabaka netleşir.
7. Kalan polimerizasyon kimyasallarını yıkamak için suyu hidrasyondan sonraki 24 saat içinde (tercihen hazırlıktan sonra 2 saat aralıklarla) en az 3–4 kez değiştirin. Hidrasyon sırasında suyun tekrar tekrar değiştirilmesiyle, reaksiyona girmemiş reaktifler gibi safsızlıklar dışarı dağıtılır ve pH düşürülür, böylece jel içinde yük birikmesi önlenir.
8. Jeller, jel yaprakları hemen ZrOH çökeltmesi için kullanılmıyorsa laboratuvar grade I suyla (yaklaşık 24 saat kısa süreli) veya 0.01 mol ^L-1 NaCl veya NaNO₃ (4 °C) buzdolabında saklanmalıdır. Bu jeller, yağıntıdan önce NaCl'de 1 aya kadar saklanabilir.
  NOT: Polimerizasyondan hemen sonra jellerin çökelmesini öneririz, böylece yıkama sırasında oluşabilecek kontaminasyonu en aza indirebiliriz.
ZrOH jellerinin^{çökeltmesi 14}
1. 3,22 g zirkonyum diklorür oksit oktahidrat (ZrOCl_2.8H ₂O) 40 mL laboratuvar grade I suyunda 250 mL plastik bir beakerde çözün.
2. En fazla 4 jel tabakası yerleştirin ve 100 mL'ye kadar doldurun. Alternatif olarak, 1.66 g ZrOCl_2.8H ₂O 20 mL laboratuvar grade I suyunda çözüp, 2 jel koyup 50 mL'ye kadar doldurun.
3. Jel yapraklarını en az 2 saat bekleterek Zr'nin jellerde eşit dağılımı sağlanır.
4. Her jeli, çökeltme için pH 6.7'de (pH 1 mol ^{L-1 NaOH} ile ayarlanır) tamponlanmış 100 mL 0,05 mol ^L-1 2-(N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) içine aktarın. Homojen çökeltme elde etmek için jeli ilk 30-60 saniye boyunca cımbızla nazikçe karıştırın.
5. Zr(OH)_4'ün jelde tam çökelmesi için ≤100 rpm'de bir plaka çalkalayıcıda 40 dakika boyunca nazikçe sallayın.
  NOT: Jellerin birbirine yapışmasını önlemek için daha yavaş sallama hızı tercih edilir.
6. Jelleri laboratuvar grade I suyu, 1─2 L bir bedekte 24 saat boyunca yerleştirin, böylece ^Cl-ion çıkarılır ve suyu en az 3 kez, 2 saatlik aralıklarla³² kez değiştirin. ^Cl-ionların kapsamlı şekilde alınması, durulama çözeltisinin iletkenliği ölçülerek veya klorür testi yapılarak kontrol edilebilir.
7. Jeli 0.03 mol ^L-1 NaNO₃ veya NaCl içinde saklayın, ancak NaCl toprak deneylerinde tercih edilir çünkü nitrat hızla toprak mikrobiyal aktivitesini artırır ve aynı zamanda önemli bir bitki besindir^13,32.
8. ZrOH hidrojelleri 60 haftaya kadar test edilmiş (buzdolabında 4 °C sıcaklıkta saklanır) ve özelliklerini ve iyi performanslarını (hedef değerlerin %10'u ±%10) koruduğu ^{gösterilmiştir.32}.
Jel kesim
1. Çizilmemiş pleksiglas plakayı, cımbızları ve keskin, passız bir jilet bıçağını temizleyin. Pleksiglas plaka yoksa, kalın ve sağlam herhangi bir cam plaka kullanılabilir.
2. ZrOH hidrojel levhalarının yayılmasına yardımcı olmak için plexiglass plakayı laboratuvar grade I suyla nemlendirin.
3. ZrOH hidrojel levhasını pleksiglas plakanın üzerine cımbızla yayarak düz ve kabarcık olmadan emin olun. Levhalarda delik olan bölgeleri belirleyin; bu alanlar kesim sırasında kaçınılmalıdır.
4. ZrOH hidrojel levhalarını keskin bir jilet bıçağıyla istenen boyuta doğru kesin. Kesimden sonra plakadan suyu çıkarmak, kesilmiş bölümleri net şekilde görmeye yardımcı olur.
  NOT: 2D haritalama için kenarların daha kolay tanımlanması için, ZrOH hidrojel parçalarını dik açı bir trapezyuma kesmeyi öneririz; en uzun taraf sol üstte yer alır.
5. ZrOH hidrojellerini laboratuvar grade I suyunda (kısa süreli depolama için ve jel uygulamasından hemen önce) veya uzun süreli depolama için 0.03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl (>24 saat) içinde sakla.

2. Rhizobox deney kurulumu

NOT: Bitkiler, tasarımları farklılık gösteren toprak dolu rizoboxlarda yetiştirilir. Sulama kolaylaştırmak ve eşit su dağıtımını sağlamak için alt veya arka kısmında delik(ler) bulunan rizoboxlar kullanmanızı öneririz (bkz. Ek Şekil 1). Malzemeler ve kimyasallar hakkında detaylar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Rhizobox dolum ve su tutma kapasitesi^{belirlemesi 26}
1. 2 mm elek kullanarak hava ile kurutulmuş toprak süzme ve toprağı homojenleştirin. Orta dokulu toprak kullanmanızı öneririz, ancak belirli işlem teknikleri (örneğin, rhizobox tipi, doldurma, açılma ve sulama) tabii kumlu veya kil toprak da kullanılabilir.
2. Rizobox'un (boş) tüm bileşenlerini, kelepçeler ve plastik folyoyla birlikte tartın ve ağırlığı kaydedin (bkz. Ek Şekil 2C). Su tutma kapasitesini (WHC) belirlemek için gerekli sayıya 2–3 ekstra rizobox ekleyin.
3. Rizobox'u doldurmak için gereken kuru toprak kütlesini tahmin edin. Genellikle, rizobox üst kısmın 2 cm altına kadar doldurulur. Önerilen hacim yoğunluğu yaklaşık 1,0–1,4 g ^cm-3 arasındadır.
4. Rhizobox'un türüne ve kullanışının kolaylığına bağlı olarak, rizobox'u dikkatlice kuru toprakla doldurun. Doldurma sırasında ve sonrasında, toprak sıkışmadan düz bir plaka ile düzleştirilebilir. Hafif nemli toprak da rhizobox'u doldurmak için kullanılabilir, özellikle ince dokulu veya ağır kil topraklar için toprak yapısını koruyabilir (ayrıntılı açıklama için Wagner ve ^ark.26'ya bakınız).
5. Alternatif olarak, rhizobox üstten doldurulursa, plastik folyoyu rhizobox'a sabitleyin, ön plakayla örtün ve sonra kelepçeyle kapatın ( bkz. Ek Şekil 2A–D).
6. Konforluk için, dolgu sürecinde bir çekirdek por zarı kurulabilir ve yüzeyde düz durduğundan emin olun. Kök eksüdatları örneklerken bir çekirdek por zarı gereklidir.
7. Toprak dolu rizoboxların ağırlığını kelepçelerle birlikte kaydedin. Her rizoboxun kuru toprak kütlesini (m_{kuru toprak}) boş rizoboxların ağırlığını toprak dolu olanlardan çıkararak hesaplayın ve ağırlığı kaydedin.
8. Su tutma kapasitesi, önce rizoboxların deionize su ile doygunlaşması ve ardından ~8 saat boyunca boşaltılmasına izin verilmesiyle belirlenir. Rizoboxları tartın ve 2.1.7 adımında kaydedilen toprak dolu rizoboxların ağırlığını mevcut ağırlıktan çıkararak su kütlesini (m_w) hesaplayın. Sonra m _w'yi m_{kuru toprağa} bölerek WHC (g ^g-1) belirleyin, sonuç bir oran olur.
  NOT: Gerçek haritalama için WHC belirleme için kullanılan rizoboxları kullanmayın, çünkü su doygunluğu anaerobiye ve dolayısıyla redoks artefaktlarına yol açabilir.
9. Büyüme sırasında çoğu bitki için optimal su içeriği, toprak tipine ve bitki türüne bağlı olarak %50─%60 WHC (yani WHC faktörü, f_WHC = 0,5─0,6) olarak tutulmalıdır. Her rhizobox'a eklenecek su miktarını (_{m w add}) aşağıdaki şekilde tahmin edin: m_{w add} = WHC x f_{WHC x}m_{kuru toprak}.
10. Rhizobox'u dikmeden önce m_{w add} ile sulayın. Eğer sulama deliklerden yapılırsa, yüzeye 5-10 ml su ekleyin.
11. Bitki büyümesi sırasında bitkilerin sulaması için gerekli olan sulanan rizoboxların kütlesini kaydedin.
Bitki yetiştiriciliği ve yönetimi^12,26
1. Tohumları çimlenmeden veya ekime öncesi sterilize edin. Yaygın bir uygulama, mantar büyümesini önlemek için tohumları %70 etanol içinde 3 dakika ve ardından %15 NaClO ile 15 dakika koymaktır. Sonra tohumları yaklaşık 6─7 kez deiyonize suyla durulayın.
2. Tohumları, su veya 0.05 mmol L⁻¹ _{CaSO 4}ile ıslatılmış filtre kağıtları veya çimlenme ruloları arasında önceden çimlendirin, ta ki radikal çıkana kadar.
3. Her bir fidanı her rhizobox'a aktarın, ön tabakaya yakın koyun, biraz toprakla örtün ve sonra biraz su ekleyin.
4. Rizosferde fotokimyasal azalmayı önlemek, alg ve diğer fotosentetik mikroorganizmaların büyümesini önlemek ve ışığa maruz kaldığında köklerin streslenmesini önlemek için rizoboxları Al folyosuna sarın. Alternatif olarak, ışığın geçmesine izin vermeyen siyah ön plakalar mevcuttur ve Al folyosunun yerine kullanılabilir.
5. Rizoboxları bir rafa yerleştirin; böylece rizoboxlar büyüme odasında veya serada kontrollü sıcaklık, göreceli nem ve ışık yoğunluğu ile eğilmelidir. 25°─35° eğim öneriyoruz.
6. Rizoboxları bitkilerin ihtiyaçlarına göre haftada en az 2─3 kez gravimetrik olarak sulayabilir. Bu, rhizoboxların tartılması ve 1.2.11. adımda kaydedilen ağırlıktan farkı telafi etmek için su ekleyerek yapılır. Ancak, bitkinin biyokütlesi önemli ve su talebi arttığında, biyokütle hesaba katılmalı ve sulama hacmi buna göre ayarlanmalıdır.
7. Belirli ürün yönetimi uygulamaları (örneğin gübreleme) deneysel kurulum, toprak özellikleri, yetiştirilen bitki türleri ve bitki büyümesi sırasında hastalık ile zararlı kontrolü için mevcut ihtiyaçlara göre gerçekleştirilir.
8. Büyüme süresi ve kök eksüdat örneklemesi büyük ölçüde rizoboxların boyutuna, bitki türlerine ve çalışmanın amaçlarına bağlıdır.

3. Kök ekzudat örneklemesi^12,26

NOT: Burada kök eksudatlarının yıkıcı olmayan örnekleme ile ilgili detayları sunuyoruz. Örnekleme öncesi tüm gerekli malzemelerin hazırlandığından ve deneysel boşlukların numune alındığında dahil edilmesinden emin olun. Malzemeler ve kimyasallar hakkında detaylar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Örnekleme öncesinde rhizoboxların su içeriğini yavaşça %90─%95 WHC'ye (oksijen stresine karşı çok hassas bitkiler için %80) getirin. Bu, önce %90─95% WHC kullanılarak 2.1.9. adımda eklenecek su miktarını (m_{w add)} hesaplamak, ardından rhizobox'un, ıslak toprağın toplam ağırlığını ve bitki ağırlığının tahminini yeniden hesaplayarak doğru şekilde elde edilebilir. Bir denge kullanarak, rhizobox yeniden hesaplanan ağırlığına ulaşana kadar deionize su ekleyin.
Al folgasını rhizobox'tan açın, ilgilenilen bölgeyi ön plakada belirleyin ve çizin. Bu adım yalnızca kök segmentleri veya genç bitkiler örneklenecekse gereklidir.
İlgi alanına ve rhizobox'un boyutuna göre belirtilen boyutlarda plastik bir folyo ve ZrOH hidrojeli (bkz. adım 1.3) kesin. Eğer dolgu sürecinde nukleopore membranı takılmadıysa, istenen boyutlarda, yani ZrOH hidrojelinden biraz daha büyük kesin.
Rhizobox'ları çıkarılabilir ön plaka yukarıya bakacak şekilde düz bir standa yerleştirin ve dikkatlice açın ( bkz. Şekil 2A). Plastik folyoyu yavaşça çıkarın, köklerin ve toprağın bozulmadığından emin olun.
İlgi alanına bir cetvel yerleştirin ve verilerin sonraki işlenmesi için gereken yüksek çözünürlüklü fotoğraflar çekin. Bir cetkel, işlem sırasında görüntüden doğrudan doğru boyut belirleme için referans olarak hizmet eder, özellikle çok sayıda rizobox örneklenmesi gerekiyorsa.
Hedef kök alanına az miktarda su ekleyin, ta ki yüzeyde ince bir su filmi oluşana kadar ( bkz. Şekil 2B). Toprağın daha yüksek nem içeriği (oksijen stresine karşı çok hassas ürünler için %90–%95 WHC veya %80) örnekleme sırasında iyi toprak-jel temasını kolaylaştırır. Hidrojele sürekli molekül akışı sağlamak için daha yüksek nem içeriği gereklidir.
Önceden kesilmiş nüklepor zarını doğrudan ilgilenilen toprak yüzeyine/kök bölgesine yerleştirin ve toprak-kök arayüzünde düz olduğundan emin olun (bkz. Şekil 2C).
ZrOH hidrojelini doğrudan ve mümkün olduğunca düz bir şekilde ilgilenilen bölgedeki çekirdek por membranına yerleştirin ve ZrOH hidrojelinin sol tarafına yerleştirilen cetvel ile birlikte fotoğraf çekin ( bkz. Şekil 2D). Cetkel, ZrOH hidrojelinin boyutunu belirlemeye yardımcı olabilir ve örnekleme sırasında özelliklerde herhangi bir değişiklik olursa örneklenen alanı belirlemeye yardımcı olabilir ve uzun süreli depolama sırasında (>1 yıl) kenarları tespit edebilir.
ZrOH hidrojelini ön plakadan koruyun, üzerine plastik bir folyo yerleştirerek ( bkz. Şekil 2D).
Zrizombox'u nazikçe kapatarak ZrOH hidrojelinin hareketini azaltın. Rhizobox'u kapatırken ZrOH hidrojelinin minimum hareketi, jel sandviçi (nüklepor membranı + ZrOH hidrojel + plastik folyo) rhizobox'un temiz ön plakasına vinil elektrik bantıyla takarak da^{sağlanabilir; bu}, Wagner ve ark. 26 tarafından tanımlanmıştır.
Rhizobox'u tekrar Al folyosuna sarıp tekrar 24 saat boyunca büyüme odasına/seraya koyun. Kök ekzudatları, jelin kuruması ve deneysel kurulum ile çalışma hedeflerine bağlı olarak daha uzun veya kısa süreler için toplanabilir.
Uygulama süresinden sonra rhizobox'u nazikçe açın, bandı ve membranı dikkatlice çıkarın ve hidrojeli çıkarın. Hidrojeli steril hava geçirmez bir poşete yerleştirin, kapatmadan önce birkaç damla su ekleyin ve analiz gelene kadar buzdolabında (4 °C) saklayın. Boş jelleri kontrol olarak benzer şekilde saklayın. 2D haritalama amaçları için, ZrOH hidrojeli plastik bir levhayla birleştirin ve üstünü işaretleyin.
Kökleri çıkarın ve kökün morfolojik parametrelerini, taze ağırlığını ve kuru ağırlığını eksyut verilerinin normalizasyonu için belirlenir, eğer zaman çözünürlüğü deneyleri yapılmazsa.
Rhizobox'u kapatın ve zamanla çözülmüş çalışmalar yapılırsa tekrar iklim odasına veya seraya koyun.

4. Karboksilatların Ülüsyonu ve^{Ölçümü 12}

NOT: Boşluklar ve standartlar hazırlanırken taze laboratuvar grade I suyu ve yüksek saflıkta analitik standartlar gereklidir. Kalite güvencesi olarak sertifikalı kalite kontrol standartları kullanılmalıdır. Analizden önce örnekleri 0,2 μm veya 0,45 μm naylon filtrelerden geçirerek çözeltilerin (örnekler ve standartlar) parçacıklardan arınmış olduğundan emin olun, böylece tüp tıkanmasını önleyin. Malzemeler ve kimyasallar hakkında detaylar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Yüklü ve boş ZrOH hidrojellerini buzdolabından çıkarın, boyutları bir cetvel kullanarak ölçün ve ardından her birinin hacmini 0,25 mm aralık için 0,4 mm, 0,4 mm aralık için 0,64 mm kalınlıkla hesaplayın. 2D haritalama için, ZrOH hidrojellerini temiz bir jilet bıçağıyla istenen boyuta kesin. Alt sınırın yaklaşık 2 x 2 mm olduğunu unutmayın, çünkü küçük parçaları kesmek ve uygun elülasyon hacimlerini işlemekte zorluklar yaşanır.
NOT: Cetvel yerine, kesme için kullanılan pleksiglas plakanın bir tarafında grafik kağıdı (milimetre grafik kağıdı) kullanın, böylece ZrOH hidrojellerini neredeyse kusursuz parçalara dönüştürmek kolaylaşır. ZrOH hidrojellerinin kalınlığı, vernier kaliper kullanılarak doğrulanmıştır.
ZrOH hidrojellerini veya ZrOH hidrojel parçalarını plastik şişelere yerleştirin, 0,5 mol ^L-1 NaOH ekleyerek 0,196 cm³ZrOH hidrojel başına 1 mL eluent oranına uygun olarak elyasyon yapın ve 24 saat boyunca 150 rpm'de bir plaka çalkalayıcıda çalkalayın.
Çok küçük (örneğin 2 x 2 mm) ZrOH hidrojel parçası için elusyon hacmi düşükse, laboratuvar kalitesinde I derece suyu ekleyerek karboksilatların nicelendirilmesi için kullanılan analitik yöntem için gereken minimum hacme bağlı olarak 45-60 μL'ye ulaşın (örneğin IC-MS, aracın başına bağlı olarak otomatik örnekleyici için en az 45 μL numune gerektirir). Hacmi 45-60 μL'ye getirmek için eklenen suyun tam miktarını kaydedin; çünkü bu seyrelme faktörü ve gerçek konsantrasyon hesaplaması için gereklidir.
Örnekleri (0,2 μm veya 0,45 μm naylon filtreler) filtreleyin ve şişelere aktarın. 1,5 mL plastik IC şişeleri kullanmanızı öneriyoruz çünkü kırılmadan dondurulabilirler. 330 μL şişeler daha küçük hacimlerde de kullanılabilir, ancak hava kabarcıklarının olmadığından emin olmak gerekir.
Karboksilatların elusyon çözümünde tercih edilen analitik yöntemle (örneğin IC-MS, HPLC) nicelendirilmesi. IC ile MS tespiti kombinasyonu kullanılarak ayrılmasını öneriyoruz. Alternatif olarak, yüksek veya ultra performanslı sıvı kromatografi (HPLC veya UHPLC), gelişmiş MS (örneğin uçuş zamanı veya Orbitrap) veya spektrofotometrik dedektörler dahil olmak üzere çeşitli dedektörlerle birlikte kullanılabilir.
Ölçümün sonunda, örnekler ve standartlar dondurucuda saklanabilir. Karboksilat içeren tüm çözeltilerin -20 °C sıcaklıkta maksimum 1 yıl boyunca saklanmasını öneririz. 1 yıldan uzun depolama süreleri için, kalite kontrolü kapsamında yeni standartlar hazırlanabilir ve ölçülebilir.
Eluatın toplam hacmindeki her karboksilatın toplam miktarını hesaplayın (yani NaOH hacmi + hidrojel hacmi + eklenen su) ve kök ağırlığı veya kök alanına göre normalleştirin ve elüsyon verimlilik faktörleriyle çarpın: akonitat için 0,94, sitrat için 1,00, fumarat için 0,90, laktat için 1,02, malat için 1,05, oksalat için 0,91 ve süksinat için 1,00 ( bkz. Ek Tablo 1). Eğer elülasyon ve ölçüm sırasında yapıldıysa, seyrelme faktörlerinin dikkate alındığından emin olun.

5. 2D haritalama

NOT: Dışkı verilerinin 2B görüntülerini oluşturmak için özel bir yazılım yoktur. Eşleme Microsoft Excel ve Python ile yapılabilir.

Her jel parçasından 4.7. adımda elde edilen verileri, 2D ızgara içindeki ilgili hücreye (satır x sütun) ekleyin. Izgara, örnekleme sırasında köklerden alınan fotoğraflar üzerine oluşturulur (bkz. adım 4.1).
Şebekelerin boyutunu tanımlayın ve verinin eşleşip eşleşmediğini doğrulayın.
Renk ölçeğini seçin ve en düşük ile en yüksek değerleri temsil eden renk kodlarını belirtin.
Efsane için sayısal veri aralığını belirleyin ki seçilen ölçekle doğru şekilde eşleştiğinden emin olun.
Bir ısı haritası oluşturun ve etiket veya ızgara çizgisi olmadığından emin olun. Isı haritası, Ek Dosya 1'de verilen örnek R Script kullanılarak R Yazılımında kolayca oluşturulabilir.
Görüntüyü işleyip örnekleme sırasında elde edilen kök fotoğrafına yakın konumlandırın; böylece karboksilatların mekansal dağılımını yorumlayabilsin.
NOT: Günümüzde haritalama yapay zeka araçları kullanılarak da yapılabiliyor. İşlem basittir: Excel'den sayısal ızgayı sohbete kopyalayıp yapıştırın, ardından jeli parça boyutları ve renk ölçeği ile bir ısı haritası talep edin. Unutmayın ki çıktı ilk denemede her zaman mükemmel olmayabilir, ancak işlemi tekrarlamak genellikle doğru sonuçlar verir. Bu yaklaşım, manuel yöntemlere göre oldukça hızlı olma avantajı sunar.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZrOH hidrojel yöntemi, başlangıçta toprakta yetiştirilen bitki köklerinden sitrat örneklemek için geliştirilmiş ve süzüm^11'in mekansal dağılımını çözmekte başarıyla kullanılmıştır. Bu yöntemi diğer karboksilatlar için kullanmadan önce, ZrOH hidrojellerini diğer karboksilatlarla da kullanıma uygun olup olmadıklarını kesin olarak karakterize ettik (bkz. Ek Tablo 1). Ayrıca, 2019'da yapılan bir rhizobox deneyinden yüklü depolanmış ZrOH hidrojellerini elüasyonlaştırıp analiz ettik. ZrOH hidrojelleri, Tiziani ve ^ark.12 tarafından belirlenen aynı elülasyon parametreleri (1 mL, 0.5 mol ^L-1 NaOH) kullanılarak 5 saat içinde (~0,2 μmol, 10 mL) yüklü miktarın %100'ünü tutabilir. ZrOH hidrojelleri, genellikle rizosferde bulunan konsantrasyonlardan (genellikle nmol aralığında) çok daha yüksek olan 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 karboksilatlara kadar bağlanabilir. Ayrıca, karboksilat yüklü ZrOH hidrojelleri stabil kalır ve analiz öncesi birkaç hafta depolanabilir; böylece örnekleme sırasında ve sonrasında mikrobiyal bozulma en aza indirilir.

Şekil 3'teki sonuçlar, toprakta yetiştirilen Lupinus albus L (lupin) bitkisinin P-eksiktli toprakta yetiştirilen bir küme kökü boyunca sitrat süzümünün mekânsal dağılımının 2D görselleştirilmesini sunmaktadır. Harita, Ağustos 2019'da sitrat örneklemesi sonrası Ağustos 2025'te ZrOH jelinin kesimlendirildiği 5 x 2 mm jel parçalarında yapılan 48 bireysel ölçümden oluşmaktadır. Açıkça görülüyor ki, ZrOH hidrojelleri, süzür edilen sitratı etkili bir şekilde emmiştir ve küçük bir jel (0,10 cm²) üzerinde bile önden-konsantrasyon gerektirmeden ölçülebilir sonuçlar elde edilmiştir. En yüksek sitrat süzüm oranları küme kök bölgelerinde (2,8 nmol ^cm-2jel ^h-1'e kadar) bulunmuştur; bu ^{da 1.} gün 67,2 nmol ^cm-2 jel anlamına gelirken, en düşük oranlar yalnızca toprakla temas eden jel parçalarında gözlemlenmiştir. Küme köklerin uzunluğu 0,2 mm ile 15,6 mm arasında değişmekte olup, toplam uzunluğu 250 mm idi. Bu sonuçlar, hidrojellerin kök salınımlı karboksilat örneklemesi için 24 saat uygunluğunu doğrulamaktadır. ZrOH hidrojelleri, sitratın yanı sıra laktat, fumarat, malat ve oksalat gibi diğer karboksilatlara da bağlanabilmiştir (Tablo 1). 6 yıl boyunca 4 °C sıcaklıkta depolanan ZrOH hidrojellerinden elde edilen karboksilatların çoğunun tespit edilmesi, karboksilatların minimum bozulmasını göstermektedir. Ancak, farklı bitki türlerinden test edilen yedi karboksilat hakkında önemli ölçüde daha fazla bilgi toplamak için deneyler devam etmektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Poliakrilamid jel hazırlama kritik adımları. (A) Cam plaka montajının ~1 mm offset ile hizalanması. (B) Jel dökümü ve (C) jel çözeltinin plaka ortasından plakaya doğru yayılması. (D) Cam plakanın köşeden jilet bıçağıyla kaldırılması. (E) Jellerin cam plakadan ayrılmasına yardımcı olması için ıslatılması. (F) Jelin bir beakerde yıkanması. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: ZrOH hidrojelleri kullanılarak rhizobox yetiştirilen bitki kök sisteminin bir segmentinden kök ekzudatı örneği. (A) Ön plaka ve plastik çıkarıldıktan sonra rizobox'u açın. (B) Toprak-kök arayüzünün deiyonize su kullanılarak yıkama şişesinde uygun ıslatılması. (C) Tıslak toprak-kök arayüzüne bağlı çekirdek por iz-aşındırma membranı. (D) İlgilenilen bölgeye uygulanan ZrOH hidrojel ile kaplanmış ve ön plakaya karşı jel koruması için plastik folyo ile kaplanmış Rhizobox. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: ZrOH hidrojel ve sitrat süzümünün milimetre ölçeğinde 2-D görüntüsüyle kök eksüdat örneklemesi. (A) Örnekleme sırasında ilgilenilen kök bölgesinin üzerine yerleştirilmiş ZrOH hidrojel fotoğrafı, haritalama için kullanılan ızgaralar oluşturulur. (B) Fosfor eksikliği olan toprakta yetiştirilen beyaz Lupinus albus L. (lupin) küme kökü olan sitrat süzasyon hızının (nmol cm^–2 jel h^–1) dağılımını gösteren milimetre ölçekli 2D görüntü. Her ızgara, 5 x 2 mm ölçümlerindeki bir jel parçasını temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bitki	Tedavi	Aconitate	Sitrat	Fumarat	Laktat	Malate	Oksalat	Süksinat
	mg P ^kg-1 toprak	NMOL ^CM-2 ^H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Rice (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tablo 1: 0, 50 ve 250 mg P ^kg-1 toprağa maruz kalan toprakta yetiştirilen Lupinus albus L. (lupin) ve Oryza sativa L. (Pirinç) bitkilerinin akonitat, sitrat, fumarat, laktat, malat, oksalat ve süksinat süzümasyon oranları. LOQ, nicelik sınırıdır

Ek Tablo 1: NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) elülasyon parametreleri (elution verimliliği ve düzeltme faktörü) ve ZrOH hidrojelinin yedi karboksilat için kapasitesi. Veriler, ortalama ± ortalamanın standart sapmalarıdır (bireysel karboksilatların elüsyon verimliliği ve kapasitesi için n = 4, karboksilat karışımı için n = 40). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Önerilen rizobox'un şematik temsili, daha kolay sulama için. Rhizobox, sulama sırasında eşit su dağıtımını sağlamak için alt ve arka kısımda eşit aralıklı sulama delikleriyle donatılmış bir rizobox çerçevesinden ve deney sırasında kök büyümesini izlemek için çıkarılabilir şeffaf ön plakadan oluşur. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Rhizobox montajı ve toprak doldurma süreci. (A) Rhizobox çerçevesinin arkasındaki delikleri yapışkan bantla kapatın. (B) Rhizobox çerçevesinin ön veya açık tarafına bir (çekirdekpor membranı) ve ardından plastik folyo takın (yeterince sıkı ve düz olduğundan emin olun). (C) Ön plakayı yerleştirin ve rhizobox'u sıkıştırın. (D) Rhizobox'u öne doğru eğerek doldurun, böylece ince parçacıklar çıkarılabilir yüzeye düşer ve böylece resimde görüldüğü gibi pürüzsüz bir yüzey elde edin. (E) Alternatif olarak, kapalı rhizobox çerçevesini (A) açık taraftan doldurun, çıkarılabilir plakayla düzleştirin ve ardından nükleopor membranı, plastik folyo ve ön plaka ile kaplayın. (F) Rhizobox'un son kurulumu, sulandırılıp dikilmesi. Alternatif bir doldurma prosedürü Wagner ve ark. (2020)'de gösterilmiştir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Dosya, ısı haritası oluşturmak için kullanılan R bebesinin ayrıntılarını içerir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen karboksilat örnekleme yöntemi, doğru jel hazırlama ve işlenmesinin kritik olduğu ZrOH hidrojelleri kullanır. ZrOH hidrojellerini işlemek için, laboratuvar kalitesinde birkaç damla su ile nemli tutulmasını öneririz. Hazırlık sırasında, jel karışımını hazırladıktan hemen sonra (adım 1.1.3) jelin dökülmesi ve cam plakalar arasında kabarcık oluşmamasını sağlamak önemlidir. ZrOH hidrojelinin ortasında bulunan kabarcıklar özellikle kritiktir, çünkü örnekleme sürecini engelleyebilirler. Buna karşılık, kenarlardaki kabarcıklar uygulamadan önce jelin kesilmesiyle çıkarılabilir. Ayrıca, kökten salınan karboksilatlar hidrojellerde çökeltilmiş ZrOH'ya bağlanır, bu da çökeltme sırasında Zr'nin eşit dağılımı zorunlu kılar. Jel içindeki düzensiz Zr dağılımı karboksilatların lateral difüzyona yol açabilir; bu da mekansal dağılımlarını bozur ve 2D lokalizasyonun²⁶ güvenilirliğini zayıflatabilir. Zr'nin eşit dağılımını, poliakrilamid jellerinin ZrOCl₂·8H_2Oçözeltisine 2 saatten fazla süre daha geniş bir beakerde batırılması ve daha az jel 12 yerleştirilmesiyle sağlanabilir (adım^1.2.3 ). Ayrıca, ZrOH hidrojellerini geliştiren Guan ve ^ark.14'ün önerdiği gibi, Zr dağılımı taramalı elektron mikroskopisi (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japonya) kullanılarak doğrulanabilir. Ancak, SEM büyük örnekler için standart bir prosedür olarak uygulanabilir değildir.

Bir diğer kritik adım ise karboksilat örnekleme için rhizobox dolgusu, çekirdek por membranı uygulaması ve jel uygulamadan önce sulamadır. Kumlu veya ağır kil toprakları doldururken ve işlerken özellikle özen gösterilmelidir; bu, düzgün jel teması için gereklidir ve iyi drenaj koşullarını korur. Çekirdek poru membranının doğru şekilde tutulması için de düzgün bir yüzey gereklidir. Kök ile ZrOH hidrojel arasında iyi bir temas kurmak, çekirdek por zarının toprak yüzeyine en az hava kabarcıklarıyla doğru şekilde yapışmasını sağlamak için çok önemlidir. ZrOH jel uygulamasından önce, ZrOH hidrojelinin örnekleme sırasında bütünlüğünü korumak için toprağı düzgün şekilde doyurması ve nemli tutulması için çok önemlidir. 2D karboksilat haritalaması için jel kesiminde milimetre hassasiyetinde kesimler elde etmek zor olabilir; bu nedenle, 2 x 2 mm çözünürlükten aşağı düşmemeyi öneririz. Ayrıca, jeller kuruduktan sonra küçüldüğünden, bütünlüklerini korumak için örnekleme sonrası nemli tutulması şarttır (adım 3.12). Mevcut yöntem, karboksilatların bozulmasını önlemek için NaN_3'ün mikrobiyal inhibitör olarak kullanılmasını öneren Tiziani ve ^ark.12 tarafından uyarlanmıştır. Bu protokolde, analitik yöntemlerle etkileşim ve IC-MS sistemine potansiyel etkileri nedeniyle, kök eksüdatlarının örneklenmesinde yaygın olarak kullanılan mikrobiyal inhibitörler (NaN₃ veya micropur, AgCl₃ bazlı bir malzeme)²³ kullanılmamaktadır.

Bugüne kadar yöntem yalnızca yedi karboksilat (akonitat, sitrat, fumarat, laktat, malat, oksalat, süksinat) için doğrulanmıştır; kök exudome ise fenolikler, amino asitler, karbonhidratlar ve karboksilatlar gibi karmaşık bir bileşik karışımından oluşur. Bu diğer önemli bileşikler şu anda yöntemde dikkate alınmamış ve ZrOH hidrojelleri örnekleme açısından karakterize edilmemiştir. Toprağa diğer oksiyanyonların (fosfat, nitrat gibi) varlığı, karboksilat alımını, kapasitesini ve elyusyonunu ile IC veya HPLC üzerinde karboksilat nicelendirilmesini etkileyebilir. Ayrıca, çok büyük bitkilerden (örneğin ağaçlar veya çalılar) çok büyük kök sistemlerinin örneklenmesi, çok büyük ZrOH hidrojellerinin (>30 cm) üretimindeki zorluklar nedeniyle oldukça zor olabilir. Ancak bu, mevcut tüm eksyut örnekleme^{tekniklerinde bir sorundur 8}. Bir diğer sınırlama ise rizoboxların kullanımıdır. Rizoboxlarda bitki büyümesi hidroponik sistemlere göre çok daha gerçekçi^{olsa da,} kök gelişimi için sınırlı üç boyutlu alan olan yapay bir düzen^{olarak kalmaktadır 33}. Ayrıca, örnekleme 2B bir yüzeyde gerçekleşir ve bu teorik olarak jellerle temas etmeyen diğer yönlerde salgılanan karboksilatların kaybına yol açabilir. Ancak bu sınırlama, difüzyon, karboksilatlar için ZrOH hidrojellerinin daha yüksek bağlanma kapasitesi ve uygulama sırasında rizosfer toprağının yüksek su içeriğiyle azaltılabilir. Ancak, bu yönleri belirlemek için ek doğrulamalar gereklidir.

Kökten salınan karboksilatların örneklenmesi için ZrOH hidrojel yöntemi, yaygın kullanılan yöntemlere (örneğin, toprak-hidroponik hibrit ve hidroponik yaklaşımlar) kıyasla çeşitli avantajlar sunar. Bu yenilikçi yaklaşım, bozulmamış toprakta yetiştirilen kök sistemlerinden karboksilatların yerinde örneklenmesine, zamanla çalınmış örnekleme (Santner, Mühlbacher ve diğerleri, yayımlanmamış veriler) ve mm ölçekli 2D haritalama imkanına sahiptir. Ayrıca, ZrOH hidrojelleri köklerde en az 24 saat¹² süre boyunca kullanılabilir. Ayrıca, aynı kök segmentinin daha uzun zaman çözünürlüklü sürelerde tekrar tekrar örneklenmesi mümkün olmalıdır. Bu yöntem, filtre makalelerinin 8. uygulaması gibi benzer yöntemlere göre çok daha iyi geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir^. ZrOH hidrojellerinde uzun süre örnekleme mümkündür; çünkü karboksilatlar için yüksek jel kapasitesi vardır; örneğin, karboksilatlar karıştırıldığında en düşük 0,44 μmol ^cm-2 ± malatlar için 0,04 μmol cm⁻² jel ile en yüksek 1,66 μmol ^cm-2 ± pH 4,00'da suksinat için 0,10 μmol cm⁻² ile toplam 3,29 μmol cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² olarak karboksilatlar karıştırıldığında (bkz. Ek Tablo 1). Kök yıkama adımının (bitki başına genellikle 20–30 dakika süren) toprak-hidroponik hibrit yöntemde atlamak, kök sistemi hasarını ve buna bağlı yanlılığı önemli ölçüde azaltır, böylece daha gerçekçi ve temsilci veriler elde edilir.

Özellikle, yüklü ZrOH hidrojelleri özel depolama koşulları gerektirmez, sadece soğutma gerektirir ve şu ana kadar uygulamalarımızda elülasyon sonrası ön konsantrasyon gerekmediğini tespit ettik. ZrOH hidrojelleri ayrıca aynı koşullar altında eluasyon edilen ve IC^14,34 ile analiz edilebilen diğer anyonlara da bağlanır. Bu, karboksilat süzülasyonunun rizosferdeki besin dağılımıyla^{bağlantısını sağlar 29}.

Sonuç olarak, kökten salınan karboksilatların örneklenmesi yaklaşımı bu yenilikçi yaklaşım, rizosfer araştırmaları için temel bir adımdır. Karboksilatlar, bitki besinlerinin (örneğin, P, Fe)^35,36 mobilizasyonu ve ediniminde kritik rol oynadığından, ayrıca faydalı mikroorganizmaların katılımında bu yöntem çeşitlerin kök özellikleri ve bitki ıslahı için taramak için kullanılabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalede yer alan çalışmayı etkileyebilecek bilinen hiçbir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Bolzano/Bozen Özerk Eyaleti – Güney Tirol" (Ortak Projeler Südtirol-DFG 2023, D-SÜD, sözleşme numarası 6/34, CUPI53C22003410003, DGT AG2222 Çıkarıyor) ve "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, Alman Araştırma Vakfı, proje numarası 525026426) tarafından finanse edilen mali desteği takdir ediyoruz. Ayrıca Bozen-Bolzano Özgür Üniversitesi'nin Açık Erişim Yayıncılık Fonu'nun mali desteğini de takdir ediyoruz. Ayrıca, analitik yöntemlerin geliştirilmesinde ve DGT kök ekzümitler projesinin ilerletmesinde hayati öneme sahip olan merhum Dr. Fabio Trevisan'ı da derin bir üzüntüyle anıyoruz.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol	Sigma-Aldrich		70%
Oksalik asit	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
trans-Akonitik asit	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Zirkonyum diklorür oksit oktahidrat (ZrOCl₂ & zamanlar; 8H₂O, %98)	Termo Bilimsel	A12342.22	98%
Sitrik asit	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Sodyum nitrat	VWR Kimyasalları	Parsel No: 19H224150	100%
Nitrik asit (HNO₃)	Sigma-Aldrich	CAS-No: 7697-37-2	>65% analiz EMSURE® Reag. Ph Eur,ISO
Fumarik asit	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Amonyum persülfatı (APS_(NH₄)₂S₂O₈)	Termo Bilimsel	201531000	≥ Elektroforez için %98,0 ekstra saf
Suksinik asit	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
2-(N-morfolino)-etansülfonik asit (MES) Tampon	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Çapraz bağlayıcı	DGT Research Ltd (Lancaster, Birleşik Krallık)	na	%2, agaroz türevi
Plaka veya Yatay Çalkalayıcı			Any
İyon kromatografisi veya IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	Herhangi bir yüksek veya ultra performanslı sıvı kromatografi (HPLC veya UHPLC), gelişmiş MS (örneğin uçuş zamanı veya Orbitrap) veya spektrofotometrik dedektörler dahil olmak üzere çeşitli dedektörlerle birlikte kullanılabilir
pH ölçer			Herhangi bir laboratuvar pH elektrotu kullanılabilir
Fırın	Binder	na	Belirli bir sıcaklığı koruyan küçük fırınlar kullanılabilir, tercihen daha küçük bir fırın.
Naylon filters_13 mm 0.45 ve mikro; M	GVS Filtre Teknolojisi	Parsal No: 7135431	Daha büyük naylon filtreler de kullanılabilir, ancak eluat hacmi küçük olduğu için daha küçük olanlar tercih edilir.
Kalsiyum sülfat dihidrat	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	CaSO4 de kullanılabilir.
Akrilamid çözeltisi, %40	G-Biosciences	786-508	Karıştırılmış akrilamid çözeltisi kullanmayın Bis-akrilamid. Buharlı bir yerde dikkatli ele alınması gereken toksik bileşik.
Rhizoboxlar	https://www.rhizosphere.com/	na	Rizoboxlarımız, tasarıma göre özel olarak hazırlanıyor Rhizosphere.com
Polipropilen Şişe kiti, 1.5 mL	Termo Bilimsel	79812	Plastik IC şişeleri kırılmadan dondurulabildikleri için tercih edilir. 330 µ L de kullanılabilir, ancak hava baloncuğu olmamasına dikkat edilmelidir
cis-Akonitik asit	Termo Bilimsel	A16010.06	Teknoloji. %85
N,N,N',N'- tetrametiletilenediamin (TEMED)	Sigma-Aldrich	Parsal No: BCBN1173V	Dikkatli ele alınması gereken toksik bileşik.
250 mL PP şişeleri	Sarstedt	Lot No:2406082
Alüminyum folyo	Yerel süpermarket	na
Beakers_1 L/ 2 L
Kelepçeler	Yerel depo	na
Cam plaka (6.1 x 17 x 0.4 cm)	Yerel depo	na
L-(-)-Malik asit	Sigma-Aldrich	M6413-25G
IC için laktat standardı	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Laminar akış tezgahı
L-Laktik asit susuz	Termo Bilimsel	L13242.14
Çekirdek Gözlü İz-Gravür Membrane_0.2 & mikro; m	Cytiva	Parsal No: A29983896
Plastik folyo/plastik poşetler	Yerel depo	na
Plastik cımbızlar	Semadeni	602
Plexiglass plaka	Yerel depo	na
PP 30 mL şişeler	Aptaca spa	Parsal No: 250552
PTFE spacer_0.25/0.4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Jilet bıçakları	Yerel depo	na
Hükümdar	Yerel kitapçı	na
Sodyum hipoklorit (NaClO)	CARLO ERBA Reagentleri	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Parsel No: 22A17C8
Vinil elektrik bantı	Yerel depo	na

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Toprakta büyüyen köklerden salgılanan karboksilatların mekansal çözümlü örnekleme için poliakrilamid ZrOH hidrojelleri

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles