Yöntem makalesi

Pankreas Kanseri Fare Modellerinde Tümör Ölçümleri İçin Çok Hayvanlı Manyetik Rezonans Görüntüleme

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69927

⸱

3 Şubat 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde pankreas adenokarsinom tümörlerini tespit etmek için dört hayvana kadar paralel manyetik rezonans görüntüleme (MR) için çok odalı bir yatak kullanır. Bu çok hayvanlı MRI protokolü, tümörlerin tespit edilmesi ve ölçülmesi için hızlı ve maliyet etkilidir; preklinik çalışmalar için hayvan seçimini kolaylaştırır ve tümör büyümesinin uzunlamasına izlenmesini kolaylaştırır.

Özet

Manyetik rezonans görüntüleme (MR) gibi gelişmiş in vivo görüntüleme yöntemleri, preklinik fare modellerinde tümörleri etkili şekilde tespit etmek için temel araştırma araçlarıdır. MR, tümörün konumu ve boyutu hakkında ayrıntılı anatomik bilgiler sağlar. Ancak, bu görüntüleme yöntemi pahalı ve zaman alıcıdır. Bu erişim engelini görüntüleme kalitesinden ödün vermeden aşmak için çok hayvanlı bir MRI protokolü uygulandı. Bu protokol, tek bir yakalama seansında yüksek çözünürlüklü çok hayvanlı anatomik MRI taramaları elde etmek için dört odalı yatak girişi kullanır. Birden fazla farenin aynı anda hayal edilmesi bu işlemin süresini ve maliyetini azaltır. Bu protokol, pankreas düktal adenokarsinomunun genetik olarak tasarlanmış Kras odaklı, p53 silinmiş (KPC) fare modelinde tümör tespiti ve uzunlamasına tümör izleme verimliliğini artırmak için tasarlanmış çok hayvanlı bir MRI iş akışını tanımlar. Bu iyi kurulmuş klinik açıdan önemli KPC modeli, pankreas karsinogenezi, tümör ilerlemesi ve tedavi direncinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında paha biçilmez bir bakış açısı sağlamıştır. Kavram kanıtı olarak, bu protokol KPC modelinde standart bakım kemoterapî ajanı gemsitabin'in terapötik faydasını doğrulamak için uygulanmıştır. Bu MRI rehberli preklinik çalışma tasarımının gelecekteki uygulamaları, kombinasyon tedavilerinin terapötik etkinliğini değerlendirmek için kısaca tartışılır.

Giriş

Pankreas kanal adenokarsinomu (PDAC), en ölümcül malignitelerden biri olarak kalmaktadır. Son yıllarda hayatta kalmada ılımlı iyileşmelere rağmen, 5 yıllık hayatta kalma oranı hâlâ sadece %13'tür. Çoğu durumda, PDAC ileri bir aşamada tespit edilir ve genellikle yerel istila veya uzak metastaz içerir ve bu da tedaviyi zorlaştırır. Hastalık biyolojik olarak çeşitlidir ve yüksek invaziv tümör hücreleri, yoğun desmoplastik stroma ve zayıf vaskülerleşme ile işaretlenir 2,3,4. Bu karmaşık tümör mikro ortamı, hastalık ilerlemesini etkileyen hücresel ve hücresel olmayan bileşenlerin tam olarak karakterize edilmesi çabalarını engellemeye devam etmektedir. Bunu ele almak için, insan hastalık ilerlemesini ve desmoplaziyi yakından taklit eden etkili preklinik modellere ihtiyaç vardır.

Kanser ilerleme biyolojisini incelemek ve yeni tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için çeşitli faremodelleri kullanılabilir 5,6. KRas tabanlı genetik olarak tasarlanmış fare modeli (GEMM), insan PDAC 3,7,8,9,10,11'in birçok patofizyolojik ve moleküler özelliğini tekrarlayan pankreas tümörleri kendiliğinden geliştirir. Özellikle, Kras tarafından yönlendirilen, p53 tarafından silinmiş KPC modeli (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) iyi karakterize edilmiş bir PDAC GEMM 7,8,9'dur. Tümör görüntüleme, preklinik çalışmaların önemli bir bileşenidir. Tümör tespiti ve tümör boyutunun ölçümü, preklinik çalışmalar için hayvan seçimini, tümör büyümesi ve hastalık ilerlemesinin uzunlamasına izlenmesini ve tedavi yanıtının değerlendirilmesini sağlar.

Ultrason görüntüleme (ABD), biyolüminesans (BLI), bilgisayar tomografisi (BT), floresan görüntüleme (FLI), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi gelişmiş in vivo görüntüleme yöntemleri, KPC modeli ve benzeri PDAC modellerinde tümör görüntüleme içinkullanılabilir 12,13,14,15,16. Ancak, KPC modelinde tümör görüntüleme zor olabilir ve bu görüntüleme yöntemlerinin her biri kendine özgü güçlü ve sınırlamalar sunar. Biyolüminesans (BLI) ve ultrason görüntüleme (ABD) gibi optik görüntüleme teknolojileri invaziv değildir ve maliyet etkilidir. Ancak, özellikle iç organlar için sınırlı mekansal çözünürlükleri, tümörhacmi 12,15,17,18 ile zayıf bir korelasyona yol açabilir. Biyolüminesans, genetik olarak tasarlanmış hücrelerin lusiferaz sinyali ifade etmesini gerektirir; bu da substrat dağıtımı, kan akışı ve doku oksijenlenmesine bağlıdır. Bilgisayar tomografisi, minimum hareket artefaktı ile hızlı görüntüleme sağlar ancak kontrast maddeleri olmadan zayıf yumuşak doku kontrastı sağlar. İyotlu kontrast farelerde toksisiteye neden olabilir. Floresans görüntüleme kontrast ajanları/floresan problar gerektirir ve karın organlarından otofloresans hassasiyeti azaltır.

Diğer görüntüleme yöntemleriyle ilgili kısıtlamalar nedeniyle, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) genellikle derin köklü tümörlerin değerlendirilmesinde en güvenilir teknik olarak kabul edilir; iç anatomik yapılar için üstün yumuşak doku kontrastı ve moleküler hassasiyetsunar 13,14,15,19 . Ancak, standart preklinik MRI protokolleri yüksek operasyonel maliyetler ve uzun satın alma süreleri taşır ve birçok araştırma laboratuvarı için engel olabilir. Çok hayvanlı MRG, tarama öncesi hayvan hazırlık süresini (anestezi), tarama süresini ve tarama sonrası hayvan iyileşmesini azaltarak bu erişim engelini aşabilir. Bu protokol, PDAC tümör görüntülemenin teknik fizibilitesini (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4) ve gemsitabin ile kemoterapi tedavisi için hayvanları toplamak için görüntü bulgularının kullanımını göstermektedir (Şekil 5). PDAC tümörleri, standart bakım (SOC) kemoterapi ajanlarına karşı direnç gösteren birden fazla doğal mekanizma gösterir. örneğin gemsitabin, gemsitabin/nab-paklitaksel veya FOLFIRINOX 2,3,4. Bu protokol, yeni terapötik ajanları ve SOC kemoterapisini değerlendirmek için uygun ve sağlam bir platform sağlar; böylece hastalarda tedavi yanıtını artırabilecekumut vadeden kombinasyonlar 20,21,22,23,24,25,26,27 bulunur.

Protokol

Tanımlanan tüm deneyler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Canlı hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, hayvanların refahı ve insancıl muamelesini sağlamak için belirlenmiş yönergelere uygundur. Bu protokol, PDAC'ın KPC fare modelinin kullanımı ve tedavisini açıklar: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Hayvan hazırlığını ön görüntüleme

  1. Kullanımdan önce KPC farelerinin doğru genotipleme doğrulamasını sağlayın. Deneysel fareleri hayvan tesisinden görüntüleme tesisine taşımak.
  2. Dört fareyi önceden ısıtılmış, kapalı bir indüksiyon odasında %1,5-2 izofluran ve 0,8-2 L/min oksijen ile anestezi edin. Aesteziyi zararlı bir uyarı (ayak parmağı sıkma) uygulayarak doğrulayın.
  3. Korneanın kurumasını önlemek için her iki farenin her iki gözüne oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.

2. Çok hayvanlı MRI yatağı kurulumu

  1. İki anestezi altındaki fareyi, 3D baskılı yatak insertinin alt kısmına (sol ve sağa) ventral konuma yerleştirin; bu bölme, satıcı tarafından sağlanan standart tek fareli PET/MRI tarama tutucusuna takılı. Hayvanların dikenleri ve uzuvları düz konumlandırıldığından emin olun.
    NOT: Yatak eklemelerini (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2) yazdırmak için 3D yazıcı kullanılmıştır.
  2. Tedarikçi yatağındaki hava girişini burun konilerine boru (iç çapı 1/16", dış çapı 1/8") ve luer bağlantıları (örneğin, 7 x 1/16"-erkek kişi, 2 x 1/16" dişi, 2 dişi-dişi konnektör, 2 T soket soketi ile soket konnektörleri) ile bağlayın.
  3. Fare başını burun konisine sabitleyerek anestezi (%1,5-2 izofluran, 0,8-2 L/min oksijen) korun. Alt kısmı 3D baskılı yatak insertlerinin üst kısmıyla kapatın (Şekil 2B).
  4. Diğer iki anestezi edilmiş fareyi 3D baskılı yatak insertinin üst kısmına (sol ve sağa) ventral pozisyona yerleştirin.
  5. Fare başını burun konisine sabitleyerek anestezi (%1,5-2 izofluran, 0,8-2 L/min oksijen) korun.
  6. Solunum izleme pedini sol üst fareye bantlayın. Kalp atışından sinyal gelmeden solunumu ölçmek için izleme pedinin göğüs değil, karın seviyesinde olduğundan emin olun.
  7. İzofloran seviyesini, tarama boyunca genellikle %1,5-2 olan 30-40 bpm solunum hızını koruyacak şekilde ayarlayın. Nefes izi görünmüyorsa veya genlik çok düşükse, pedin bantla sıkıca tutulduğundan ve tüpteki tüm bağlantıların sıkı olduğundan emin olun.
  8. Çok hayvanlı MRI odasını tamamlamak için yatağı kapatın (Şekil 2B).
    NOT: Satıcı tarafından sağlanan tek fare PET/MRI yatağı, hayvanların vücut sıcaklığını (~35-37 °C) korumak için dolaşan sıcak hava ile donatılmıştır. 3D baskılı eklemelerle aynı anda en fazla dört fare taranabilir. Sıcak su sıcaklığının kesin ayarları, hava alım ve egzoz oranları, kontrol odasından MR'a kadar olan mesafe dahil olmak üzere her sahadaki kuruluma bağlıdır. Bunlar, her sahada bir dizi pilot tarama ile kurulabilir; sıcaklık her çalışma için standartlaştırılır.

3. Ön Tarama Kurulumu ve Görüntüleme Kalibrasyonu

  1. Yatak tutucusunu deliğe göndermeden önce kırmızı lazeri çok odalı yatağın ortası ile hizalayarak, farelerin MRI bobininin ortasında boyuna doğru olduğundan emin olun.
  2. Fare kimliği ve tarama tarihini kullanarak taramaya bir etiket atayın: Strain, Mouse ID, Scan Date.
  3. Dört odalı yatakta fareleri görselleştirmek ve görüntüleme alanını şu ayarlarla tanımlamak için bir eksenel dilim, iki koronal dilek ve iki sagital dilimle T1 ağırlıklı bir FLASH taraması kurun: TR/TE 50/2.4 ms, 2 ortalama, ters açı 20°, çözünürlük 0.313 mm, 1 mm dilim kalınlığı, tarama süresi 13 s.
  4. Fare vücudunun tamamının görüş alanında olduğundan ve farelerin düz olduğundan emin olun. Eğer olmazsa, fare konumlandırma adımlarını tekrarlayın ve/veya fare yatağını deliğe veya dışarı taşıyın.
    NOT: Bu parametreler, kullanılan MRI sisteminin özelliklerine dayanıyordu. Bu parametreler, deneysel gereksinimlere ve/veya MRI sisteminin yeteneklerine göre görüntü alımını optimize etmek için ihtiyaç duyulduğunda ayarlanabilir.

4. Çok hayvanlı manyetik rezonans görüntüleme

  1. T2 ağırlıklı hızlı spin yankı dizisini aşağıdaki parametrelerle kurun: Tekrarlama süresi (TR): 3.200 ms, Yankı süresi: 46 ms, Ortalama sayısı: 10, Düzlem içi çözünürlük: 300 x 300 μm, Koronal dilimlerin sayısı: 14, Dilim içi boşluk: 0,3 - 0,7 mm, Yağ bastırma: Etkinleştirildi, Nadir faktör: 8, Dilim paketleri: 2, Toplam görüntü alma süresi: 14 dakika.
  2. Lokalizer görselindeki sarı ve yeşil kutuların ortasına (çeviri) ve kenarına (dönüş) tıklayarak pankreas bölgesi ve diğer karın organlarının kapsaymasını en üst ve alt hayvan seti için optimize etmek için dilim paketi konumunu ayarlamak için ayarlayabilirsiniz.
  3. Taramaya başlamadan önce dört farenin çok hayvanlı yatak düzeninde doğru hizalandığından emin olun.
  4. Görüntüleme dizileri boyunca solunumu izleyin ve gerekirse izofluran seviyesini ayarlayın.
  5. MRI taraması tamamlandıktan sonra, görüntü kalitesinin yeterli olduğundan emin olun. Tarama sırasında fare hareket ettiğinde bulanıklık olarak görünen hareket artefaktı arayın. Karın bölgesinin tam kapsamını kontrol edin. Gerekirse fareleri yeniden konumlandırın ve taramayı tekrar yapın.

5. Fare kurtarma

  1. Tarama tamamlanıp doğrulandığında, yatağı MRI sisteminden çıkarın.
  2. Çok odalı yatağın üst kısmını açın. Sol üst farenin solunum monitörünü çıkarın ve hayvanları 3D baskılı eklerin üst ve altından kurtarma kafesine aktarın.
  3. Hayvanları, anestezi sonrası iyileşme için 37 °C ısıtma pedinin üzerine bir iyileşme kafesine yerleştirin.
  4. Fareleri ev kafeslerine göndermeden önce anesteziden tam iyileşmeyi sağlamak için solunum hızını ve hareketini izleyin. İyileşme belirtileri arasında normal nefes alma ve hareket (yürüme) bulunur.

6. Manyetik rezonans görüntüleme dosya işleme ve analizi

  1. MRI yazılımından DICOM görüntülerini bir görüntü analiz programına aktarın; böylece dört fareli bir görüntüden her fare için bir görüntüye kırpılır.
  2. Yazılımda, View modülündeki en üst hayvan setinin görüntüsünü açın. Otomatik pencere/seviye ayarları yeterlidir, ancak gerekirse genel görüntü görüntüleme kontrol sekmesinde farelerin görünür olması için ayarlayabilirsiniz. VOI sekmesinde, bir küp analitik nesne kullanarak sağ üst farenin etrafına cömert bir kutu manuel olarak çizin; sonra Maskeleme ve konturlama işlemleri sekmesinden o kutunun etrafındaki görüntüyü kırpın. Yeni dosyayı kaydederken, DICOM meta verisi ve dosya adını doğru fare kimliğine göre düzenleyin; Sonra aynı görüntüyle sol üst fare için tekrarlayın, alt fare seti için görüntüyü açın ve ROI kırpma ve kaydetme işlemi tekrarlanın.
    NOT: VOI'nin kesin olması gerekmez.
  3. DICOM dosyalarında depolanan görüntüleri analiz etmek için MRI görüntüleme yazılımı kullanın.
  4. Dorsaldan ventrale veya ventralden dorsala görüntüleme dilimlerini analiz edin. Pankreas ve/veya pankreas tümörlerinin tanımlanması için doğru bir bağlam oluşturmak amacıyla dalak ve mideyi konumlandırın.
  5. "İlgi Bölgesi"ni (ROI) tümör sınırına bir çizgi çizerek tanımlayın ve tümör hacmini hesaplamak için yarı otomatik segmentasyon yapın. Sıvı kistleri ve diğer hiperkromatik bulgulara dikkat edin (Şekil 3 ve Şekil 4).
    NOT: DICOM dosyalarını analiz etmek için bir MRI görüntüleyici kullanılmalıdır.

7. Gemsitabin tedavisi

  1. Tümör oluşmaya başlayana ve tespit edilene kadar (≥20 mm3) KPC hayvanlarının MRI taramalarını haftalık olarak yapın. Taramadan önce, farelerin sağlıklı olduğundan emin olun (aşırı kilo kaybı veya sıkıntı belirtisi, nefes almakta zorluk ve/veya nefes nefese kalma belirtileri yok).
  2. Tümör kriterleri karşılandıktan sonra bir tedavi programı oluşturun.
    NOT: Tedavi edilen grup için, gemsitabin intraperitoneal (i.p.) dozda haftada iki kez 100 mg/kg dozda enjekte edildi.
    DIKKAT: Gemsitabin sitotoksik kemoterapi etkenidir. Eldiven ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) ile kullanın. Kontamine olan şırıngaları ve malzemeleri kurumsal tehlikeli atık protokollerine uygun olarak bertaraf etmektir.
  3. Gemsitabine karşı tümör yanıtını izlemek için haftada bir MR taraması (1-6. bölümler sonrası) yapın.
  4. Tümör, MRI analizinden elde edilen hacim ölçümlerine (Bölüm 6) ve/veya diğer semptomlara dayalı ötenazi kriterlerini karşıladığında hayvanları kurban edin.
  5. MR taranırken tedavi edilen fareler, kemoterapi ajanının dışkı yoluyla potansiyel transferini önlemek için koruyucu bir bariyer yerleştirin. Gemsitabin ile çalışırken ve sonrasında iyi kişisel hijyen uygulamalarına uyun. Kullanılmış boş şırıngaları kemoterapi keskin bir kapta atın.
  6. İşi tamamladıktan sonra, tüm anestezi ekipmanlarını, MRI yataklarını ve tüm çalışma yüzeylerini %70 etanol ile püskürtün. Görüntüleme sırasında kullanılan kimyasal olarak kirlenmiş koruyucu bariyerler ve eldivenleri plastik bir torbaya yerleştirin, poşeti bağlayın ve yakmak üzere bir lif fıçıya yerleştirin.
  7. Kemoterapötik ajana maruziyeti en aza indirmek için bir sonraki tedavi turundan önce görüntüleme seanslarını planlayın.
    NOT: Tümör büyüme hızına ve tedavi rejimine bağlı olarak her iki haftada bir yapılan MRG taramalarının sıklığı düşünülebilir. Tümör kinetik tedavisine verilen yanıtlar boylamasına görüntüleme yoluyla değerlendirilebilir (Şekil 5).

Sonuçlar

KPC hayvanlarında 12 haftalık9 yaşından sonra pankreas tümörü gelişir. Çok odalı MRI yatağı kullanılarak, KPC farelerinin tümör taraması 10 haftalıkken başlatıldı. Bu, yaklaşık 200 mm3 tümörlü hayvanların gemsitabin tedavisiyle preklinik çalışmaya katılmasını sağladı. Tümör kinetik farklılıkları ve tümör sunumunumdaki varyasyonlar gözlemlendi. Çoğu KPC tümör, tek veya baskın odaklı sağlam bir büyüme deseni gösterdi (Şekil 4A), bu da tedaviler ve tümör hacmi değerlendirmesi için hayvan katılımını kolaylaştırdı. Ancak, pankreas boyunca yayılan çok sayıda küçük katı tümörlü hayvanlar da gözlemlenmiştir (Şekil 4A). Bazı PDAC vakalarında ayrıca intratümörsel sıvı dolu kistik lezyonlar da görülebilir; bunlar peritümörlü, neoplastik olmayan kistik lezyonlar ve safra kesesi ve/veya pankreasın kanal tıkanıklığından kaynaklanan sıvı tutulması ile birlikte olabilir. (Şekil 4A).

Katılımcı katılımından sonra hayvanlar rastgele iki deneysel gruba ayrıldı: tedavi görmeyen bir kontrol grubu ve haftada iki kez intraperitoneal (i.p.) gemsitabin dozunda intraperitoneal (i.p.) gemsitabin veren bir grup. Toplam 23 uygun hayvandan 4 dişi ve 7 erkek kontrol grubuna, 6 dişi ve 6 erkek ise tedavi edilen gruba ayrıldı. Haftalık MR taramaları, çok hayvanlı yatak sistemi kullanılarak yapıldı (Şekil 5A), böylece hem kontrol hem de tedavi edilen gruplarda tümör büyüme kinetik değişikliklerini sürekli izlememiz mümkün oldu (Şekil 5B).

İşlenen görüntüleme verileri, gemsitabin ile tedavi edilen KPC modelindeki tümörlerin tedavi edilmemiş kontrol grubuna (Şekil 5C) kıyasla daha yavaş bir büyüme desenine sahip olduğunu ve bunun da tedavi edilen grubun genel hayatta kalma oranında istatistiksel olarak anlamlı (Log rank testi, p = 0.04) artışıyla ilişkilendirildiğini göstermektedir (Şekil 5D). Tedavi edilmeyen KPC için medyan sağlık, tedavi edilen grup ise medyan sağkalımın 23 haftadan fazla uzattığı görüldü (Şekil 5D).

Şekil 1
Şekil 1: Çok hayvanlı manyetik rezonans görüntüleme prosedürünün iş akışı, görüntü işleme ve analiz. Çok hayvanlı MRI protokolünün temel adımları, prescan hazırlıktan görüntü rehberliğinde preklinik çalışmalara kadar vurgulanmaktadır. En fazla 4 hayvan, indüksiyon odasında (prescan hazırlığı) anestezi edilir ve çok hayvanlı bir yatağa yerleştirilmek üzere hazırlanır (Çok hayvanlı MRI yatağı kurulumu). Hayvanların 2 x 2 konfigürasyonunda (üst bölmede 2, alt bölmede 2 kişi) ön tarama görüntüsü ve ardından manyetik rezonans taraması (MR görüntüleme) yapılır. Her hayvanın görüntüleme verileri ayrı dosyalar olarak kaydedilir ve bağımsız olarak analiz edilir (Görüntü Analizi). Görüntü bulgusu ve tümör boyutu, preklinik çalışmalar için hayvan seçiminde ve tedavi yanıtını izlemekte (preklinik çalışmalar) kullanılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2
Şekil 2: Kurulumdan taramaya kadar çok hayvanlı MRI için temel adımlar. (A) Üst panel, özel çok hayvanlı MRI yatak sisteminin montajı. Entegre anestezi portlarıyla özel tasarlanmış 3D baskılı yatak eklemeleri, standart tek fareli PET/MRI yatak tutucuya uyabilir. Alt panelde, bu 3D baskılı eklemeler yatağı iki odaya ayırır ve dört hayvanın eşzamanlı görüntülenmesine olanak tanır: 1 ve 2 numaralı hayvanlar üst eklemenin üstünde, hayvanlar 3 ve 4 ise alt insertin üstünde. STL görüntüleyiciden alınan 3D yazıcı eklemelerinin enine düzlemi ve frontal modifikasyon düzlemi gösterilmiştir. (B) Farelerin çok odalı bir MRI yatağına sıralı yerleştirilmesi (yukarıdan aşağıya). Üstteki görüntü, satıcı tarafından sağlanan PET/MRI yatağının içinde bulunan 3D baskılı ekin alt kısmında (sol ve sağ) iki hayvan alt pozisyonda konumlandırılmıştır. Orta görüntüde, diğer iki fare 3D baskılı ekin üst kısmında (sol ve sağ) ventral pozisyonda konumlandırılmıştır; Üst insertin sol tarafında konumlandırılan farenin solunum monitörü takılıdır. Alt görsel: dört hayvanın tamamlanmış montajı, üstte kapak ile birlikte. Tüm hayvanların başları anestezi sürdürmek için burun konisine sabitlenir (%1,5-2 izofluran, 0,8-2 L/min oksijen). Tüm dört hayvanın MRI yatağında anestezi teslimatı, sıcak su ısıtıcısı ve tüm hayvanların tek bir seansta MRI taraması ve veri toplamasını mümkün kılacak hayati izleme sistemi ile nihai düzenlemesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3
Şekil 3: Çok hayvanlı MRI taramalarından veri toplama ve işleme. (A) Tüm dört hayvanın ilk MRI taramasının temsil görünümü (medial düzlem). (B) Çok odalı yatakta dört farenin MRI taraması (dorsal düzlem): 3D baskılı eklerin alt kısmında (3, 4) ve üstte (1, 2) iki fare konumlanmış. (C) Her bireysel fare taramasının son yüksek çözünürlüklü MRI dosyası. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4: PDAC tümörlerinin çeşitli sunumları: entegre MRI ve histoloji analizi. (A) PDAC tümörlerinin anatomik değişkenliğini (soldan sağa) gösteren temsil MRI görüntüsü (dorsal düzlem): normal pankreas, sıvı dolu kistik lezyonlara sahip multifokal tümörler ve katı tümör kitlesi. Anatomik organlar şu şekilde renk kodlanır: mide (sarı), dalak (yeşil), tümör (mor), kanal tıkanıklığı nedeniyle sıvı birikimi (mavi). Beyaz pulluk çubuğu = 1 cm. (B) H&E boyalı tümörlerin histolojik kesitleri ve hücre sınıfları ile birlikte, bilgisayar destekli eğitilmiş sınıflandırıcı örtülerine dayanarak, tümörlerin histopatolojik özelliklerini MRI bulgularıyla uyumlu hale getirir. Tümör (T) bölgesi, tüm örnekler için siyah renkle işaretlenmiştir. Hücre sınıfları renkte gösterilir: normal pankreas dokusu (gri), tümör (kırmızı) ve bağışıklık hücreleri (sarı). Siyah ölçek çubuğu = 0,5 cm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5
Şekil 5: Gemsitabin tedavisi sırasında hayvan toplama ve tümör büyüme izleme için çok hayvanlı MRI uygulaması. (A) Deneysel tasarımın zaman çizelgesi: MRI taramasında 200 mm3 ≥ bir tümör tespit edildikten sonra hayvanlar (14+ haftalık) alındı. Tedavi edilen gruptaki fareler, ötenazi kriterlerine ulaşana kadar gemsitabin (100 mg/kg, i.p., b.i.w.) aldı. Deney boyunca tüm hayvanlar için çok hayvanlı MRI taramaları yapılarak tümör büyüme kinetiklerini izlemek için gerçekleştirildi. (B) Tedavi edilmemiş hayvandan bir hayvan ve tedavi edilen gruptan bir hayvan için tümör ilerlemesini gösteren temsil MRI görüntüleri (dorsal düzlem), 0. günden deneyin son gününe (sağ kalma son noktası) kadar. Beyaz ölçek çubuğu = 1 cm. (C,D) Kontrol grubunda tedavi edilmemiş ve tedavi edilmeyen grupta tümör büyüme kinetiklerini (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) ve genel hayatta kalmayı (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) gösteren grafikler. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri için istatistiksel anlamlılık Log-rank (Mantel-Cox) testi ile belirlenmiştir (* p < 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Standart tek fareli PET/MRI yatak tutucusuna sığan entegre anestezi portlarıyla alt insertin 3D baskısı için STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Standart tek fareli PET/MRI yatak tutucusuna sığan entegre anestezi portlarıyla üst eklemenin 3D baskısı için STL dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, tedarikçi tarafından sağlanan standart tek sıçanlı PET/MRI yatağını kullanır; özel hazırlanmış 3D baskılı ekler ile modifiye edilir ve bu da aynı anda dört farenin taranmasına olanak tanır (Şekil 1). Bu çok hayvanlı konfigürasyon, sadece pahalı MRI tarama süresini değil, aynı zamanda genel işlem süresini de önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem, paralel hazırlık (anestezi, yatakta pozisyonlama ve yatak yükleme) ile paralel hazırlık, tarama ve bir seansta dört hayvanın kurtarılmasına olanak tanır; buna karşılık, her hayvanın hazırlanması, taraması ve ayrı seanslarda kurtarılması için gereken ek zaman harcanır. Kurulum ayrıca her hayvana kontrollü anestezi iletimi için ayrı burun konileri, bir hayvan için özel hayati izleme ve taranan tüm fareler için vücut sıcaklığını koruyan entegre ısıtma yetenekleri içerir (Şekil 2). 3D baskılı ekler, hayvan hizasını tutarlı hale getirir ve segmentasyon tutarlılığını artırır. Gerçek zamanlı solunum izleme, tarama sırasında anestezinin sürekli değerlendirilmesini ve ayarlanmasını sağlar, böylece hareket artefaktlarını en aza indirir.

Bu protokol, kemoterapî maddesi gemsitabin ile tedavi edilen KPC modelinde pankreas tümörü ilerlemesini tespit etmek ve uzunlamasına izlemek için kullanıldı ve kavram kanıtı preklinik çalışma olarak hizmet verdi. Gemsitabin, tek başına veya kombinasyon halinde, lokal veya metastatik pankreas kanseri olan hastalar için birinci veya ikinci basamaktedavidir 28,29,30. Gemsitabin ile tedavi edilen hayvanlarda elde edilen bu sonuçlar, önceki raporlarla tutarlıdır; bu raporlar da hayatta kalma faydasıgöstermiştir 31. Daha da önemlisi, bu protokol, KPC modelinde veya benzer PDAC modellerinde yeni terapötik ajanların kombinasyon tedavilerini ve SOC kemoterapisini incelemek için uygun ve sağlam bir platform sağlar. Bu kombinasyon tedavileri, küçük molekül inhibitörleri, immünoterapi, siRNA'lar, mikroRNA aktivite modülatörleri ve diğer terapötik oligonukleotidler olabilir; bunlar ana molekülerhedeflere karşı 20,21,22,23,24,25,26,27 . Bu kombinasyon tedavileri, gelişimin erken aşamasında SOC kemoterapisi veya diğer tedavilerle etkileşimlerini anlamak için genetik olarak değiştirilmiş hedeflerde içerebilir 9,20,32.

Bu protokolün odağı pankreas ve diğer karın boşluğu organlarının görüntülenmesi olsa da, bu çok hayvanlı protokol ve tanımlanan MRI dizileri, meme kanseri ve glioblastoma gibi diğer fare kanser modellerinin anatomik karakterizasyonu veya böbrek ve/veya karaciğerile ilgili diğer hastalıkların anatomik karakterizasyonu için uygulanabilir. Çok hayvanlı MRI taramasını tanımlayan diğer protokollerdende haberdarız 18,34. Örneğin, Dazai ve ark. yedi farenin nöroanatomik MRI taramasını18 tarif etmiştir. Bu düzen, yedi hayvanın beyin görüntülemesini mümkün kılsa da, her fare için anestezik ve sıcaklık kontrolünü sağlamıyor. Gövde odası, yaklaşık 32 gramdan küçük fare için tasarlanmıştır; Buna karşılık, çok odalı yatağımız daha geniş bir fare vücut boyutları yelpazesini destekliyor. Amaçlanan organ, tarama süresi ve çözünürlüğe bağlı olarak, Dazai ve ark.'ın protokolü burada açıklanan protokole göre bazı avantajlar sağlayabilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü R01 CA258314 hibe ve MSU Tetrad Girişimi Disiplinlerarası Araştırma Girişimi 2024 baskısı tarafından LFS'ye desteklendi. MSU Hassas Sağlık Programı Doku Analiz Çekirdeği, MSU Nicel Sağlık Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü/Hassas Sağlık Programı İleri Moleküler Görüntüleme Tesisi, MSU Kampüs Hayvan Kaynakları, MSU Veteriner Tanı Laboratuvarı ve MSU Nicel Biyoeleman Analiz ve Haritalama (QBEAM) Merkezi'ne teknik yardımları için minnettarız.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3D yazıcı StratasysJ750 Çok hayvanlı MRI yatak insertleri için
Gemcitabine HClApexBioA1402-500IP enjeksiyonları ve nbsp için;
HOROSHOROShttps://horosproject.org/MRI analizi için
İzofluranCovetrus11695067772Fare anestezisi için
İzofloran buharlaştırıcıSOMNI ScientificVS6002Fare anestezisi için
Lo-Doz U-100 İnsülin ŞırıngalarıBD14-826-79IP enjeksiyonları ve nbsp için;
luer kilitli tüp bağlantıları, naylon düz bujlar, 1/16" tüp ID x7 için dikenliMcMaster51525K521Çok hayvanlı MRI yatak montajı için
Luer kilitli tüp bağlantıları, plug, 1/16" bardbed boru ID x2 içinMcMaster7466N11Çok hayvanlı MRI yatak montajı için
Erkekten erkeğe luer konnektör x2SAIMMLÇok hayvanlı MRI yatak montajı için
MR uyumlu küçük hayvan izleme ve kapı sistemiSAIIModel 1030MRI sırasında hayvanları izlemek
MRI yatak adaptörüBrukerT150743Tedarikçi tarafından sağlanan MRI yatak bileşeni
MRI bobin, 72 mm IDBrukerT20209V3Tedarikçi tarafından sağlanan MRI bobini
Multimodality beşik orta sıçanBrukerT151629Satıcı tarafından sağlanan MRI yatağı
oftalmik kayganlaştırıcı Covetrus75848Anestezi sırasında kullanım için
ParaVision 360 yazılımıBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlMRI analizi için
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlMRI analizi için
preklinik MRI sistemi BrukerBioSpec 70/30MRI için
Stratasys Vero Clear reçineStratasysRGD810Çok hayvanlı MRI yatak üretimi için
Tee Soket-Soket-Soket Konnektörleri, Luer Kilitli Tüp x2McMaster51525K443Çok hayvanlı MRI yatağı ve nbsp için;
Boru (iç çapı 1/16", dış çapı 1/8")BrukerT12330Çok hayvanlı MRI yatak montajı için

Kaynaklar

  1. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  2. Lafaro, K. J., Melstrom, L. G. The paradoxical web of pancreatic cancer tumor microenvironment. Am J Pathol. 189 (1), 44-57 (2019).
  3. Kleeff, J., et al. Pancreatic cancer. Nat Rev Dis Primers. 2, 16022(2016).
  4. Collisson, E. A., Bailey, P., Chang, D. K., Biankin, A. V. Molecular subtypes of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (4), 207-220 (2019).
  5. Grimm, J., Potthast, A., Wunder, A., Moore, A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 106 (5), 806-811 (2003).
  6. Ireson, C. R., Alavijeh, M. S., Palmer, A. M., Fowler, E. R., Jones, H. J. The role of mouse tumour models in the discovery and development of anticancer drugs. Br J Cancer. 121 (2), 101-108 (2019).
  7. Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. Cancer J. 18 (6), 502-510 (2012).
  8. Cook, N., Olive, K. P., Frese, K., Tuveson, D. A. K-ras-driven pancreatic cancer mouse model for anticancer inhibitor analyses. Methods Enzymol. 439, 73-85 (2008).
  9. Schipper, J., et al. Loss of microRNA-21 leads to profound stromal remodeling and short survival in K-ras-driven mouse models of pancreatic cancer. Int J Cancer. 147 (8), 2265-2278 (2020).
  10. Uprety, D., Adjei, A. A. KRAS: from undruggable to a druggable cancer target. Cancer Treat Rev. 89, 102070(2020).
  11. Buscail, L., Bournet, B., Cordelier, P. Role of oncogenic KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (3), 153-168 (2020).
  12. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  13. Farr, N., et al. Noninvasive characterization of pancreatic tumor mouse models using magnetic resonance imaging. Cancer Med. 6 (5), 1082-1090 (2017).
  14. Yin, T., Liu, Y., Peeters, R., Feng, Y., Ni, Y. Pancreatic imaging: current status of clinical practices and small animal studies. World J Methodol. 7 (3), 101-107 (2017).
  15. Rojas, J. D., et al. Validation of a combined ultrasound and bioluminescence imaging system with magnetic resonance imaging in orthotopic pancreatic murine tumors. Sci Rep. 12 (1), 102(2022).
  16. Vohra, R., et al. Evaluation of pancreatic tumor development in KPC mice using multiparametric MRI. Cancer Imaging. 18 (1), 41(2018).
  17. Serkova, N. J., et al. Preclinical applications of multi-platform imaging in animal models of cancer. Cancer Res. 81 (5), 1189-1200 (2021).
  18. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse neuroanatomical magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (48), e2497(2011).
  19. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  20. Sempere, L. F., Powell, K., Rana, J., Brock, A. A., Schmittgen, T. D. Role of non-coding RNAs in tumor progression and metastasis in pancreatic cancer. Cancer Metastasis Rev. 40 (1), 1-20 (2021).
  21. Smith, E. S., et al. Clinical applications of short non-coding RNA-based therapies in the era of precision medicine. Cancers (Basel). 14 (6), 1588(2022).
  22. Sempere, L. F., Keto, J., Fabbri, M. Exosomal microRNAs in breast cancer towards diagnostic and therapeutic applications. Cancers (Basel). 9 (7), 71(2017).
  23. Sempere, L. F., Azmi, A. S., Moore, A. MicroRNA-based diagnostic and therapeutic applications in cancer medicine. Wiley Interdiscip Rev RNA. 12, e1662(2021).
  24. Nakisa, A., et al. Tumor-associated carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), a promising target for antibody-based detection, diagnosis, and immunotherapy of cancer. ChemMedChem. 19 (24), e202400491(2024).
  25. Miller, A. L., Garcia, P. L., Yoon, K. J. Developing effective combination therapy for pancreatic cancer: an overview. Pharmacol Res. 155, 104740(2020).
  26. Dreyer, S. B., Beer, P., Hingorani, S. R., Biankin, A. V. Improving outcomes of patients with pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 22 (6), 439-456 (2025).
  27. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 17 (2), 108-123 (2020).
  28. Koltai, T., et al. Resistance to gemcitabine in pancreatic ductal adenocarcinoma: a physiopathologic and pharmacologic review. Cancers (Basel). 14 (10), 2486(2022).
  29. Casper, E. S., et al. Phase II trial of gemcitabine (2,2′-difluorodeoxycytidine) in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Invest New Drugs. 12 (1), 29-34 (1994).
  30. Moore, M. Activity of gemcitabine in patients with advanced pancreatic carcinoma: a review. Cancer. 78 (3 Suppl), 633-638 (1996).
  31. Ho, T. T. B., et al. Combination of gemcitabine and anti-PD-1 antibody enhances the anticancer effect of M1 macrophages and the Th1 response in a murine model of pancreatic cancer liver metastasis. J Immunother Cancer. 8 (2), e001367(2020).
  32. Kempinska, K., et al. Genetic ablation of microRNA-10b improves treatment outcomes in mouse models of pancreatic cancer. Cancer Res. 84 (6 Suppl), Abstract 467 (2024).
  33. Fan, J., et al. Species-specific hepatic uptake of [64Cu]Cu-EOB-NOTA, a newly designed hepatospecific PET agent. Mol Imaging Biol. 27 (3), 305-312 (2025).
  34. Ramirez, M. S., Esparza-Coss, E., Bankson, J. A. Multiple-mouse MRI with multiple arrays of receive coils. Magn Reson Med. 63 (3), 803-810 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Çok Hayvanlı MRGPankreas Kanseri ModelleriTümör ÖlçümüKPC Fare ModeliPreklinik GörüntülemeTümör İzlemeGemsitabin TedavisiAnatomik GörüntülemeTümör Hacmi Değerlendirmesi
Pankreas Kanseri Fare Modellerinde Tümör Ölçümleri İçin Çok Hayvanlı Manyetik Rezonans Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.