Yöntem makalesi

Dolaşan Nadir Hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör DNA Mutasyonlarının Profillenmesi Hücre İzolasyon Sistemi ve Damla Dijital PCR Kullanılarak

DOI:

10.3791/70016

⸱

23 Haziran 2026

 ,  ,  ,  , 
1Bio-Rad Laboratories

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, akciğer kanseri hücrelerinde tam kan içeren ve sprek olan yapay bir örnekten nadir kanser hücrelerinin izole edilmesini gösteren bir protokol sunuyoruz. Protokol, yarı otomatik, etiketsiz hücre izolasyon platformu kullanır. Zenginleştirilmiş hücreler, epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonları için damlalı dijital PCR kullanılarak analiz edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epidermal büyüme faktörü geninde (EGFR) bulunan mutasyonlar, akciğer kanseri hastaları için en etkili tedavilerin belirlenmesinde kritik öneme sahiptir. EGFR mutasyonları için rutin testler, tümör biyopsisi veya akciğer kanseri hastalarının plazmasından ctDNA analizi şeklinde olabilir. Akciğer kanseri hastalarından kan örneklerinin testi, akciğer kanserinin varlığı veya tekrarı hakkında bilgi sağlamak için rutin olarak yapılsa da, ctDNA tespiti veya CTC tespiti yoluyla yapılır, ancak genellikle yakalanan hücrelerin sonraki moleküler analizini içermez. Nadir dolaşımda bulunan tümör hücrelerinde (CTC) bulunan EGFR genindeki bireysel mutasyonların tespiti, hedefli tedavilerin potansiyel etkinliği ve bunun ötesinde, özellikle küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hasta prognozunu daha iyi anlama sağlayabilir. Ne yazık ki, bu tür dolaşımda bulunan tümör hücrelerinin nadirliği ve genomik bilgilerini sorgulamak için sade prosedürlerin olmaması önemli bir tespit zorluğu yaratmaktadır.

Bu protokolün amacı, tam kandan CTC'lerin gerçekçi potansiyelini göstermek ve moleküler içeriklerini ddPCR ile değerlendirmektir. Dolaşımdaki tümör hücrelerini yakalamak için yarı otomatik, boyut bazlı bir hücre izolasyon platformu kullanıldı ve bu hücreler daha sonra moleküler analiz için geri alındı. Yakalanan hücrelerin genomik DNA'sında spesifik EGFR mutasyonlarının varlığını belirlemek için, ddPCR testleri kullanılarak EGFR pT790M ve EGFR pL858R için yapıldı.

İki ayrı akciğer kanseri hücre hattı (A549 ve H1975) tam kandan aktif olarak zenginleştirildi ve H1975 hücre hatlarında bulunan mutasyonların doğru nicelenmesi ddPCR kullanılarak gerçekleştirildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı biyopsilerin değeri üzerine devam eden translasyonel araştırmalar ve terapiseçimi 1'de ctDNA izlemenin klinik değerini özellikle gösteren son yayınlarla sıvı biyopsiler olgunlaşmakta olgunlaşmaktadır. Sıvı biyopsiler, geleneksel doku biyopsi yöntemlerine kıyasla kanser izleme ve prognoz için alternatif, daha az invaziv bir yöntem sunar. Kapsamlı araştırmalar, kanda bulunan parçalanmış DNA (hücresiz DNA, cfDNA) ve özellikle tümör türediği alt bölmeye, dolaşımdaki tümör DNA'sına (ctDNA) odaklanmıştır. ctDNA, son yirmi yılda kapsamlı şekilde incelenmiş ve tümör-spesifik gen mutasyonları (örneğin SNV'ler ve Yapısal varyantlar), ayrıca metilasyon belirteçleri ve tümör dışı cfDNA ile karşılaştırıldığında belirgin bir parça desenine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu spesifik ctDNA özellikleri artık kanser hastalarının erken teşhis, tedavi yanıtı, minimal kalıntı hastalık (MRD) ve tedaviye direnç gibi moleküler durumlarını izlemek için kullanılmaktadır. Benzer şekilde, birincil tümör bölgesinden kan damarlarına ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), son zamanlarda hastalık ilerlemesi ve tekrarlanma potansiyeliyle yakın ilişkili olan umut verici biyobelirteçler olarak evrimleşmiştir. CTC'ler üzerine yapılan çok erken ilk çalışmalar çoğunlukla protein belirteci ifadesi vesayma 2'ye dayansa da, CTC'lerin moleküler düzeyde incelenmesinde önemli ilerlemeler sağlanmıştır; bunlar arasında meme kanseri için Östrojen reseptörü 1'de genomik mutasyon tespiti ve çeşitli kanserler için epidermal büyüme faktörü geni (EGFR) dahil olmak üzere önemli ilerlemeler olmuştur.

EGFR mutasyonları, hem patogenez ve prognozun belirlenmesinde hem de akciğer kanseri hastaları için en etkili tedavilerin belirlenmesinde kritiköneme sahiptir 3. EGFR mutasyonları için rutin testler, tanı veya ilerlemede katı tümör biyopsisi veya daha yakın zamanda nüks/dirençli akciğer kanseri olan hastaların plazmasından ctDNA örneklemesişeklinde olabilir 4. Ancak, ctDNA tabanlı yaklaşımların aksine, CTC kaynaklı genomik materyalin analizi, sağlam tümör hücrelerinin ve mutasyon profillerinin doğrudan değerlendirilmesini sağlar. ctDNA MRD çalışmalarının yanı sıra, nadir CTC'lerde bulunan EGFR genindeki mutasyonların tespiti, tedavi rejimlerinin potansiyel etkinliği ve bunun ötesinde, özellikle küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hasta prognozunu daha iyi anlama sağlayabilir. CTC'lerin nadir olması ve klinikler için kullanıcı dostu aletler kullanan sade protokollerin eksikliği, daha geniş bir benimseme için ciddi bir engel oluşturmaktadır. Bu sınırlama, hem verimli CTC izolasyonu hem de sonraki moleküler analizleri mümkün kılan standartlaştırılmış ve erişilebilir bir iş akışına olan ihtiyacı ortaya koyuyor. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, dolaşımdaki tümör hücrelerinin zenginleştirilmesi ve ardından EGFR mutasyonlarının tespit edilmesi için birleşik hücre izolasyonu ve dijital PCR yaklaşımıyla tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktır.

Mikrofluidik hücre yakalama slaytlarına sahip Genesis Hücre İzolasyon Sistemi, CTC'leri yarı otomatik bir süreçte, yüksek canlılık ve yüksek yakalama verimliliğiyle, birincil beyaz ve kırmızı kan hücresi popülasyonuna kıyasla daha büyük boyutları ve daha düşük deformasyon yapısınedeniyle yakalar. 5,6. Yakalanan CTC'ler, mikrofluidik hücre yakalama slaytlarından geri akışla slayttan geri dönüş yoluyla geri alınarak daha ileri genomik analiz için elde edilebilir. Yakalanan hücrelerin genomik DNA'sında spesifik EGFR mutasyonlarının varlığını belirlemek için, CTC kaynaklı genomik DNA üzerinde EGFR T790M ve L858R testleri kullanılarak ddPCR yapıldı.

Bu protokol, model bir CTC örneği ve ticari olarak mevcut ddPCR testleri kullanarak, CTC'lerde kanserle ilişkili mutasyonların hedefli olarak tespit edilmesi için bir giriş noktası örnek göstermek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, dolaşımdaki tümör hücrelerinde kanserle ilişkili mutasyonların tespit edilmesi için pratik bir yaklaşım sunar ve sıvı biyopsi uygulamalarında daha fazla araştırmayı destekleyebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik açıklama:

Kan örnekleri araştırma amaçlı yetkili kaynaklardan alındı ve örnek alınmadan önce tüm bağışçılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. İnsan kan örneklerini içeren tüm deneysel protokoller, Discovery Life Sciences (Alabama, ABD) kan satıcısının Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından incelenip onaylandı. İnsan kanı örneklerini içeren tüm prosedürler, kurumsal araştırma komitesinin etik standartlarına ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Yarı otomatik hücre izolasyon sistemi kullanarak kanser hücresi zenginleştirme

Not: Bu bölüm, dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) yarı otomatik hücre izolasyon platformu kullanılarak zenginleştirilmesini ve ardından damlalı dijital PCR ile EGFR mutasyon tespitini anlatır. Bir model CTC örneği uygulanabilirliği göstermek için kullanılır ve klinik uygulamadan önce test doğrulaması önerilir. İki küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) hücre hattı kullanıldı: NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M mutasyonları) ve A549 (EGFR vahşi tip), mutasyon tespiti için negatif kontrol olarak kullanıldı.

  1. Kan Örneği
    1. Kan bağışçıların/hastaların kan toplamadan önce bilgilendirilmiş onay alındığından emin olun. İnsan örnekleri, kan dahil olmak üzere, gerekirse Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı alın.
    2. Fizibilite testi için, yalnızca araştırma amaçlı yetkiliüçüncü taraf tedarikçiden kan örneği alın.
    3. Periferik kanı Etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) tüplerinde toplayın ve örneği Genesis Zenginleştirme protokolü ile 48 saat içinde işleyin.
      Not. Sonraki analizler ve Genesis Zenginleştirme protokolü için EDTA tüpleri önerilir. Streck ve EDTA tüpü, Genesis Enumeration protokolleriyle (doğrudan/dolaylı) slayt immünboyama için kullanılabilir.
    4. EDTA tüplerinde toplanan kan örneklerini 2–8 °C sıcaklıkta depolayın. Genesis hücre izolasyonu için ön işlem gerekmez ve Zenginleştirme protokolü için 10 mL'ye kadar tam kan kullanılabilir.
  2. Model CTC Numune/Klinik Örnek Hazırlığı
    1. 100–1.000 hücre konsantrasyonunda, uygun hücre kültür ortamında veya fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) tampon içinde 100–1.000 hücre konsantrasyonunda bir hücre stok çözeltisi hazırlayın. Klinik örnekler kullanılıyorsa bu adımı atlayın.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan yükselen konsantrasyonlar, genellikle gözlemlenen klinik CTC seviyelerinden daha yüksektir ve yalnızca yöntem gösterimi amaçları için tasarlanmıştır.
    2. Sağlıklı bir bağışçıdan alınan 10 μL tam kan ile 10 μL hücre stok çözeltisini ekleyerek model bir CTC örneği hazırlanır. Klinik örneklerde, hastaların tüm kan örneklerine kanser hücresi dahil edilmesin.
    3. Kan örneğini eşit hacimde PBS (1x) ile karıştırın ve oda sıcaklığında kan sallayıcı üzerinde nazikçe karıştırın, ta ki kullanılana kadar. Depolama bir saati geçiyorsa, 4 °C'de saklanın.
  3. CTC Zenginleştirme
    1. Genesis Hücre İzolasyon Sistemi'ni açın ve sistemin başlatılmasını bekleyin. Bu 5 dakikaya kadar sürebilir.
    2. Atık kavanozunu istasyon bölmelerinin tabanına yerleştirin ve atık kavanozu borusunu atık kavanozuna takın.
    3. Boruyu sıkış valfine bastırın, yerine oturduğunu hissedince ve Genesis System borusunu atık kavanozu çıkışına takın.
    4. Ana ekrandan "start" tuşuna basarak ve ekrandaki 'Self-Test' tuşuna dokunarak Kendi Testi'ni çalıştırın.
    5. Self-Test tamamlandığında, protokol seçimlerinden '2.0 Kit Zenginleştirme' seçeneğini seçin.
    6. Ekrandaki talimatları takip edin, gerekli veri giriş alanlarını doldurun ve Priming and Assembly prosedürünü tamamlayın. %70 etanol ve 1x PBS kullanılarak başarılı priming, DNA çıkarımı için en iyi hücre yakalama performansı ve geri kazanımı sağlar. Astarlama yaklaşık 20 dakika sürüyor.
    7. Doğru zenginleştirme programının (2.0 Kit Zenginleştirme) seçildiğinden ve tüm boru bağlantılarının ve sürgü yerleşimlerinin doğru şekilde sabitlendiğinden emin olun. Numune yükleme sırasında hava kabarcıklarının oluşmasından kaçının, çünkü bu akış tutarlılığını ve yakalama verimliliğini etkileyebilir.
    8. Adım 1.2.3'ten (Model CTC Numunesi/Klinik Numune Hazırlığı) hazırlanan model örneğini giriş hunisine nazikçe dağıtın ve sistem ekranında 'Resume' tuşuna basarak Zenginleştirme protokolünü sürdürün.
    9. CTC yakalaması tamamlandığında, yarı otomatik hücre izolasyon sistemi kullanıcıya atık kavanozunu çıkarmasını ve astar rezervuarını yeniden bağlamasını önerir.
    10. Genesis Sistemi borusunu atık kavanozundan ve 4 mL seyreltme tamponu pipetinden astar rezervuasına ayırın.
    11. Geri akış adaptörünü priming rezervuarına takın ve Genesis Sistemi borusuna yeniden takın. Zenginleştirme protokolünü sürdürmek için ekranda Devam tuşuna basın. Bu, mikrofluidik slayttaki yakalanan hücreleri geri akış uygulanarak giriş hunisine serbest bırakır.
    12. Geri kazanılan hücreleri, giriş hunisinden 5.0 mL Eppendorf tüpüne pipet yaparak toplayın. Tüm sulu örnekleri giriş hunisindeki topladığınızdan emin olun; bu örnekler genellikle 4 mL'yi geçebilir.
    13. Geri kazanılan örneği 600 g ile 5 dakika boyunca santrifüjlenerek yakalanan hücreleri hücre lizisinden önce peletleyin.
    14. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve DNA Çıkarma protokolüne geçin (Bölüm 1.4).
  4. DNA Çıkarımı
    Dikkat: DNAzol BD, ciltle temas ettiğinde veya yutulduğunda zararlıdır. Cilt ve gözlerle temas kurmaktan kaçının. Sadece kimyasal dumanlı davlumbaz ortamında kullanın ve herhangi bir sis, buhar/sprey solumayın. Ciltle temas durumunda hemen suyla yıkayın.
    1. Adım 1.3.14'ten itibaren tüpe doğrudan 1 mL DNAzol BD ekleyin.
    2. Numunenin tüm hacmini yeni bir Eppendorf DNA LoBind 1.5 mL Mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve şiddetle sallasın.
    3. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka edin. Tüpü güçlü bir şekilde girdablandırın ve en az 4 dakika oda sıcaklığında kuluçka yapın.
    4. DNA geri kazanımını maksimize etmek için liz ve çökeltme aşamalarında tam karıştırmayı garanti edin. RNA kontaminasyonu endişe kaynağa sahipse, isteğe bağlı RNaz tedavisi de dahil edilebilir.
    5. DNAzol BD-hücre lizatat örnek karışımına doğrudan 400 μL izopropanol ekleyin.
    6. Tüpü 10.000 g ile 6 dakika boyunca santrifüjlenerek DNA çökelti.
    7. Santrifüjleme sonrası üst sıvıyı çıkarın ve peletlenmiş DNA'ya nazikçe 0,5 mL DNAzol BD ekleyin.
    8. DNA pelleti tamamen dağınılana kadar tüpü girdabla tutun.
    9. Karışımı 10.000 g ile 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    10. Üst yüzeyi çıkarın ve DNA pelletini 1 mL %75 etanol pipetiyle yıkayın.
    11. 9–10. adımları tekrarlayın, toplamda iki yıkama yapılır.
    12. Tüpün altındaki kalıntı etanol mikropipet ile alın.
      NOT: Pelletin tamamen kurumadığından emin olun.
    13. CTC örneklerinden DNA'yı çözünürmek için 20 μL DNaz/RNazsız deionize (DI) su ekleyin.
    14. Örnekteki çift zincirli DNA'yı (dsDNA) Qubit 1x dsDNA Yüksek Duyarlılık Analiz Kiti veya Biyoanalizör Yüksek Duyarlılık DNA Analizi gibi dsDNA nicelendirme test setleri/platformları kullanarak nicelikle ölçün.
    15. Ayrıştırılmış DNA örneklerini bozunmayı önlemek için 4 °C veya -20 °C sıcaklıkta sakla.
      Duraklama Noktası: Çıkarılan DNA örnekleri kısa süreli depolama için -20 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de depolanabilir, ardından sonraki analizlere geçilir.

2. DDPCR kullanarak EGFR Mutasyon Analizi

Dijital PCR, nadir mutasyonların yüksek hassasiyet ve hassasiyetle tespit edilmesi için uygun bir yöntemdir. Tek bir tüpte sağlanan ddPCR mutasyon tespit testleri genellikle mutant bir alleli hedefleyen FAM etiketli bir prob ve vahşi tip bir alleli hedefleyen ikinci bir HEX etiketli probu içerir.

  1. Reaksiyon kurulumu ve damla üretimi
    1. Çözülme ddPCR Supermix, ddPCR Mutasyon Tespiti Testleri buz üzerinde.
    2. Her tüpü girdabla içeriklerin homojen olduğundan emin olun, çünkü -20 °C sıcaklıkta depolama sırasında konsantrasyon gradyanı oluşabilir.
    3. Tüpün altındaki tortu içeriğine kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
    4. Reaksiyon karışımını Tablo 1'deki tarife göre hazırlamadan önce istenen konsantrasyonda ekstraksiyon DNA örnekleri hazırlayın.
    5. Süper karışım, testler ve krestriksiyon enzimleri ile test için gereken tüm örnekler için su içeren bir premix oluşturun ve son reaksiyon bileşeni olarak numune DNA'sını tek tek ekleyin. DNA örneklerinin nihai konsantrasyonu 50 fg–100 ng olduğundan emin olun.
      Not: Damla üretiminden önce kısıtlama sindirimiyle DNA parçalanması, doğruluğu artırmak, viskoziteyi azaltmak ve şablon erişilebilirliğini artırmak için önerilir. DdPCR kurulumu sırasında 2–5 U krestriksiyon enzimi kullanılarak doğrudan sindirim önerilir. EGFR nokta mutasyon testleri (T790M/L858R) için MseI önerilir; Özelleştirmeden önce uyumlu enzimler için analiz veri sayfalarına bakınız. Bireysel testler için veri sayfaları, Bio-Rad dijital testler portalından indirilebilir (Bio-Rad Damlası Dijital PCR Testleri | Ana sayfa)
    6. En az bir kuyu için negatif kontrol hazırlayın; yalnızca bilinmeyen örneklerin konsantrasyonuna benzer bir konsantrasyonda yabani tip şablon içeren.
    7. Reaksiyon tüplerini iyice karıştırmak için girdabla karıştırın ve kısa süreliğine santrifüj yapın, böylece tüm örnekleri her reaksiyon tüpünün dibine biriktirin. Reaksiyon tüplerinin oda sıcaklığında 2 dakika dengelenmesine izin verin.
    8. Her reaksiyon karışımından 20 μL mikrofluidik kartuşun (DG8 Kartuşu Kartuşu) örnek kuyusuna yüklenin, ardından 75 μL Damla Üretim Yağı ve problar için petrol kuyularına akın.
    9. Kartuşu bir conta ile kapatın ve QX200 Damla Jeneratörüne yerleştirin.
    10. Damla Jeneratörü'nün üstündeki düğmeye basarak kapağı kapatın. Kapak kapandığında, damla üretimi otomatik olarak başlar. Bu prosedür, mikrofluidik kartuşun mikrokanallarındaki örnekleri ve yağı birleştirerek her örnek için ~20.000 nanolitre boyutunda damlacık emülsiyonu oluşturur.
  2. PCR amplifikasyonu (Termal döngü koşulları)
    1. Termal döngü koşullarını Tablo 2'de önerildiği gibi termal döngü cihazında programlayın
    2. Damla üretimi tamamlandığında, enstrumandaki tüm ışıklar tam yeşil yanır. Damla Jeneratörü üzerindeki düğmeye tekrar basarak aleti açın ve kartuş tutucusu ile kartuşu çıkarın.
    3. Tek kullanımlık contanı çıkarın ve kartuştan 45 μL damla çekin, pipet ucunda hafif bir açı olmasına özen göstererek damlaların parçalanmasını önleyin.
    4. Damlaları ddPCR 96-Hole Plakalarına dağıtın ve plakayı PX1 PCR Plaka Kaplama ile PCR Plaka Isı Sızdırmazlığı ile mühürleyin.
    5. Damlacık içeren 96 kuyu plakasını mühürledikten sonra, 96 kuyu plakasını dikkatlice Adım 2.2.1'de hazırlanan termal döngüye aktarın ve termal döngüye başlayın.
  3. Droplet okuma ve veri analizi
    1. ddPCR Damla Okuyucu enstrümanını (QX200 Damla Okuyucu veya QX600 Damla Okuyucu) ve QX Manager Yazılımının kurulup yapılandırıldığı bağlı bir bilgisayarı başlatın.
    2. Termal döngü adımı tamamlandıktan sonra, mühürlenmiş 96 kuyu plakasını bir Damla Okuyucu cihazına taşıyın.
    3. Open QX Manager Software, deneysel tasarıma dayalı yeni bir plaka düzenini yapılandırmak için. 'Plaka Ekle' sekmesine tıklayın, yazılım Plakayı Yapılandır butonunu etkinleştirecektir. Plakaya örnek detaylarını atamak için 'Plakayı Yapılandır' tuşuna tıklayın.
    4. Plaka ve kuyu bilgi detaylarını doldurun, kuyuları seçin, örnek durumunu, deney türünü, hedef isim(lerini), hedef tip(ler)ini ve referansı belirtin: FAM için ch1 ve HEX rengi için ch2.
    5. Kuyunu yüklemek için 'Uygula' tuşuna tıklayın ve işiniz bitince 'OK' seçeneğini seçin.
    6. Tüm örnekler için plaka düzeni tamamlandığında, damla okuma sürecini başlatmak için 'Çalıştır' seçeneğini seçin.
    7. Veri toplandığında, 'Analyze' bölümünde kuyu seçicideki örnekleri seçin ve mutantı vahşi tipli sinyallerden ayırt etmek için ddPCR Mutasyon Tespit Testi için uygun eşik belirleyin.
    8. Bu protokolde kullanılan dupleks mutasyon testleri için, eşikler QX yöneticisi yazılımının varsayılan ayarları kullanılarak otomatik olarak ayarlanabilir (sonuçlara referans).
    9. Alternatif olarak, eşikler çapraz tüy veya lasso yöntemleriyle manuel olarak ayarlanabilir; böylece eşikler veya lasso sınırları pozitif ve negatif kümeleri ayırır ve her koşuda hem pozitif hem de negatif kontrollerle tanımlanan küme konumlarına göre konumlandırılır.
      NOT: Eşikler, tekrarlanabilir mutasyon çağrısı sağlamak için pozitif ve negatif kontroller kullanılarak bir partideki örnekler arasında tutarlı şekilde belirlenmelidir.
    10. Bildirilen konsantrasyon, son 1x ddPCR reaksiyonunun μL başına kopya sayılarıdır.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofluidik hücre yakalama slaytlarıyla Genesis hücre izolasyon sistemi, kan örneklerindeki sivri kanser hücrelerinin ortalama %84'ünü 25–250 hücre·mL-1 konsantrasyonunda izole etti (Şekil 3A). Bu yüksek yakalama etkinliği, nadir dolaşımda bulunan tümör hücrelerinin tam kan örneklerinden izole edilmesinde zenginleştirme adımının etkinliğini gösterir. Sistem Sayma protokolü kullanılarak mikrofluidik hücre yakalama slaytlarında yakalanan hücrelerin isteğe bağlı bağışıklık boyaması, sitokeratine karşı iki pozitif antikor kullanılarak nadir hücre tanımlaması gösterildi: DAPI (çekirdekli hücreleri tanımlamak) ve CD45'e karşı negatif bir antikor kullanılarak çoğu beyaz kan hücresinde eksprese edilir ancak genellikle CTC'lerde ifade edilmeyen (Şekil 3B). Bu boyama deseni, dolaşımdaki tümör hücrelerinin başarılı şekilde tanımlanmasını doğrularken arka plan beyaz kan hücrelerini dışlar.

ddPCR mutasyon tespit testleri, zenginleştirilmiş kanser hücrelerinde EGFR mutasyonlarının tanımlanması ve profillenmesini sağladı. Bu çalışma, başlangıçta Genesis platformu ile zenginleştirilen hücrelerde gDNA mutasyonlarının ddPCR ve Mutasyon Tespit Testleri kullanılarak tespit edildiğini göstermiştir. Test edilen iki EGFR mutasyonu için kanser hücre hattları A549 (EGFR yabani tip) ve H1975 (L858R/T790M) kanser hücre hattlarının ddPCR grafikleri (Şekil 4), ddPCR'nin H1975 hücre hattında bulunan mutasyonları, tam kana siktirildikten ve ardından Genesis platformu aracılığıyla zenginleştirildikten sonra hassas şekilde tespit edebildiğini gösterdi. H1975 hücrelerinde pozitif mutasyon sinyalleri gözlemlenirken, A549 hücrelerinde mutasyon sinyali tespit edilmedi ve bu da test özgüllüğünü doğruladı. A549 kontrol hücre hattı ile takviye edilen örneklerde, L858R ve T790M'deki mutasyonların tespit edilmesinin özellikle H1975 hücre hattı ile ilişkili olduğunu doğrulayan mevcut damlacık mutasyonları bulunmamıştır. Genesis platformunda CTC izolasyonunun gösterimi ve ardından ddPCR kullanılarak moleküler analizlerin yapılması, sıvı biyopsi çalışmaları ve klinik örneklerle hastalık ilerlemesini ve kişiselleştirilmiş tedaviyi izlemek için preklinik çalışmalar için güçlü bir moleküler tanı aracı sunabilir. Genel olarak, bu sonuçlar birleşik zenginleştirme ve ddPCR iş akışının dolaşımdaki tümör hücrelerinde EGFR mutasyonlarını güvenilir şekilde tespit edip niceleştirebildiğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Akciğer kanserinde EGFR DNA mutasyonlarının profillenmesi için sıvı biyopsi iş akışı. (A) Sıvı biyopsiden elde edilen geleneksel doku biyopsisi ve dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC) kullanılarak tespit edilen farklı EGFR mutasyon profillerini gösteren tümör heterojenliğinin illüstrasyonu. (B) Sıvı biyopsi kullanarak dolaşımdaki tümör hücrelerinde EGFR DNA mutasyon profili için şematik iş akışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yapay örneklerle EGFR DNA mutasyon profilinin gösterilmesi. (A) Sağlıklı bir donörden tam kana tanımlanmış EGFR mutasyon durumuna sahip akciğer kanseri hücre hatlarının takviye edilmesi ile model CTC örneği hazırlanması. (B) Ticari olarak mevcut platformlar kullanılarak dolaşımdaki tümör hücrelerinde EGFR DNA mutasyonu tespit edilmesini gösteren iş akışı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Dolaşımdaki tümör hücrelerinin etiketsiz izolasyonu ve tanımlanması. (A) Sağlıklı bağışçılardan alınan tam kan örneklerine yarı otomatik nadir hücre izolasyon platformu kullanılarak aktarılan akciğer kanseri hücre hatlarının (A549 ve H1975) yakalama etkinliği. (B) Sitokeratin pozitif tümör hücreleri gösteren yakalanan hücrelerin immünbojenlenmesi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Damla tabanlı dijital PCR kullanarak EGFR mutasyon profili. Hücre lizisi ve DNA çıkarımı sonrası zenginleştirilmiş kanser hücrelerinde EGFR mutasyon tespitini gösteren iki boyutlu genlik grafikleri. A549 hücreleri (yabani tip) mutasyona özgü sinyallerin yokluğu gösterirken, H1975 hücreleri EGFR L858R ve T790M mutasyonları için pozitif sinyaller gösterir. Bu test, mutant ve vahşi tip DNA popülasyonlarının hassas tespiti ve nicelendirilmesini sağlar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

BileşenReaksiyon başına hacim (μl)Son yoğunlaşma
Problar için 2x ddPCR Supermix (dUTP yok)101x
20x hedef (FAM) ve vahşi tip (HEX) primer/prob11x
Kısıtlama enzimi, seyreltilmiş (Msel)12-5 U/reaksiyon
Hedef örnek ve/veya DNazsız su (NTA)DeğişkenDeğişken
Toplam hacim20-

Tablo 1: Damla tabanlı dijital PCR mutasyon tespiti için reaksiyon kurulumu. Kanser hücresinden türetilen DNA örneklerinde nadir EGFR mutasyonlarını tespit etmek için kullanılan reaktiflerin bileşimi ve nihai konsantrasyonları.

Termal döngü* adımıSıcaklıkZamanRampa HızıDöngü sayısı
(ºC)(ºC/saniye)
Enzim aktivasyonu9510 dakika21
Denatürasyon9430 saniye240
Tavlama/uzatma551 dakika240
Enzim deaktivasyonu9810 dakika21
Soğutma430 dakika21
Tutma (isteğe bağlı)4∞ (sonsuz)11
C1000 Touch Thermal Cycler için ısıtılmış bir kapak 105ºC'ye ayarlayın ve örnek hacmini 40μl'ye ayarlayın
96 Derinlikli Kuyu Reaksiyon Modülü ile.

Tablo 2: Dijital PCR amplifikasyonu için termal döngü koşulları. 96 kuyruklu bir reaksiyon modülüyle termal döngü kullanılarak EGFR mutasyon hedeflerinin amplifikasyonu için kullanılan termal döngü parametreleri.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Katı tümörlü hastaların kanındaki dolaşımsal tümör hücrelerinin varlığı, 60 yılı aşkın süredir araştırma konusuolup, 2010'da toplu döneme ilk kez dahil edilmeden önce birincil sıvı biyopsi olarak kabuledilmiştir. 8. Ancak, CTC'ler nadirdir ve tam kandan seçici olarak izole edilmesizordur9. Ancak, fiziksel/mikrofluidik yaklaşımları ve hücre yüzeyi işaretleyici seçim yöntemlerini kapsayan aşağıdakiincelemeler 10,11 ile gösterildiği gibi, CTC'leri yakalamak ve zenginleştirmek için birçok yöntem bulunmaktadır. Bu yöntemlerin çoğu zaman alıcı, emek yoğun ve genellikle gerekli seçiciliği sağlamak için birden fazla adım/sistem içerir.

Bu protokolde tam kandan CTC'lerin yakalanması, mikrofluidik hücre yakalama slaytları içindeki mikrofluidik gözeneklerden geçen fenotipik normal kırmızı ve beyaz kan hücrelerinin arka planındaki şekilsizlik (> 8 μm) boyutlarına bağlıdır. Bu nedenle, doğru örnek yüklemesi, doğru slayt astarlama ve tıkanmanın önlenmesi, yakalama verimliliğini ve numune geri kazanımını korumak için kritik adımlardır.

İş akışının başarılı olması için kan örneği yönetimi temel faktördür; Numune işlemede taze kanın kullanılmasını sağlamak ve hemolizi önlemek için doğru taşıma ve depolama koşullarını korumak. Kırmızı kan hücrelerinin veya beyaz kan hücrelerinin bozulması, sırasıyla CTC yakalama kalitesini ve nadir genomik varyantların tespit hassasiyetini etkiler. Hemoliz, pıhtılaşma veya görünür örnek bozulması gözlemlenirse, örnek işlenilmemelidir; çünkü bu koşullar CTC iyileşmesini ve mutasyon tespit hassasiyetini azaltabilir.

CTC'ler, tam kandaki 10 milyon beyaz kan hücresi başına 1 CTC'nin altında bulunabildiğinden, zenginleştirme için izin verilen kadar büyük bir hacmi yakalamak şarttır. Mikrofluidik hücre yakalama slaytları, genellikle ~7,5–10 mL kan tutan Streck ve EDTA gibi standart kan yakalama tüpleriyle uyumlu olarak 10 mL kan barındırabilir. Toplanan kan hacmindeki azalma, CTC yakalama hassasiyetini ve ardından genomik varyant tespitini doğrudan etkiler. Tedavi gören hastalardan bu rutinin ötesinde hacimler almak hem klinik hem de etik açıdan zor olabilir. Hacmi 10ml'den fazla artırmak veya tanısal lökaferez örnekleri kullanılarak WBC/CTC popülasyonlarınıartırmak 12 ötesinde, daha büyük hacimlerde hassasiyeti artırmak şu anda Genesis platformunun kapsamının dışında.

Protokol, standart SOP'ta belirtildiği gibi yürütülmüştür ancak taze kan toplama, EDTA'nın kan ile kapsamlı şekilde karıştırılması ve toplanan kanın dikkatli saklanması için dikkatli bir şekilde saklanmıştır; bu da protokolün rutin standart işletim prosedürlerinin değer verdiği klinik ortamda kullanılma potansiyelini göstermektedir. Ancak, bu protokol yapay örneklerle gösterildiği için, rutin klinik uygulamadan önce klinik hasta örnekleriyle doğrulama gereklidir.

Bir CTC popülasyonundaki mutasyonların tespitinin hassasiyeti, hem standart bir tam kan örneğinde CTC'lerin bulunmasına hem de o CTC popülasyonundaki somatik mutasyonların sonrasında tespit edilmesine bağlıdır; bu da CTC alt popülasyonundaki mutasyonun sıklığına bağlıdır. Bu iki karıştırıcı faktör, yakalanan bir CTC popülasyonunda mutasyonların genel hassasiyetini nihayetinde sınırlandıracaktır; erken tespit örneklerinde, daha yüksek CTC sayısı ve daha yüksek mutasyon taşıyan CTC popülasyonlarına sahip geç evre örneklere kıyasla daha büyük etkiye sahiptir.

Mevcut kan bazlı sıvı biyopsi çalışmaları, tümör varlığının göstergesi olarak plazmada dolaşan tümör DNA'sına büyük ölçüde yönelmiştir. Genellikle ctDNA tespiti, tümöre özgü genomik belirteçlerin varlığına dayanır; örneğin SNV'ler, yapısal varyantlar, MSI-H, TMB ve CGP. CTC'ler, sıvı biyopside daha az kullanılan ama aynı derecede etkili bir biyobelirteç olarak büyüyen ve potansiyel olarak metastaz yapan tümörlerden kanadöküldükleri bilinmektedir 8. CTC'lerin analizi esas olarak hücre yüzeyi belirteçlerine odaklanır; bunlar yakalanmasında veya yerleşik veya özel antikor panelleri kullanılarak (örneğin pan-Cytokeratin, Vimentin, PD-L1, EpCAM vb.) kullanılarak alınan bir doğrulama sonrası doğrulanma için kullanılır. Buna karşılık, CTC'lerin moleküler analizi, tam kandan CTC'lerin seçici olarak zenginleştirilmesi ve yakalanmasının ardından CTC alt popülasyonunun hassas analizi nedeniyle sınırlı benimsenmiştir. Mevcut yöntem, CTC yakalama için yerleşik protokolleri içeren standart bir iş akışı ve ardından ddPCR ile moleküler analizler ve profesyonel testlerle yapılmış patolojik olarak ilgili genomik mutasyonlar için hazırlanmış tam kan örnekleri kullanılarak uygulanmaktadır. Bu yaklaşım, zenginleştirilmiş CTC'lerden doğrudan mutasyon profilini mümkün kıldığı için önemlidir ve plazma ctDNA tabanlı sıvı biyopsi yaklaşımlarını tamamlar.

Mevcut yaklaşımla, yakalanan nadir CTC'ler hem tam kan içinde varlıkları hem de CTC popülasyonunda patolojik olarak ilgili genomik belirteçlerin varlığı açısından incelenebilir. Çalışmalar, kanserli hastaların ctDNA profilinin ve ctDNA13 ile paralel dolaşan CTC rezervuarının değerlendirilmesinin değerini göstermiştir; her iki mutasyon kaynağının değerlendirilmesi bireysel hastaların genel moleküler ortamını genişletmiştir. Bu, başlangıçta translasyonel araştırma kapsamında, ancak nihayetinde klinik ortamda patoloji test paradigmalarının geliştirilmesi potansiyeline sahiptir. Yeni paradigma, hem kanser varlığı/ilerlemesi göstergesi olarak CTC varlığını hem de CTC yakalanan hücrelerde klonal genişleme veya terapötik direnç14 gösterebileceği patolojik mutasyonları içerecektir. Bunun sonucu olarak, metastaz ve klonal genişlemenin gelişimi, ardından ilaç direncinin hem ctDNA hem de CTC seviyesinde birlikte izlenebileceği ve bunun da ilerleyen evre kanserde tedavi seçimini doğrudan etkileyebilmesidir.

Gelecekteki uygulamalar arasında bu iş akışının kanserle ilişkili ek mutasyonlara uyarlanması ve performansının uzunlamasına klinik örneklerde test edilmesi yer alabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbiri yok

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışma için ddPCR deneyleri, kanser hücresi yönetimi ve kanser hücre izolasyonu deneylerinde yardımcı oldukları için Abiodun Bodunrin, Cynthia Shu, Ajitha Cristie-David, Andrew Prantner ve Errile Pusod'a teşekkür etmektedir.

Malzemeler

```html

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Genesis Hücre İzolasyon SistemiBio-Rad Laboratories12019822Enstrüman ( "Yarı otomatik hücre izolasyon sistemi" olarak anılan)
QX200 Damla JeneratörüBio-Rad Laboratories1864002Enstrüman
QX200 Damla Okuyucu veya QX600 Damla OkuyucuBio-Rad Laboratories1864003 veya 12013328Enstrüman ( "Damla okuyucu enstrümanı" olarak anılan)
PX1 PCR Plaka Sızdırmazlık CihazıBio-Rad Laboratories1814000Enstrüman
C1000 Touch Termal Çevrimci 96–Derin Kuyu Reaksiyon Modülü ileBio-Rad Laboratories1851197Enstrüman
Qubit 4 FlorometreThermo Fisher Scientific Inc.Q33226Enstrüman
Celselect SlaytlarSarf malzemesi ( "Mikrodaire Hücre Yakalama Slaytları" olarak anılan)
Celselect Slaytlar Zenginleştirme Kiti 2.0Bio-Rad Laboratories17009455Sarf malzemesi
DNAzol BDMolecular Research Center, Inc.DN129Reaktif
MseI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0525SReaktif
ddPCR Mutasyon Algılama Testi: EGFR T790MBio-Rad LaboratoriesTest ID dHsaMDV2010019Test
ddPCR Mutasyon Algılama Testi: EGFR L858RBio-Rad LaboratoriesTest ID dHsaMDV2010021Test
Qubit 1X dsDNA Yüksek Duyarlılık Test KitiInvitrogenQ33230Test kiti
QX200 Damla Jeneratörü için DG8 KartuşlarıBio-Rad Laboratories1864008Sarf malzemesi
Problar için Damla Oluşturma YağıBio-Rad Laboratories1863005Sarf malzemesi
Problar için Otomatik Damla Oluşturma YağıBio-Rad Laboratories1864110Sarf malzemesi (isteğe bağlı)
Problar için ddPCR Süpermiks (dUTP içermeyen)Bio-Rad Laboratories1863023Reaktif
PCR Plaka Isı Sızdırmazlık FolyosuBio-Rad Laboratories1814040Delinmiş folyo sızdırmazlık
DNA LoBind Mikrosantrifüj Tüpü, 1,5 mlEppendorf022431021Sarf malzemesi
ddPCR 96 Kuyu PlakalarıBio-Rad Laboratories12001925Sarf malzemesi
```

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bidard, F. C., et al. First-line camizestrant for emerging ESR1-mutated advanced breast cancer. N Engl J Med. 393 (6), 569-580 (2025).
  2. Pawlikowska, P., et al. Circulating tumor cells (CTCs) for the noninvasive monitoring and personalization of non-small cell lung cancer (NSCLC) therapies. J Thorac Dis. 11, Suppl 1. S45-S56 (2019).
  3. Tian, Z., et al. EGFR mutations in non-small cell lung cancer: Classification, characteristics and resistance to third-generation EGFR-tyrosine kinase inhibitors (Review). Oncol Lett. 30 (2), 375(2025).
  4. Riely, G. J., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Non-Small Cell Lung Cancer. , Version 5.2026, National Comprehensive Cancer Network. Available from: https://www.nccn.org (2026).
  5. Gogoi, P., et al. Development of an automated and sensitive microfluidic device for capturing and characterizing circulating tumor cells (CTCs) from clinical blood samples. PLoS One. 11 (1), e0147400(2016).
  6. Kang, Y. T., et al. Label-free rapid viable enrichment of circulating tumor cell by photosensitive polymer-based microfilter device. Theranostics. 7 (13), 3179-3191 (2017).
  7. Alexander, R. F., Spriggs, A. I. The differential diagnosis of tumour cells in circulating blood. J Clin Pathol. 13 (5), 414-424 (1960).
  8. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Circulating tumour cells in cancer patients: Challenges and perspectives. Trends Mol Med. 16 (9), 398-406 (2010).
  9. Allard, W. J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  10. Descamps, L., Le Roy, D., Deman, A. L. Microfluidic-based technologies for CTC isolation: A review of 10 years of intense efforts towards liquid biopsy. Int J Mol Sci. 23 (4), 1981(2022).
  11. Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers (Basel). 13 (5), 970(2021).
  12. Fehm, T. N., et al. Diagnostic leukapheresis for CTC analysis in breast cancer patients: CTC frequency, clinical experiences and recommendations for standardized reporting. Cytometry A. 93 (12), 1213-1219 (2018).
  13. Markou, A. N., et al. Preoperative mutational analysis of circulating tumor cells (CTCs) and plasma-cfDNA provides complementary information for early prediction of relapse: A pilot study in early-stage non-small cell lung cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1877(2023).
  14. Smilkou, S., et al. Detection rate for ESR1 mutations is higher in circulating-tumor-cell-derived genomic DNA than in paired plasma cell-free DNA samples as revealed by ddPCR. Mol Oncol. 19 (7), 2109-2119 (2025).
  15. Schmid, S., Li, J. J. N., Leighl, N. B. Mechanisms of osimertinib resistance and emerging treatment options. Lung Cancer. 147, 123-129 (2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EGFR MutationsCirculating Tumor CellsCell IsolationDroplet Digital PCRLung CancerctDNA DetectionMolecular AnalysisSize Based EnrichmentNon Small Cell LungGenomic DNA
Video yakında

İlgili makaleler