RNA ile İlgili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi

Özet

Burada, RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimlerini yakalamak için RNA ile ilişkili üç boyutlu genom organizasyonunu haritalamak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

RNA ile Ilişkili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi (RDD), belirli bir RNA tarafından sabitlenen kromatin etkileşimlerini haritalamak için hedeflenmiş bir stratejidir. Aynı anda ilgilenilen RNA ile ilişkili genomik lokusları tanımlar ve bu lokuslar arasındaki uzun menzilli DNA-DNA temaslarını çözerek mekânsal organizasyon ve düzenleyici ilişkilerin çıkarılmasını sağlar. RDD'de, hedef RNA'ya tamamlayıcı biotinillenmiş antisens problar RNA-kromatin komplekslerini zenginleştirmek için kullanılır. Hücreler çapraz bağlanır, kromatin parçalanır ve ucundan onarılır, yakalanan kompleksler içinde mekansal olarak bitişik olan DNA parçalarını birleştirmek için tasarlanmış bir linker kullanılarak yakınlık ligasyonu yapılır. Ligasyon ürünleri arıtılır, dizileme kütüphanelerine dönüştürülür ve yüksek verimlilikli dizileme ile analiz edilir ve RNA ile bağlı etkileşim haritaları oluşturulur. RDD, endogen RNA'lar ile konakçı enfekte eden mikroorganizmalar ve virüslerden türetilen dışdışı RNA'lar için geçerlidir ve çeşitli hücre tipleri ile deneysel koşullarla uyumludur. Bu yöntem, düzenleyici kodlama ve kodlamayan RNA'larla ilişkili üç boyutlu genom mimarisini disseksiye uğratmak için uygun, locus-spesifik, yüksek çözünürlüklü temas profilleri sunar. Biyokimyasal zenginleştirmeyi yakınlık ligasyonu ve yeni nesil dizileme ile entegre ederek, RDD sağlam ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar; RNA'ların kromatini nasıl organize ettiğini ve gen ifadesini nasıl etkilediğini ortaya koyar.

Giriş

Hi-C ve ChIA-PET, kromatin parçaları arasındaki mekânsal yakınlığı, döngülerden ^1,2 bölmelerine kadar ölçekler arasında fiziksel temaslar çıkarmak için dizilenebilen kovalent DNA bağlantılarına dönüştürerek üç boyutlu (3D) genom organizasyonu çalışmalarını dönüştürmüştür. Proteinlerin ötesinde, çok sayıda RNA kromatin etkileşimlerine katılarak artırıcı/baskılayıcı-promotör iletişimini ve daha yüksek dereceden kromatin organizasyonunu^{etkiler 3}; ancak, proteine bağlı testlerdeki ilerlemelere rağmen, belirli bir RNA'nın bağlı lokusları arasında uzun menzilli DNA-DNA etkileşimlerini nasıl organize ettiğini doğrudan belirlemek hâlâ zordur. RNA ile ilişkili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi'nin (RDD)^4'ün genel amacı, tanımlanmış bir RNA türünün kromatin ile nasıl ilişkilendiğini ve yerel komşuluğunda DNA-DNA temaslarını nasıl organize ettiğini ortaya koyacak yüksek çözünürlüklü, RNA sabitli kromatin etkileşim haritaları oluşturmaktır; böylece bu RNA merkezli güçlendirici/baskılayıcı-savunucu iletişimi ve o RNA merkezli yüksek dereceli genom mimarisi hakkında mekanik çıkarım yapılmasını^{sağlamaktır 5}. Metodolojik olarak, RDD, ilgilenilen RNA'ya karşı biyotinillenmiş antisens problarla çapraz bağlı RNA-kromatin komplekslerini zenginleştirir, mekansal olarak bitişik DNA parçalarını birleştirmek için tasarlanmış bir linker ile kompleks yakınlık ligasyonu yapar ve enfekte konakçılarda dışdışı bakteriyel veya viral RNA'ların yer aldığı bağlamlar dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ve koşullarında hipotez odaklı analizler için uygun lokus-spesifik temas profilleri oluşturmak için dizileme kütüphaneleri oluşturur. Bu özellikler, RDD'yi yerleşik kromozom konformasyon yöntemlerine RNA dayalı bir muadil olarak konumlandırır ve düzenleyici analiz için uygun çözünürlüklerde yorumlanabilir iletişim bilgileri sağlar.

RDD'nin gerekçesi, mevcut RNA-kromatin haritalama stratejilerinin sınırlamalarından kaynaklanmaktadır. ChIRP-seq ve CHART-seq gibi hedefli yakalama yaklaşımları, genom genelinde tek bir RNA'nın doluluğunu tanımlar; bu paradigma tek bir RNA'ya bir RNA olarak işgal edilmiş^{lokuslar arasında} bağlanma bildirir ancak fiziksel DNA-DNA temaslarını raporlamamaktadır ^6,7. GRID-seq ve MARGI dahil küresel testler, tüm RNA'dan tüm DNA'ya kadar genişletilmiş, genom genelinde RNA-DNA yakınlıklarını kataloglamış ancak RNA merkezli kompleksler içinde DNA-DNA temaslarının açık çözünürlüğü^{bulunmamıştır 3,8}. RD-SPRITE gibi çoklu yöntemler, birçok RNA ve DNA lokusu arasında daha yüksek dereceden ortak lokalizasyon bildirir ve nükleer^{topolojinin yönlerini iletir 9}, ancak sinyaller genellikle bol miktarda RNA'lar tarafından domine edilir; bu da düşük bolluklu düzenleyici RNA'ları gizleyebilir ve tek bir RNA'nın etkileşim ağını hedef derinliği sınırlayabilir. Protein veya işaret sabitli zenginleştirme artı ligasyon stratejileri, örneğin ChIA-PET¹⁰, PLAC-seq¹¹ ve HiChIP¹², faktör merkezli döngüleri etkili bir şekilde haritalar, ancak RNA-spesifik yakalama modülü olmadan tanımlanmış bir RNA'ya etkileşimleri sabitlemez; böylece RNA ile bağlı DNA-DNA boyutu çözülmemiş kalır. Hedefli biyokimyasal zenginleştirmeyi karmaşık yakınlık ligasyonu ile entegre ederek, RDD, ilgilenen RNA 4 ile birlikte işgal edilen kromatin parçaları arasında doğrudan DNA-DNA temaslarını^yakalar, düşük ve orta bolluklu RNA'lar için duyarlılık ve özgüllüğü artırır ve doluluk merkezli (ChIRP/CHART)^6,7 ve yakınlık merkezli küresel yöntemleri (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE⁾³ tamamlayan yüksek çözünürlüklü, lokus-spesifik temas haritaları ^{oluşturur. 8,9} ve protein faktörüne bağlı ligasyon stratejilerini kavramsal olarak paralel olarak ele alır (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. Okuyucular, biyolojik bir soru, hedef RNA ile özel olarak ilişkili kromatin lokusları arasındaki mekansal ilişkilerin çözülmesini gerektirdiğinde — özellikle bu RNA'nın transkripsiyonu ayarlamak için uzun menzilli genomik etkileşimleri desteklediği, köprü yapacağı veya kısıtladığı varsayıldığında — ya da RNA'nın bağlanma setinden varsayılan düzenleyici hedefleri önceliklendirirken ve doğrudan RNA merkezli merkezleri sıradan birlikte işgal olmalarından ayırt ederken, belirli RNA'lar için güçlendirici/baskılayıcı ağlarını belirlemek veya RNA ile bağlı temasların perturbasyonlar, gelişim evreleri veya enfeksiyonlar arasında yeniden kablolanmasını takip etmek. Bu tür durumlarda, RDD, RNA ile bağlantılı DNA-DNA etkileşim bilgisini hassas mekanik çalışmalar için gereken hassasiyet, özgüllük ve çözünürlükle sunarak karşılanmamış bir ihtiyacı karşılar.

Protokol

NOT: Bu RDD yöntemi için örnek sistem Drosophila S2 hücrelerini ve hem roX2 hem de 7SK ncRNA'larını kullanır; reaksiyon reaktifleri Tablo 1'de, tampon bileşimleri Tablo 2'de, reaktif detayları ve cihaz detayları Malzemeler bölümünde yer almaktadır. Şekil 1, RDD kütüphanesi üretimi protokolünün genel bir görünümünü sunar. Dönüş (F8) içeren işlemler şu parametreleri kullanır: F8, 20 rpm, uu20 ve UU30. 2. Adım ile 10. Adım arasında kullanılan tüm tamponlar için, 1x proteinaz inhibitörü (PI) ve RNase inhibitörü (RI, 0.05 U/μL) ile taze takviye edilsin.

Prob tasarım prensipleri: Yeni, rapor edilmeyen RNA için, Stellaris Prob Designer ile çevrimiçi problar tasarlayın, ardından belirli olmayan dizileri hizalama araçları (örneğin BLAST benzeri hizalama) veya UCSC BLAT ile filtreleyin, ardından seçilen probların 3′-biyotinilasyonu yapılır. Yeni hedef RNA'lar için, hedef RNA ile eşleşen ve negatif kontrol olarak hizmet veren dizileri tasarlamak, ayrıca 3′-biyotinilasyona maruz kalır. Kalite kontrolü, hedef RNA'ya karşı ters transkripsiyon primerlerinin transkripsiyon doğrulaması için ve qPCR için genomik DNA hedefli primerlerin konkripsiyon değerlendirmesi için tasarlanmasını içerir; Bağlanma özelliğini değerlendirmek için genomik bağlanma noktalarını ve bağlanmayan bölgeleri tespit eden primerler dahil edilsin. roX2 ve 7SK ile ilgili problar Tablo 1'de sunulmuştur.

1. Hücre hasadı ve çift çapraz bağlama

1. Drosophila S2 hücrelerini 27 °C'de kültürleyin. Toplamda yaklaşık 3 x 10⁹ hücre toplamayı hedefleyin. Hücreleri doğrudan kültür ortamına yeniden süspana bırakın ve Trypan-blue sayımı yaptıktan sonra, her 50 mL'lik konik santrifüj tüpüne 8 x 10⁸ hücre alikot alın.
   1. 2 μL hücreyi 8 μL DPBS ile karıştırın, 10 μL Trypan Blue ekleyin ve ardından hücre sayımı için hemositometreye yükleyin.
      NOT: Drosophila S2 hücreleri örnek olarak sunulmaktadır. Genellikle, 8 x 10⁸ hücre, tek bir 50 mL konik tüpte işlenen yaklaşık 40 mL kültür hacmine karşılık gelir. Kullanıcılar, kullanılan hücre tipine ve hedef RNA bolluğuna göre kültür koşullarını ayarlayabilir ve hücre miktarlarını hasat edebilir.
2. Formaldehidi %1 (w/v) konsantrasyona ekleyin ve 27 °C'de 20 dakika boyunca döndürün.
   NOT: Fiksasyon kültür sıcaklığında veya oda sıcaklığında (RT; 20-25°C) gerçekleştirilin. Belirtilmedikçe, mikseri açıp çevirin (F1, 12 rpm). Yapışkan hücreler için orbital sarstırıcı (50 rpm) kullanın.
   DIKKAT: Formaldehit zehirlidir; Bir duman başlığı kullanın.
3. Pellet hücreleri 845 x g olarak RT'de 5 dakika boyunca; Üst atıkları uygun kimyasal/biyolojik atıklara at. 8 x 10⁸ S2 hücrelerinden alınan hücre pelleti genellikle yaklaşık 1 cm³ hacmindedir.
4. Pelleti taze hazırlanmış 2 mM EGS'ye tekrar askıya alın, DPBS'de toplam hacmi 40 mL olacak şekilde yerleştirin ve 27 °C'de 40 dakika boyunca döndürün.
   NOT: EGS'yi DMSO'da çözün ve DPBS'ye aktarın ( bkz. Tablo 2). DMSO'da EGS tehlikelidir.
5. 2 mL 2,5 M glisin (son 0,125 M) eklenerek söndürün; 27 °C'de 10 dakika boyunca döndürün.
6. 845 x g ile 5 dakika RT'de pellet; Üst atıkları uygun kimyasal/biyolojik atıklara at. Pelleti 27 °C'de 40 mL önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez yıkayın.
7. 845 x g g'de 5 dakika boyunca pellet yapın. Hücre pelletini 10 mL DPBS içinde yeniden süspansiyona alın ve hücreleri sayın. Çapraz bağlama aşamasında hücre sayıları genellikle yaklaşık %30 azalabilir.
8. Her 50 mL'lik tüpe 1 x 10⁹ hücre alı; 845 x g ile 5 dakika RT'de pellet; Üstten atıl. Pelletleri −80 °C'de sakla.
   NOT: Aşağıdaki tüm tepki adımları tek bir RDD kütüphanesi içindir.

2. Hücre lizisi ve çekirdek permeabilizasyonu

1. −80 °C dondurucudan 1 x 10⁹ S2 çift çapraz bağlı hücre alın. 30 dakika buzlu suda eriyin.
2. Hücreleri 50 mL DPBS ile yeniden süsküyünüz, 845 x g hassasiyetinde RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
3. Hücre lizisi: Hücre pelletini 20 mL %0,1 FA lizis tamponu içinde (Triton X-100 olmadan) yeniden askıya alın. RT pozisyonunda 15 dakika döndür. Mikroskopi ile kontrol et; Hücre türüne göre zamanı ayarlayın. Başarılı lizi, standart ışık mikroskobu altında çekirdeklerin farklı yapılar olarak kolayca görülebilmesini sağlayan plazma zarı geçirimliliği ve sitoplazmik salınımla gösterilir (Şekil 2A).
4. Çekirdek permeabilizasyonu: %10 SDS (son %1) 1,8 mL ekleyin. 37 °C'de 15 dakika boyunca döndürün. RT'de 20 dakika boyunca 3.200 x g santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Mikroskopi ile kontrol (Şekil 2B); Hücre türüne göre zamanı ayarlayın. Çekirdekler daha koyu, zar örtüsü benzeri veya bazıları kopuk görünür. Liz tamamlanana kadar tekrarlayın.
5. Çekirdek yıkama: Pelleti 20 mL %0,1 FA lizis tamponunda (Triton X-100 olmadan) yeniden askıya alın, RT'de 10 dakika döndürün, ardından RT'de 3.200 x g ile 20 dakika boyunca santrifüj yapın, süpernatantı atın ve çekirdek pellet boyutunu işaretleyin. Çekirdek pelletini daha sonra kullanmak üzere −80 °C'de sakla.

3. Kromatin parçalanması

1. Çekirdek pelletini 15 mL %0,1 FA lizis tamponu içinde (Triton X-100 ile) yeniden süzülür. Her 14 mL-yuvarlak tabanlı test tüpüne 1,5 mL çekirdek süspansiyonu alı, böylece baloncuklardan kaçınıyor.
   1. Karşılaştırma için sonikasyondan önce pellet boyutunu işaretleyin ve sonikasyondan sonra pellet büyük kalırsa sonikasyonu tekrarlayın.
2. 4,5 dakika boyunca %38 genlikte sonikasyon yapın, 30 saniye açık / 30 saniye KAPALI döngülerle. Tüm soniklenmiş kromatini 15 mL bir tüpe toplayın ve RT'de 20 dakika boyunca 3.200 x g seviyesinde santrifüj yapın, ardından süpernatantı (~13 mL) yeni bir 15 mL tüpe aktarın.

4. C1 boncuklu preclear kromatin

1. Streptavidin C1 boncuklarını hazırlayın: Aliquot 400 μL Streptavidin C1 boncuklarını 1.5 mL bir tüpe (1 × 10⁹ S2 hücre başına 100 μL) koyun, 30 saniye mıknatıs üzerine yerleştirin ve üst paneli çıkarın. 200 μL %0,1 FA liz tamponuyla (Triton X-100 ile) iki kez yıkın, ardından 100 μL %0,1 FA liz tamponunda (Triton X-100 ile) tekrar süzülürün.
2. Kromatin preclear: Hazırlanmış 100 μL Streptavidin C1 boncuklarını, ~13 mL soniklenmiş kromatin süpernatantı içeren tüpe ekleyin (Adım 3.2'den); RT'de 20 dakika döndürün; 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyup süpernatantı (önceden temizlenmiş kromatin) yeni 50 mL tüplere aktarır; 10 μL alın ve QC1 için −20 °C'de saklanın (Şekil 3A).

5. RNA probunu önceden temizlenmiş kromatin ile hibritleştirin

1. 2 hacim (26 mL) taze hazırlanmış Hibridizasyon tamponu ile 1 hacim (13 mL) önceden temizlenmiş kromatin ekleyin; RT'de 30 dakika döndür.
2. Karışımı üç adet 15 mL tüpe ayırın; her örnekte 6 μL 100 μM biyotinillenmiş prob (DNA oligonukleotidi, Tablo 1) eklenir (15 mL tüpte 2 μL); gece boyunca 37 °C'de döndürülür. Tüp kapaklarını film ile kapatın.

6. C1 boncuklarında prob immobilize et - kromatin kompleksi

1. Bloklama tamponu ile blok Streptavidin C1 boncukları: 400 μL taze streptavidin C1 boncukları alın ve 800 μL %0,1 FA lizis tamponu ile (Triton X-100 olmadan) iki kez yıkayın; 400 μL Bloklama Tamponu ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca bir mikserde (F8) inkübe yapın. 10 dakika mıknatısa koyup süpernatantı atın; 800 μL %0,1 FA liz tamponu ile üç kez yıkayın (Triton X-100 olmadan). Her yıkamada, nazikçe pipet yapın, mıknatısın üzerine en az 30 saniye koyun, ardından süpernatantı atın.
2. C1 boncuklarını 400 μL hibridizasyon tamponunda yeniden askıya alın.
3. Streptavidin C1 boncuklarında prob-kromatin kompleksini immobilize edin: Blocking Buffer ile işlenmiş streptavidin C1 boncuklarını ilgili hibritize kromatine ekleyin ve RT'de 2,5 saat döndürün.
4. 15 mL tüplerden 1,5 mL tüplere manyetik bir raf kullanarak immobilizasyon reaksiyonu aktarılır. Her 15 mL'lik tüpü manyetik bir rafa 5 dakika boyunca yerleştirin; Üst yüzeyi çıkar. 1 mL Wash tamponu ile boncukları yeniden süspansiyon yapın ve yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
5. Boncukları 800 μL Wash buffer ile beş kez, ardından TE tamponu ile iki kez yıkayın. Yıkamak için tampon ekleyin, mikserde (F1, 12 rpm) 37 °C'de 5 dakika inkübe yapın, manyetik rafa 30 saniye koyun ve üst yüzeyi atın.
6. Boncukları RT pozisyonunda 1.000 μL TE tamponunda (1x PI) tutun.

7. Denatüre edilmiş İyodoasetil-PEG2-Biotin (IPB) ile boş alanlarda C1 boncuklarında bloklama

1. 4,8 mg IPB'yi 400 μL IPB Wash tamponu içinde çözür; RT pozisyonunda 15 dakika döndür.
2. β-ME çözümü: 1 μL β-ME ekleyerek 312 μL H₂O eklenir; RT rejiminde 15 dakika karıştırıp döndür.
3. IPB'nin denatürasyonu: 400 μL IPB'ye 44 μL β-ME çözeltisi eklenir; RT rejiminde 15 dakika karıştırıp döndür.
4. C1 boncuklarını blokla: Prob-kromatin kompleksiyle bağlı C1 boncuklarına 220 μL denatüre IPB ekleyin (1.000 μL TE'de); RT pozisyonunda 15 dakika döndür.
5. C1 boncuklarını TE ile beş kez yıkayın. Tampon ekleyin, RT'de 5 dakika bir mikserde (F8) kuluçka yapın, ardından manyetik rafa 30 saniye koyun ve süpernatantı atın.

8. Kromatin uç onarımı (boncuklar üzerinde)

1. C1 boncuklarındaki kromatine 693 μL son onarım karışımı ekleyin ve iyi karıştırın; sonra 7 μL T4 DNA polimeraz eklenir.
2. Termomikserde (800 rpm) 12 °C'de 30 dakika kuluçka yapın; sonra 16 °C'de 15 dakika boyunca mikser (F8) üzerinde bekledim.
3. Boncukları 800 μL buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez, ardından bir kez TE ile yıkayın. Her yıkamada, nazikçe pipet yapın, mıknatısın üzerine en az 30 saniye koyun, ardından süpernatantı atın.

9. Kromatin A-kuyruğu (boncuklar üzerinde)

1. C1 boncukları üzerindeki kromatine 693 μL A-kuyruk karışımı ekleyin ve iyi karıştırın, ardından 7 μL Klenow parçası (3'-5' exo-) ekleyin.
2. Mikserde (F1, 12 rpm) 37 °C'de 50 dakika inkubasyon yapın. Boncukları 800 μL buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez, ardından bir kez elusiyon tamponu ile yıkayın.

10. Kromatin yakınlık ligasyonu (boncuklar üzerinde)

1. C1 boncuklarındaki kromatine 1.390 μL yakınlık ligasyon karışımı ekleyin. RT rejiminde mikser (F8) üzerinde 5 dakika inkübe yapın.
2. Sonra 10 μL T4 DNA ligaz ekleyin. Mikseri (F8) RT'de 5 dakika döndürün, sonra RT'de 50 dakika F1'e (12 rpm) geçin, ardından gece boyunca 16 °C ile geçin.
3. Boncukları 800 μL buz gibi soğuk ChIA-PET tamponu ile üç kez, ardından TE tamponu ile iki kez yıkayın.

11. C1 boncuklarından yakınlık ile ligated kromatin DNA'sının serbest bırakılması

1. C1 boncuklarındaki kromatine 480 μL LC ChIP elusyon tamponu ekleyin, iyi karıştırın ve decrosslink için 20 μL 20 mg/mL Proteinaz K ekleyin.
2. Termomikserde (950 rpm) 65 °C'de gece boyunca inkübe yapın.

12. Yakınlık ile bağlanmış DNA arıtma (Fenol: Kloroform: IAA reaktifleri ile)

1. Yüksek yoğunluklu faz kilitli tüpünü 13.500 x g ile RT hızında 2 dakika boyunca döndürün. Yüksek yoğunluklu faz kilitli tüpe de-çapraz bağlanmış ürünler (500 μL) ekleyin.
2. Yüksek yoğunluklu faz kilitli tüpe 500 μL Fenol:Kloroform:IAA (5 mL pipet ucu kullanılarak) ekleyin. Nazikçe elle karıştırın.
   DIKKAT: Buharlı bir kapüşonda çalışın.
3. 13.500 x g ile 6 dakika RT hızında santrifüj yapın. Santrifüj yaparken, tabana 52 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ekleyerek 1,5 mL bir tüp hazırlayın. Kapağına 1 μL glikojen ve mavi boya koyun. Bu noktada tüpü karıştırmayın veya kapatmayın.
4. Üst yüzeyi yüksek yoğunluklu faz kilitli tüpten hazırlanmış 1,5 mL tüpe hızla aktarın.
5. 1.5 mL tüpe 520 μL buz gibi izopropanol ekleyin. Nazikçe karıştırın, sonra gece boyunca -80 °C'ye koyun.
6. Tüpü -80 °C'den çıkarın ve RT'de (~10 dakika) eridin. 13.500 x g hassasiyetinde santrifüj ile ~1 saat 4 °C'de DNA çökeltmesi için kullanılır. Tüpün dibinde mavi bir pelet bulunur.
7. DNA pelletini %75 etanol ile yıkayın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. 800 μL %75 buz gibi soğuk etanol ekleyin, 13.500 x g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi çıkarın. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın.
   DIKKAT: Santrifüjlemeden hemen sonra süpernatantı çıkarın: önce 1 mL uçla, sonra 100 μL uçla. Sıcak tüpler mavi peleti yerinden çıkarabilir.
8. Son etanol yıkamasından sonra, 13.500 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve alttaki kalıntı etanolü toplayın, ardından kalan etanolü dikkatlice çıkarın.
9. DNA pelletini genellikle 1 dakika 30 saniye ile 2 dakika arasında vakumda kurutun. DNA pelletini 10 μL elusyon tamponunda yeniden askıya alın ve RT'de yaklaşık 2 saat kuluçka yapın. DNA'yı bir nüklein asit niceleyici kullanarak nicelikleştirin ve kaliteyi otomatik bir kahiller elektroforez sistemiyle değerlendirin (Şekil 3B-C).

13. Yakınlıkla bağlanmış DNA Tn5 etiketleme

1. Tn5 Etiketleme testi: Tablo 1'e göre toplam 50 μL reaksiyon hacmi hazırlanın. Buz üzerindeki PCR tüpünde, sırayla 50 ng QC1 DNA, ddH₂O ve 12,5 μL 4x Etiketleme tamponu ekleyin. Son olarak, gerekli miktarda Tn5 enzimini ekleyin. Her eklemeden sonra 10-20 kez pipetle yukarı ve aşağı nazikçe karıştırın, böylece kabarcıklar oluşmasın. Gerektiğinde tüpü kısa süreliğine döndür.
   NOT: Nazikçe karıştırmak ve baloncuklardan kaçınmak etiketleme için kritiktir. Ayrıca, Tn5 miktarı istenen parça dağılımı (ağırlıklı olarak 200 bp-1 kb) elde etmek için ampirik olarak optimize edilmeli ve kullanıcılar Tn5 girişini ayarlayarak boyut aralığını ayarlayabilirler.
2. Etiketleme reaksiyonu: Reaksiyonu kapağı 70 °C'ye ayarlayarak PCR cihazında 55 °C'de 10 dakika kuluçka edin, ardından 4 °C'de tutulur.
3. Tn5 salınımı ve DNA arındırması: Etiketlenmiş DNA'ya 50 μL ChIP Elution tamponu ve 1 μL Proteinaz K eklenin (nihai SDS konsantrasyonu %0,5 için). Termomikserde 65 °C ve 900 rpm'de 30 dakika karıştırıp inkübe yapın. DNA'yı bir DNA arıtma kiti ile arındırın ve otomatik kapiller elektroforez sistemi kullanarak DNA'yı nicelikle ölçün (Şekil 3D).
   NOT: Bu aşamada, DNA parçaları ağırlıklı olarak 200 bp ile 1 kb arasında değişmelidir. Tn5 enzim-DNA oranı ampirik olarak optimize edilmelidir.
4. Tn5 Etiketleme ölçeklendirmesi: Tn5 test sonuçlarına dayanarak, aynı koşullarda yakınlık bağlantılı DNA için reaksiyonu ölçeklendirin. Etiketlemeden sonra, örneği PCR cihazından çıkarıp buzun üzerine koyun. Kısa bir süreliğine aşağı çevirin, RT'de 2 dakika kuluçka yapın, ardından %10 SDS (%10; son SDS konsantrasyonu: %1) 5,5 μL ekleyin. 10-20 kez pipetle yukarı ve aşağı karıştırarak kabarcıklardan kaçının ve kısa bir süre aşağı döndürün. Örnekleri PCR cihazında 37 °C'de en az 15 dakika kuluçka edin. Etiketlenmiş DNA, birkaç gün boyunca -20 °C sıcaklıkta saklanabilir.

14. M280 boncuklarının engellenmesi

1. 20 μL M280 boncuk alın ve 200 μL 1x B&W tampon ile iki kez yıkayın. Yıkamak için tampon ekleyin, boncukları pipetle tekrar askıya alın, kısa bir süreliğine aşağı döndürün, 30 saniye mıknatısa koyun ve üst yüzeyi çıkarın.
2. Engelleme tamponu ile boncuk bloklama: M280 boncuklarını 100 μL Bloklama Tamponunda yeniden askıya alın; RT rejiminde mikseri (F8) 45 dakika boyunca döndürün.
3. Boncuk Yıkama: Kısa bir süreliğine döndürün, 10 dakika boyunca mıknatısa koyun ve Bloklama tamponunu atın. Boncukları 200 μL 2x B&W tampon ile iki kez yıkayın.
4. Genomik DNA ile boncuk engelleme: 100 μL 2x B&W tampon içinde boncukları yeniden askıya alın, 100 μL kesilmiş genomik DNA (~500 ng, 300-500 bp) ekleyin, iyi karıştırın ve RT rejiminde mikserde (F8) 30 dakika döndürün.
5. Genomik DNA karışımını atın ve boncukları 200 μL 1x B&W tampon ile iki kez yıkayın.

15. M280 boncuklarında ligasyonlu DNA'nın immobilizasyonu

1. Bağlanmış DNA'yı M280 Boncuklarına bağlamak: 1x S&W tamponu atmak. Tüm parçalanmış ligated DNA'yı M280 boncuklarına ekleyin, karıştırın ve RT rejiminde mikserde (F8) 45 dakika döndürün.
2. Kısa bir süreliğine aşağı döndürün, mıknatısa koyun ve üst yüzeyi atın. Boncukları 500 μL önceden ısıtılmış yıkama tamponu ile 37 °C'de beş kez yıkayın; bir kez 500 μL 1x B&W; ve bir kez 200 μL 1x B&W ile birlikte. Mıknatısa 1 dakika koyun, tüp tabanını nazikçe karıştırın ve üst yüzeyi atın. Boncuklara 30 μL elusyon tamponu ekleyin (karıştırmayın).
   1. Yıkamak için tampon ekleyin, mikserde (F8) 5 dakika kuluçka yapın, mıknatısa 30 saniye koyun, sonra süpernatantı atın. Bağlanmış DNA'ya sahip boncuklar -20 °C'de depolanabilir.

16. M280 boncuklarında ligated-DNA'nın amplifikasyonu

1. PCR reaksiyonunu hazırlayın (DNA kütüphanesi hazırlık kitine göre). PCR tüplerini PCR makinesine aktarın ve programı kurun.
   NOT: PCR amplifikasyon döngüleri nihai kütüphane kalitesi için kritiktir; Döngü sayısının artırılması kütüphane karmaşıklığını azaltır. Döngü sayısını ampirik olarak optimize edin ve genellikle 15 döngüyü aşmayın.
2. PCR ürünü manyetik boncuklarla arındırın (Şekil 3E). Boyut seçimi: RDD kütüphanesinin çift boyutlu seçimi yapmak için (0.8-0.61) manyetik boncuklar kullanılır.
   1. Son DNA kütüphanesi ağırlıklı olarak 250 ile 600 bp arasında olmalıdır (Şekil 3F). Dizileme için 10-30 ng kütüphane DNA'sının nüklein asit niceleyiciyle ölçüldüğünden emin olun.
3. Dizileme: 2x 150 bp ile Illumina dizileme için konu. Dizileme derinliği, RNA ifadesi, bağlanma bölgesi yoğunluğu ve genom genografi desenlerine bağlıdır. Burada roX2 ~23M okumada, 7SK ise ~8M okumada doygunlaşıyor, bu yüzden sonuncusu daha az derinliğe ihtiyaç duyuyor. Türlere göre başlayın, ardından ekstra derinlik için yedekliği değerlendirin: ~5M Drosophila için, ~20M insan/fare için, kalite kontrol metriklerine göre ayarlanır.

Sonuçlar

Bu protokol, RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimlerini tespit etmek için RDD yöntemini özetlemektedir. İş akışı, biyotinile edilmiş problar kullanılarak RNA-kromatin komplekslerinin biyokimyasal zenginleştirilmesiyle başlar, ardından mekansal olarak bitişik DNA parçalarını bağlamak için yakınlık ligasyonu yapılır. Dizileme kütüphaneleri oluşturulduktan sonra, yüksek verimlilikli dizileme yapılır.

RDD verilerinin biyoinformatik analizi ChIA-PIPE^{platformu 13} tarafından kolaylaştırılmıştır. Bu analitik boru hattındaki temel adımlar şunları içerir: ham okumalardan dizileme bağlantılarını kesmek, eşleştirilmiş uçlu okumaları referans genomla eşleştirmek, benzersiz şekilde eşlenmiş okuma çiftlerini filtrelemek, PCR kopyalarını kaldırmak ve prob koordinatlarına göre hedeflenen RNA sitelerine etkileşim atamak. Genellikle, sıralanmış okumaların yaklaşık %50'si bağlantıcı ve kalite filtrelemeden sonra başarıyla korunur. Geçerli etkileşim olayları daha sonra toplanmış ve RNA rehberli kromatin mimarisinin ayrıntılı profilleri sağlanan lokus-spesifik temas haritaları oluşturulmuştur. RDD verileri için üç ChIA-PIPE ayarı uyguladık: RDD linker dizisi ("ACGCGATATCTTATCTGACT") varsayılan ChIA-PET linker'ın ("ACGCGATGGCTACTCTGACT") yerine kullanıldı; döngü kümeleme, RNA etkileşim noktalarının konumsal hassasiyetini artırmak için varsayılan 500 bp'ye ek olarak 50 bp kısaltılmış PET uzantısı ile gerçekleştirildi; ve RNA zenginleştirme kapsamı, deepTools (bamCoverage v3.5.1) ile 1 bp bin boyutu kullanılarak hesaplandı. Bu değişiklikler—linker konfigürasyonu, daha ince kümeleme için azaltılmış PET uzantısı ve yüksek çözünürlüklü kapsama, RDD kütüphaneleri için ChIA-PIPE'ı uyarlar.

Şekil 4, kodlamayan iki RNA için temsilli RDD sonuçlarını gösterir: roX2¹⁴ (Şekil 4A,C; yeşil), Drosophila'da X-kromozom yapısını ve gen ifadesini düzenlemede rol alan dozaj telafisi kompleks RNA'sı ve 7SK¹⁵ (Şekil 4B,D; mor), metazoanlarda P-TEFb aktivitesini düzenleyerek transkripsiyon uzamasını modüle eden yüksek koruma altına alınmış küçük nükleer RNA. RDD tarafından tespit edilen RNA bağlanması ve kromatin etkileşimleri, RNAPII ChIA-PET verileriyle (mavi yaylar) birlikte görselleştirilir; bu da RNA ile ilişkili döngüler ile promotorlar (P), güçlendiriciler (E) ve transkripsiyon başlangıç veya bitiş noktaları (TSS/TES) gibi temel düzenleyici unsurlar arasındaki yapısal ilişkiyi vurgular. Toplanan verilerdeki belirgin etkileşim zirveleri, hem roX2 hem de 7SK'nin kritik artırıcı-promotor veya uzun menzilli kromatin temaslarını aracılık ettiği bir modeli destekler.

Çok boyutlu analiz, RDD ile bağlı etkileşimlerin, Hi-C genom çapında kromatin konformasyon haritaları (alt panel kırmızı ısı haritaları) ve epigenomik işaretler (H3K27ac, H3K27me3), yeni transkripsiyon (RNA-seq) ve RNAPII ChIA-PET verileri (Şekil 4C,D) ile entegre edilmesiyle sağlanır. Bu bölgelerde, topolojik olarak ilişkilendiren alanlar (TAD'ler) net görselleştirilir; RNA rehberli kromatin döngüleri genellikle TAD sınırlarında veya birden fazla TAD'yi kapsar. Histon modifikasyonu ve transkripsiyon verileriyle ek açıklama, aktif ve inaktif kromatin bölgeleri arasında ayrım yapılmasını sağlar. Şekilde anahtar RNA merkezli düzenleyici merkezler daire içine alınmıştır.

Farklı ncRNA'lar için belirgin desenler ortaya çıkar. roX2 , TES bölgelerinde bağlanma ve TSS'lere döngü yaparak karakterize edilir; genellikle TAD sınırlarında lokalize olur ve birden fazla TAD'yi geçebilen uzun menzilli temaslar oluşturur. Buna karşılık, 7SK ağırlıklı olarak güçlendiricilere bağlanır ve komşu promotörlerle daha kısa menzilli döngüler oluşturur, genellikle TAD sınırlarını geçmeden.

Bu sonuçlar toplamda, RDD'nin RNA'ya özgü 3D kromatin organizasyonunu disseksiye etmek için güvenilir ve yüksek çözünürlüklü bir yöntem olduğunu doğrular. Bu yaklaşım, genom mimarisi ve gen ifadesindeki düzenleyici RNA'ların mekansal rollerinin çeşitli biyolojik ortamlarda doğrudan incelenmesini sağlar.

Şekil 1: RDD kütüphane oluşturma iş akışının şeması. RDD kütüphanesi oluşturma için merkezi iş akışı adımları sırayla gösterilir ve karşılık gelen şematik illüstrasyonlarla birlikte sunulur. İşlem, çift çapraz bağlama ve kromatin etiketleme ile başlar, ardından biotin-modifiye RNA probu ile hibritizasyon ve streptavidin ile immobilizasyon yapılır. Sonraki adımlar arasında A-tailing, biotin-modifiye linkerlerle yakınlık ligasyonu ve kütüphane yapımı yer alır. DNA bağlandıktan sonra arındırma, Tn5 aracılı parçalanma, biotin zenginleştirme ve kütüphane amplifikasyonu gerçekleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Drosophila S2 hücrelerinin temsil mikroskopik görüntüleri, hücre lizisi ve çekirdek permeabilizasyonu için görsel kalite kontrol kriterlerini gösterir. (A) Başarılı hücre lizisi, plazma membranının geçirgenliği ve sitoplazmik salınımla karakterize edilir; böylece çekirdekler kolayca görünür olur. (B) Başarılı çekirdek permeabilizasyonu, hücre şişmesi, plazma zarının kısmi ayrılması ve sağlam ve net görünür çekirdeklerle gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kromatin preparatlarının elektroferogram analizi. Çeşitli kromatin örneklerini profilleyen bir kapiller elektroforez sistemi elektroferogramının ekran görüntüsü. (A) Yaklaşık 1000 ila 3000 bp arasında değişen parçalanmış kromatin (sonikasyon) gösterir, bu da başarılı parçalanmayı gösterir. (B) RNA ile ilişkili kromatini (RNA ile ilişkili + bağlanmamış problar) gösterir; daha küçük bir zirve, okla belirtildiği gibi bağlanmamış probları temsil eder. (C) RNA-protein komplekslerini yansıtan 1000 ila 3000 bp arasında bir konsantrasyon aralığı gösteren RNA ile ilişkili kromatin gösterir. (D) Kromatinin Tn5 ile etiketlendiğini gösterir ve etiketleme etkinliğini gösteren bir aralığı gösterir. (E) Dizileme kütüphanesinin amplifikasyondan sonra yaklaşık 180-1000 bp aralığında parça boyut dağılımını gösterir. (F) Boyut seçiminden sonra dizileme kütüphanesinin parça boyut dağılımını, parçaların ağırlıklı olarak ~250-600 bp aralığında zenginleştirilmesini gösterir. Her örnek için RFU (göreli floresans birimleri) değerleri gösterilir ve kromatin bütünlüğü ile boyutunun etkili bir şekilde nicelendirildiğini gösterir. Mor zirveler işaretleyiciyi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: ncRNA ile ilişkili kromatin etkileşimleri için RDD'nin temsil eden sonuçları. (A-B) ncRNA roX2 (yeşil) ve 7SK (mor) bağlanmalarının genomik konumlarını, ilgili uzak kromatin etkileşim döngüleriyle birlikte gösterir. RNAPII ChIA-PET (mavi) verileri, bu ncRNA'lar ile gen ekspresyonu arasında net bir düzenleyici ilişki ortaya koymakta olup, zirveler etkileşim gücünü gösteriyor. Kısaltmalar: TSS = transkripsiyon başlangıç noktası; TES = transkripsiyon son sitesi; P = organizotör; E = güçlendirici. (C-D) ncRNA roX2 ile 7SK'ye bağlı kromatin döngüleri ile TAD'lar (kırmızı) arasındaki ilişkiye daha yüksek boyutlu bir bakış sunar; ayrıca aktif ve aktif olmayan kromatin durumları ile gen ifade seviyeleri arasındaki farklılıkları da vardır. Daireler, TAD'ler arasında önemli etkileşimlerin olduğu alanları vurgular. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: RDD reaksiyon reaktifleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: RDD tampon bileşimleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Yöntemdeki kritik adımlar
Kromatindeki RNA problarının miktarını ve buna karşılık gelen RNA seviyelerini tahmin etmek çok önemlidir. Fazla problar, immobilizasyon aşamasında streptavidin bölgelerini işgal eden bağlanmamış sondalara yol açabilir ve bu da hedef RNA etkileşimlerinin hedeflenen yakalanmasını engelleyebilir. Ayrıca, çok fazla streptavidin eklemek malzeme israfına yol açar ve boş alanların etkili şekilde bloklanması için daha fazla denatüre IBP gerektirir. Yetersiz bloklama, özellikle yakınlık ligasyon linkerinde biotin modifikasyonları bulunduğundan, sonraki yakınlık ligasyonunun verimliliğini olumsuz etkileyebilir. Bloklama yeterince yapılmazsa, linkerin bazı bölümleri doğrudan streptavidin boncuklarına bağlanabilir ve sonuçları karmaşıklaştırabilir. Ayrıca, linker ile kromatin oranı dikkatlice tahmin edilmelidir - çok fazla linker kromatin DNA'sının her iki ucunun da etiketlenmesine neden olabilir ve bu da etkili yakınlık ligasyonunu engeller.

Yöntemin değişiklikleri
Bu çalışmada, Drosophila S2 hücrelerini roX2 ncRNA ile örnek olarak kullanarak RDD yöntemini gösteriyoruz. Reaktif hacimleri hücre tipi ve ncRNA ifade seviyelerine göre ayarlanmalıdır; ncRNA ekspresyonu yüksekse, hücre miktarı azaltılabilir veya RNA prob konsantrasyonunu artırabilir, ve tam tersi de geçerlidir. Bu protokol boncuklarda kromatini immobilize etse de, alternatif bir yaklaşım yerinde yakınlık ligasyonu ve ardından RNA problarıyla zenginleştirmeyi içerir.

Özgüllük, kontroller ve kalite kontrol
Daha önce RDD'yi tanımlayıp doğruladık, paralel RDD'ler birden fazla RNA üzerinde yaptık; güçlü spesifiklik gösterdik; okuyucular önceki ^4,16 eserine başvurabilirler. RDD, proba bağımlı, loküs-spesifik ve tekrarlanabilir ve mümkün olduğunda ortogonal olarak doğrulanmış zenginleştirme gerektirir. Gerçek etkileşimler üç kritere uygundur: prob hedefli lokuslarda zenginleşme ile yakındaki bağlanmayan bölgeler; prob bağımlılığı (negatif kontrollerde yok veya belirgin şekilde azalmış); ve biyolojik çoğaltmalar ile bağımsız doğrulama (örneğin, RT-qPCR) arasında tekrarlanabilirlik ile ilgili bilgiler var. Antisens sondaları Stellaris ile tasarlandı, BLAST/BLAT tarafından hedef dışı maddeleri çıkarmak için tarandı, 3'-biotin ile sipariş edildi ve RT ile qPCR ile doğrulandı (DNA kontaminasyonu kontrolleri ve saha dışı zenginleştirme dahil). Üç kontrol öneriyoruz -- probsuz, karıştırma/hedefsiz ve ilgisiz-RNA veya bağlanmayan bölge probları -- ve hedef ve kontrol örnekleri arasında qPCR veya dizileme kapsamını karşılaştırarak spesifikliği değerlendiriyoruz; katlanma zenginleştirme ve arka plan raporlarını bildiriyoruz. Düşük bolluklu RNA'lar için, prob yoğunluğunu (hedef dışı kısıtlar içinde) artırın, dizileme derinliğini artırın ve ortogonal doğrulama yapın.

Yöntemin sorun giderilmesi
Yakalanan RNA-kromatin etkileşimleri belirgin şekilde düşükse, yakınlık ligasyonunun verimliliği, linker ve kromatin miktarlarının ayarlanmasıyla optimize edilmesi gerekebilir. Ayrıca, otomatik kapiler elektroferogramlarla bağlanmamış sondaların yüksek zirveleri gözlemlendi. Sonuçlar, çok fazla sonda eklendiğini ve kullanılan miktarın azaltılmasıyla düzeltilebileceğini gösteriyor.

Yöntemin sınırlamaları
RDD yönteminin temel avantajlarından biri, belirli RNA ile ilişkili kromatin etkileşimlerini yakalamadaki verimliliğidir; yani her deney aynı anda yalnızca belirli bir RNA'ya odaklanabilir. Ayrıca, yakınlık ligasyonu çift etkileşimleri tespit etmek için tasarlandığından, birden fazla bölge etkileşimi aynı anda değerlendirilemez.

Yöntemin önemi
RDD yöntemi sadece RNA bağlanma noktalarını ortaya çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda bu alanlar arasındaki etkileşim ilişkilerini de aydınlatarak kromatin mimarisini daha iyi anlamamızı sağlar.

RDD'nin pratik kullanımları ve gelecekteki potansiyeli
RDD, çeşitli kromatinle ilişkili RNA'lar için, endozen konak RNA'lar ve virüslerden veya diğer mikroorganizmalardan gelen dışdışı RNA'lar için uygundur; bu da farklı araştırma alanlarında geniş uygulanabilirliğini vurgular.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M Magnezyum asetat	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7.0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8.0	Invitrogen	AM9856
1.5-mL Tüpler	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
%10 SDS (kalın/hacim)	Invitrogen	AM9822
10& kez; A-tailing tamponu	NEB	B7002S
10& kez; Son-onarım tamponu	NEB	B6002S
10& kez; T4 DNA ligaz tamponu	NEB	B0202S
10& kez; TBE tamponu	Invitrogen	AM9863
14 mL yuvarlak tabanlı test tüpleri	Corning	352057
2&Times; PCR master mix	NEB	M0541
20& kez; SSC tamponu	Invitrogen	AM9770
200-μ L PCR tüpleri	Sangon Biyoteknoloji	F611541-0010
250 mL Kare PET depolama şişeleri	Corning	431531
2-Merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! DİKT β-ME toksiktir; Her zaman buharlı bir davlumbonda kullanın.
2-mL tüpler	Eppendorf	22431048
3 M Sodyum asetat pH 5.5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M Potasyum asetat	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
500 mL Kare PET depolama şişeleri	Corning	431532
Analitik denge	Sartorius	BP211D
Otomatik hücre sayacı	Counterstar	IC1000
Otomatik kapiller elektroforez sistemi	Biyopati	C100100
Biyotinile problar	GENEWIZ		Tablo 1
Engelleyici toz	Invitrogen	T2015
Köprü bağlayıcı oligoları	GENEWIZ		Tablo 1
CO2 kuluçka makinesi	Termo Bilimsel	51033549
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
Illumina için DNA kütüphane hazırlık kiti V2	Vazyme	TD501
DNA arıtma kiti	Zymo	D4013
Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu (DPBS) (1& kez;)	Gibco	14190250
EDTA-içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli	Roche	11836170001
EGS (Etilen glikol bis[succiniMidylsuccinate])	Termo Bilimsel	21565
Elution tamponu	Qiagen	19086
Saf etil alkol	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Formaldehit çözeltisi	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! DIKKAT: Formaldehit zehirlidir; Her zaman buharlı bir davlumbonda kullanın.
Formamid	Invitrogen	AM9342
Jel görüntüleme sistemi	Tanon	3500R
Glisin	Invitrogen	50046-1kg
Mavi boyalı glikojen	Invitrogen	AM9516
Yüksek hassasiyetli kartuş	Biyopati	C105105
Yüksek yoğunluklu faz kilitli tüpler (1,5 mL)	Qiagen	129046
Yüksek duyarlılıklı dsDNA florometrik test kiti	Invitrogen	Q32851
Illumina için Index Kit V2	Vazyme	TD202
İyodoasetil-PEG2-Biotin (IPB)	Termo Bilimsel	21334
İzopropil alkol	Sigma-Aldrich	I9030	! DIKKAT: İzopropil alkol toksiktir; Her zaman buharlı bir davlumbonda kullanın.
Kilo taban kartuş	Biyopati	C105106
Klenow parçası (3'&nadir; 5' exo-)	NEB	M0212L
Manyetik boncuklar	Beckman	A63881
Manyetik ayırma rafı  15 mL tüp için	Invitrogen	12301D
Manyetik ayırma rafı  2-mL tüp için	Invitrogen	12321D
PCR tüpü için manyetik ayırma rafı	NEB	S1515S
Mikrobiyolojik kuluçka makinesi	Termo Bilimsel	IMH180
Mikroskop	Nikon	Eclipse TS2
Mikser	ELMI	RM-2L
N,N-Dimetilformamid (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! DİKKAAT DMF toksiktir; Her zaman buharlı bir davlumbonda kullanın.
Soğutucu olmayan mikrosantrifüj	Eppendorf	5405000204
Nukleazsız su (DEPC ile aranmamış, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Nukleazsız su (DEPC ile arıtmamış, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Nükleik asit niceleyicisi	Invitrogen	Q33226
Yörünge sallayıcısı	Kristal	SYC-2102
Fenol:Kloroform:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Proteinaz K çözeltisi	Invitrogen	AM2548
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf	22628180
Soğutmalı kuluçka makinesi	Termo Bilimsel	IMP180
Soğutmalı mikrosantrifüj	Eppendorf	5404F1621754
Buzdolabı	Haier	DW-25L262
RNase inhibitörü	Ambion	AM2696
RNaz-free 15-mL tüpler	Invitrogen	AM12500
RNase-free 50-mL tüpler	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Malzemeler	VCX130
Streptavidin kaplı manyetik boncuklar C1	Invitrogen	65001
Streptavidin kaplı manyetik boncuklar M-280	Invitrogen	11205D
T4 DNA ligaz	NEB	M0202S
T4 DNA polimeraz	NEB	M0203S
TE tampon pH 8.0	Invitrogen	AM9849
Termal döngücü	Bio-Rad	1851148
Termomikser	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu	Termo Bilimsel	995
Vakum konsantratör	TOMY	MV-100