Bu protokol, tümör olmayan meme epitel hücrelerinde Apoptoz İnhibörü 5 (Api5) tarafından indüklenen kanser kök noktasını incelemek için mamosfer oluşum testinin oluşturulma yöntemini açıklar. Birincil nesil mamutsferlerden toplanan lizatlar, kök hücre benzeri özelliklerin indüksiyonunu değerlendirmek amacıyla farklı kök belirteçleri için analiz edilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mamokür Testi, tümör olmayan meme epitel hücre hatlarında Api5 kaynaklı kök konumunu ortaya koydu
Bu makalede
Özet
Özet
Meme kanseri, dünya genelinde kadınlar arasında en yaygın kanser olmaya devam ediyor ve yaş standartlaştırılmış insidans ve ölüm oranlarına sahip olup. Meme kanserini hedefleyen tedavilerdeki ilerlemelere rağmen, hastaların %20'si hastalığın nüksü göstermektedir; bu durum, tedaviye dirençli kanser kök hücreleri (CSC) popülasyonuna bağlanabilir. Bu CSC'ler, tümör kütlesinin eksik rezeksiyonu nedeniyle geleneksel tedavilerden sağ çıkabilir veya tümör kitlesinin eksik rezeksiyonu nedeniyle devam edebilir; bu da daha sonraki aşamada tekrar etmesine yol açar. Bu nedenle, son araştırmalar bu dirençli hücre popülasyonunu tanımlamak, izole etmek ve hedeflemeye odaklanmıştır. In vitro, mamokür oluşumu testi, meme epitelyal popülasyonlarında kök benzeri hücreleri zenginleştirmek ve çoğaltmak için sağlam üç boyutlu bir süspansiyon kültür sistemi olarak hizmet verir. Burada, apoptoz İnhibörü 5'in (Api5) aşırı ekspresyonuyla tümör olmayan meme epitel hücrelerinde mümkün olan kanser kök hücresi benzeri fenotipi değerlendirmek için mamosfer testini kullanan bir yaklaşım sunuyoruz. Protokol, mamutsferlerin seri geçişler aracılığıyla yayılmasını ve mamoküre oluşum verimliliğini ve kendini yenileme kapasitesini değerlendirmeyi içerir. Ayrıca, mamukürlerden toplanan protein lizatları, immünoblotlama yoluyla belirlenmiş kök belirteçleri için incelenir. Bu test, meme epitelyal hücre popülasyonlarında kanser kök hücresi benzeri özelliklerin Api5 gibi yeni düzenleyicilerin araştırılmasına olanak tanır. Tanımlanan yaklaşım, moleküler müdahalelerin karşılaştırmalı çalışmaları veya CSC'leri hedef alan terapötik ajanların in vitro taraması için uyarlanabilir.
Giriş
Kemoterapiye dirençli meme kanserlerinin artması, tedavi direncinin ve nüks etmenin temel nedeni olan kanser kök hücreleri olarak bilinen bir kanser hücresi popülasyonunun belirlenmesi ve hedeflenmesine giderek daha fazla vurgu yapılmasına yol açmıştır. Bu hücreler, farklılaşmadan kaçınma ve hareketsiz kalma yetenekleriyle karakterize edilir; bu da farklı kanser tedavi yöntemlerine karşı dirençgösterebilmelerini sağlar 1,2. Meme kanseri kök hücrelerini tanımlamak için mamosfer oluşumu testi 3,4,5
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Doku kültür plakalarının Poli(2-hidroksietil metakrilat), pHEMA ile kaplanması
- 1,2 g pHEMA (molekül ağırlığı ̴ 300.000) %95 etanolden oluşan 100 mL'de sürekli karıştırarak 65 °C'de çözülerek %1,2 pHEMA çözeltisi hazırlanır ( bkz. Malzemeler Tablosu).
- Standart doku kültür plakalarını, 6 kuyruklu bir plakanın başına 1 mL uygulanarak pHEMA ile kaplayın. PHEMA çözeltisinin hacmi, doku kültür damarının boyutuna göre ayarlanabilir.
- Tabakları steril koşullarda 40 °C sıcaklıkta fırında kurumasına izin verin.
- Plakaları 15 dakika UV ışığına maruz bırakın, ardından Dulbecco'nun fosfatla tamponlanmış t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yapışmayan koşullarda mamosfer oluşum verimliliğini değerlendirmek için, protokole göre kontrol ve Api5 aşırı ekspresyonlu 3D dissosiyasyon MCF10A hücreleri, poliHEMA kaplı plakalara yerleştirildi. Api5 aşırı eksprese hücreleri, kontrollere göre ortalama mamokür oluşum verimliliğinde 1,58 kat artış göstermiştir (Şekil 1B,C). Bu artış, Api5'in daha yüksek ekspresyonunun, yapışmayan, serum yoksunluğu koşullarında hayatta kalıp çoğalan kök hücre benzeri öncüllerin oranını artır.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yerleşik kanser hücre hatlarının veya tümör köken hücrelerin tek katmanlı kültürleri, kanser fenotiplerini düzenleyen çeşitli moleküler yollar hakkında içgörüler sağlarken, kanser kök hücrelerine odaklanan araştırmalar iki boyutlu kültürlerde yapılamaz. Kanser kök hücrelerinin mevcut tedavi stratejilerinden sonra nüks için önemli bir katkı faktörü olduğuna inanıldığından, bu hücreleri incelemek için sağlam testler oluşturmakgereklidir .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) tarafından verilen bir hibe ve kısmen IISER, Pune Core fonları tarafından desteklendi. S.B., UGC-SRF bursu tarafından finanse edilmiştir. MCF10A hücrelerini cömertçe sağladığı için Prof. Raymond C. Stevens'a (Scripps Araştırma Enstitüsü, ABD) ve Dr. Abhijith K'ye (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) makale üzerindeki değerli katkıları için teşekkür etmek isteriz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidifiye inkübatör | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Tavşan pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 seyreltik, 4 °C'de gece boyu inkübasyon |
| Anti-GAPDH antikoru | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 seyreltik, oda sıcaklığında 1 saatlik inkübasyon |
| Anti-Nanog Tavşan mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 seyreltik, 4 °C'de gece boyu inkübasyon |
| Anti-Oct3/4 Antikoru (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 seyreltik, 4 °C'de gece boyu inkübasyon |
| Anti-Sox2 Antikoru (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 seyreltik, 4 °C'de gece boyu inkübasyon |
| B-27 Takviyesi (50x), vitamin A içermeyen | Invitrogen | 12587010 | |
| Santrifüj | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Kolera toksini | Sigma | C8052-1MG | dH2O içinde 1 mg/mL stoğu |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal büyüme faktörü (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | dH2O içinde 100 mg/mL stoğu |
| Etanolü mutlak 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Almanya | 58051 L05 | |
| Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA) | SRL | 43272 | |
| Yüksek glikozlu DMEM, sodyum pirüvatsız | Invitrogen | 11965126 | |
| Ateş atı serumu | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydroklorik asit (HCl) | Qualigens | Q29145 | Tris-HCl'in (pH 8.0) pH'ını ayarlamak için kullanılır |
| Hidrokortizon | Sigma | H0888 | Etanol içinde 1 mg/mL stoğu |
| ImageJ | Görüntü işleme yazılımı | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western kimilüminisan HRP substratı | Merck | WBKLS0500 | |
| İnsülin | Sigma | I1882 | %1 glasiyal asetik asit içinde 10 mg/mL stoğu |
| Nikon Eclipse TS-100 mikroskopu | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A hücreleri | Prof. Raymond C. Stevens'tan (Scripps Research Institute, ABD) hediye | ||
| Penisilin-Streptomisin | Lonza | 17-602E | |
| Fenilmetil sülfonil florür (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Grafik yazılımı | GraphPad Prism 10 | ||
| Poli(2-hidroksietil metakrilat) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | %95 etanol içinde %1.2 pHEMA |
| Sodyum klorür (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodyum desoksikolat | Amresco | 0613-100G | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodyum florür (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodyum ortovanadat | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris tamponu | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Kaynaklar
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional th....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
