Yüksek çözünürlüklü Serum Monoklonal Protein Tespitinde Kapiller Elektroforezin İleri Uygulamaları

Özet

Burada, kapiler elektroforez kullanılarak yüksek çözünürlüklü serum protein analizi için bir protokol sunuyoruz. Yüksek voltajlı bir elektrik alanı altında, serum proteinleri yük ve elektroforetik hareketliliğe dayalı bir kapiller aracılığıyla hareket ederler. Ortaya çıkan elektroferogram, monoklonal protein zirvelerinin tespitini, lokalizasyonunu ve nicelendirilmesini sağlar.

Özet

Monoklonal immünoglobulin, M proteini veya paraprotein olarak da bilinir, plazma hücrelerinin veya B lenfositlerin klonal proliferasyonuyla üretilir ve monoklonal gamopatiler için önemli bir biyobelirteç olarak hizmet verir. Serum M proteininin doğru tespiti ve nicelendirilmesi, erken hastalık teşhisi, klinik sınıflandırma ve terapötik izleme için gereklidir. Bu protokol, serum proteinlerinin yüksek çözünürlüklü ayrılması için kapiller elektroforez (CE) kullanan bir yöntemi tanımlar. Proteinler, yüksek voltajlı elektroforez altında alkalin bir tamponda ayrılır ve ultraviyole emilimiyle tespit edilir; böylece anormal monoklonal protein zirvelerinin net görselleştirilmesi ve nicelendirilmesini sağlayan elektroferogramlar oluşturulur. Geleneksel yöntemlere kıyasla, CE beta bölgesinin daha iyi çözünürlüğünü sağlar ve minimum örnek işleme gereksinimiyle otomatik, hızlı analiz sağlar. Beş temsilci elektroferogram, β1, β2 ve γ bölgelerinde M protein göçünü gösterdi; M protein seviyeleri 0, %44,1 (45,8 g/L), %10,5 (8,6 g/L), %35,5 (28,4 g/L) ve çift zirveler %41,3 (46,0 g/L) ile %12,4 (13,8 g/L) idi. 700 klinik serum örneği üzerinde yapılan retrospektif çalışmada, CE %51,86 pozitif tespit oranı elde ederken, immünoksisasyon elektroforezi (IFE) için %52,86 oranı göstermiştir. IFE'yi referans yöntem olarak kullanarak, CE %92,70 hassasiyet ve %93,94 spesifiklik göstermiştir. Bu bulgular, CE'nin rutin klinik laboratuvarlarda serum M proteininin taraması ve nicelendirilmesi için hızlı ve otomatik bir yaklaşım olduğunu doğruladı.

Giriş

M proteiniyle ilgili bozukluklar, serumda ve/veya idrarda monoklonal bir immünoglobulin (M proteini) bulunmasıyla karakterize edilir. Bu proteinler genellikle klonal plazma hücreleri veya B lenfositleri tarafından salgılanır ve öncelikle kötü hutlu plazma hücresi diskrazileri veya iyi huylu monoklonal^{gamopatilerle ilişkilidir 1,2}. Bu durumların klinik spektrumu arasında belirsiz anlamlılığa sahip monoklonal gamopati (MGUS), tek hücreli plazmasitoma (SPC), tümseden multipl miyelom (SMM), multipl miyeloma (MM), plazma hücreli lösemi (PCL), Waldenström makroglobulinemi (WM), sistemik hafif zincirli amiloidoz (AL), B-hücreli non-Hodgkin lenfoma (B-NHL) ve diğer B-hücreli lenfoproliferatif bozukluklar (LPD) yer ^alır3. İspanya'da yapılan bir retrospektif çalışma, bu durumlar arasında MGUS'un en yaygın olduğunu, vakaların %54,1'ini oluşturduğunu, ardından MM'nin (%31,3) ve diğer kötü huylu gamopatilerin (%14,6) geldiğini bildirdi^. Ayrıca, M proteininin nefrotik^{sendrom 5} gibi bazı neoplastik olmayan durumlara yanıt olarak da üretilebileceğini belirtmek önemlidir.

M proteini testi, M proteinine bağlı hastalıkların tanı ve izlenmesinde kritik bir rol^{oynar 6}. Ancak, erken teşhis klinik bir zorluk olarak kalmaktadır; çünkü MM hastaları genellikle ilk evrelerde semptomatik olur ve bu da hastalığın nispeten ileri bir evresinde gecikmiş teşhise yol açar. MGUS hastalarının yaklaşık %1'i yıllık olarak kötü huylu bir duruma (MM, WM veya SPC⁷) ilerliyor. Neredeyse tüm MM vakalarının MGUS'tan evrildiğine inanılsa da, MM hastalarının %10'undan azının önceki MGUS tanısı öyküsü belgelenmiş olmaktadır. Sonuç olarak, serum ve/veya idrarda M proteininin zamanında tanımlanması, bu bozuklukların erken teşhisi için değerli ipuçları sağlayabilir ve bu durum hasta hayatta kalma ve prognozunu iyileştirmek için kritik öneme sahiptir. Araştırmalar, aktif tarama yoluyla tespit edilen MGUS hastalarının tesadüfen teşhis edilenlere göre daha az komplikasyon^{yaşadığını göstermektedir 8}. Terapötik izleme sırasında, M proteininin izotipi ve elektroforetik göç desenine dair bilgiler, orijinal monoklonal proteinin tekrarlanması ile oligoklonal bantların veya ikincil reaktif bir M^{proteini 9'un} ortaya çıkışını ayırt etmek için gereklidir. Otolog kök hücre naklinin ardından sıkça gözlemlenen yeni bir M proteininin ortaya çıkışı, çoğu hasta için genellikle olumlu bir prognostik gösterge olarak kabul^{edilir 10}. Bu gözlemle uyumlu olarak, karşılaştırmalı sağkalma verileri, ikincil M proteini geliştiren hastaların medyan genel hayatta kalma süresinin 115,3 ay olduğunu,¹¹ ay olmayanların ise 31,0 ay olduğunu göstermektedir.

Protein elektroforezi, son derece gelişmiş bir analitik tekniktir. Serum M proteininin tespiti için serum protein elektroforezi (SPE), IFE, kapiller elektroforez immünotipleme (IT), serbest hafif zincir (FLC) testi, ağır ve hafif zincir (HLC) tespiti ve kütle spektrometrisi (MS) gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Her yaklaşım kendine özgü avantajlar sunarken aynı zamanda doğal sınırlamalarla da karşılaşır. SPE, agaroz jel elektroforezi (AGE) ve CE olarak da alt bölümlere ayrılabilir. Agararoz bazlı bir ortam kullanan AGE, hızlı ayırım ve analiz için uygun basit ve maliyet etkin bir yöntemdir. Ancak, nispeten düşük hassasiyetle sınırlıdır; tipik bir tespit sınırı 0,3-0,5 g/^{L 12} olarak değişir ve bu da küçük hacimli veya düşük konsantrasyonlu M proteinlerinin tespit edilmemesine yol açabilir. Ayrıca, bu teknik, bant bükülmesine ve deformasyona karşı hassastır, bu da tekrarlanabilirliği zayıflatıyor.

IFE, M proteini tiplemesinde altın standart olarak yaygın olarak kabul edilir. İlk elektroforezden sonra, spesifik antikorlar (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, κ, λ) uygulanarak immünopresipitli bantlar oluşturulur ve böylece immünoglobulin tipi ve hafif zincir alt tipi tanımlanır. IFE, M proteinini 0.05-0.15 g/L kadar düşük konsantrasyonlarda tespit edebilir ve SPE'nin 10 katından fazla hassasiyet sağlar. Bu avantaja rağmen, M protein polimerleri içeren bazı örnekler için β-merkaptoetanol ile ayrışmayı sağlamak için özel ön işlem gereklidir. Yetersiz tedavi yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, yeni kombinasyon tedavileri uygulanan hastalar (örneğin, daratumumab, bortezomib, deksametazon ve talidomid/lenalidomid içeren rejimler) yanlış pozitif IFE bulguları^{verebilir 13}. IFE'nin temel sınırlamalarından biri, M protein seviyelerini nicelikten ölçememesi ve bu nedenle terapötik^{etkinliğin 14} izlenmesi için uygun olmaması nedeniyle sadece nitel sonuçlar sağlamasıdır. Tedavi edilen hastalar arasında, başarılı tedavi sırasında M protein konsantrasyonu düşse bile IFE sonuçları pozitif kalabilir.

Buna karşılık, BT ayırma ortamı olarak kapiler tamponlar kullanır ve geleneksel IFE'den daha yüksek çözünürlük sunar. Buna rağmen, süreç, genel tespit iş akışını uzatan antiserum karıştırma gibi zahmetli numune ön işlem adımları gerektirir. Ağır zincirlere bağlı olmayan immünoglobulin hafif zincirleri (κ ve λ) olan FLC'ler, serumda doğrudan "gizli bölge" epitoplarını hedefleyen antikorlar kullanılarak nicelendirilir; bu da 10–30 mg/L arasında düşük bir tespit sınırıyla hafif zincirle ilişkili bozuklukların tespit edilmesinde yüksek hassasiyet sağlar. MM'de yüksek serum FLC seviyeleri, tümör yüküyle korelasyonludur ve sağlam immünoglobulinlere kıyasla daha kısa yarı ömrü nedeniyle tedavi yanıtının daha erken değerlendirilmesine olanak^{tanır 15}. Ancak, klinik uygulaması, elektroforez gibi diğer tanı yöntemleriyle birleştirilerek diğer hastalıkları dışlamalı ve kapsamlı bir değerlendirme sağlanmalıdır. Örneğin, böbrek fonksiyonunun bozulması, yanlış şekilde yükselen ışık zinciri seviyelerine yol açabilir. HLC testleri, hem sabit hem de hafif immünoglobulin zincirlerinde epitopları hedef alan antikorlar kullanan başka bir nicel yaklaşımı temsil eder. Bu tasarım, izotipe özgü immünoglobulin eşleşmelerinin (örneğin, IgGκ ve IgGλ) ayrı nicelenmesine olanak tanır ve türetilen HLC oranı, klonalitenin hassas bir göstergesi olarak hizmet eder. Ancak, sonuçlar arka plan poliklonal immünoglobulin seviyelerinden etkilenebilir ve yöntem karmaşık M-protein varyantlarının analizinde daha az güvenilir olabilir. MS, olağanüstü hassasiyet sunar ve M proteinleri için derinlemesine proteomik karakterizasyon sağlar. Ancak, uygulaması yüksek ekipman maliyetleri, uzun analitik prosedürler ve veri yorumlama için gereken uzmanlık nedeniyle kısıtlanmaktadır.

CE, elastik erilmiş silika kapilyarlarını ayırma kanalı olarak kullanan güçlü bir analitik ayırma tekniğidir ve itici güç olarak yüksek voltajlı doğrudan elektrik alanını kullanır. Hedef analizlerin elektroforetik hareketliliği ve/veya bölme davranışındaki farklılıklardan yararlanarak yüksek çözünürlüklü ayrım sağlar. Teknoloji, kuruluşundan bu yana tek kapiler konfigürasyonlardan yüksek verimli kapiler dizilere ve minyatürize mikrofluidik cihazlara kadar ilerlemiştir. Uygulama alanları artık farmastik analiz, biyomedikal ve klinik tanı, gıda güvenliği testleri ve biyoterapevtik karakterizasyon gibi çeşitli alanları^{kapsamaktadır 16,17}. CE, M proteinlerinin taraması ve nicel analizi için giderek daha önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Toplam proteine göre M proteininin yüzdesini belirler; bu oran toplam protein konsantrasyonuyla çarpılarak mutlak M protein seviyeleri hesaplanabilir. En önemlisi, minimum örnek gereksinimi onu değerli veya hacim sınırlı örneklerin analizi için özellikle uygun kılmaktadır.

CE üç temel teknik avantaj sunar. İlk olarak, yüksek analitik hassasiyeti (0,1–0,5 g/L), düşük konsantrasyonlu M proteinlerinin etkili tespitini sağlar ve böylece MGUS ve hafif zincirli hastalıklar gibi durumlarda yanlış teşhis riskini azaltır. İkincisi, tam otomatik iş akışı, geleneksel jel bazlı boyama yöntemlerinde bulunan öznel yorumlama hatalarını ortadan kaldırır. Son olarak, test süresi önemli ölçüde 15–20 dakikaya indirilir; bu, geleneksel elektroforez için gereken 60–90 dakikadan belirgin şekilde daha kısadır. Zon elektroforezi ile sıvı kromatografisi arasında kritik bir analitik teknik olarak, CE serbest bir çözeltide elektroforetik ayrım gerçekleştirir. Uygulanan bir elektrik alanı altında, protein molekülleri esas olarak belirli bir pH'da alkali tampon içinde elektroosmotik akışla ayrılır. Özel bir tampon ile seyreltme sonrası, örnekler yüksek voltaj altında kapiller anoda enjekte edilir ve hızlı ve verimli protein ayrımı başlatılır, ardından katodda 200 nm hassasiyetinde tespit edilir. Her analitik döngüden sonra, kapilyarlar otomatik temizlik ve tampon yenilenmesinden geçerek sonraki örnekleri işler. Protein ayrımı şu sırayla gerçekleşir: gamma-globulin, beta-2-globulin, beta-1-globulin, alfa-2-globulin, alfa-1-globulin ve albumin; bu da bir veya daha fazla serum protein fraksiyonundaki anormalliklerin tespit edilmesini sağlar. Özellikle, CE beta bölgesinde gelişmiş çözünürlük sağlar ve beta-1 ve beta-2 globulin bileşenlerine ayırarak daha ayrıntılı klinik bilgi^{sağlar 18}. Yapay zekanın entegrasyonu ve çoklu parametre tespitindeki devam eden gelişmelerle CE, M proteini tespiti için birinci sınıf tarama modalitesine dönüşmeye hazırlanıyor. Bu nedenle, bu protokol klinik örneklerde serum monoklonal proteinlerinin hızlı tespiti, lokalizasyonu ve nicel analizi için kapiller elektroforezin kullanımını tanımlar.

Protokol

Çalışma protokolü, Guangdong İl Halk Hastanesi Etik İnceleme Komitesi tarafından incelenip onaylandı (Onay Numarası: KY2025-176-01). Tüm katılımcılar örnek toplamadan önce yazılı bilgilendirilmiş onay verdi.

1. Malzeme hazırlığı

NOT: Reaktif kiti 2–30 °C sıcaklıkta saklanmalı ve raf ömrü 3 yıla kadar olmalıdır.

1. Çalışan tamponu 2–8 °C sıcaklıkta saklayıp kullanmadan önce oda sıcaklığına ulaşmasını sağlayın. Açıldıktan sonra çözelti 3 aya kadar stabil kalır. Bu çözeltiyi kapiller elektroforezde serum protein ayrımı için koşan tampon olarak kullanın.
   NOT: Çalışan tampon kullanıma hazırdır ve pH değerleri 9.9 ± 0.5'dir. Reaktif kiti, serum protein ayrımı için çalışan tampon olarak kullanılan üç adet 700 mL alkalin tampon şişesi içerir.
2. Kullanmadan önce 75 mL konsantre durulama çözeltisi stokunu deionize suyla 750 mL'ye kadar seyreltin. Sulandırılmış durulama çözeltiyi oda sıcaklığında sakla. Açıldıktan sonra çözelti 3 aya kadar stabil kalır. Bu çözeltiyi elektroforezden sonra kapiller tüpleri temizlemek için kullanın.
   NOT: Durulama çözeltisi sodyum hidroksit içerir ve kapiller temizlik için kullanılır.
   DIKKAT: Durulama çözeltisi, ciddi yanıklara yol açabilen aşındırıcı bir madde olan sodyum hidroksit içerir. Göz teması durumunda hemen bol suyla duruyun ve tıbbi yardım alın. Cilt veya giysi kontamine olursa, kontamine giysileri hemen çıkarın. Her zaman uygun koruyucu giysiler giyin ve göz ile yüz koruması kullanın.
3. Reaktif bardakları orijinal kapalı pakette, 2–30 °C sıcaklıkta, temiz ve kuru bir yerde sakla. Tam otomatik cihazlarda numune seyreltme için reaktif bardakları kullanın.
4. Kapatılmış filtreyi oda sıcaklığında (15–30 °C) kuru bir yerde sakla. Tek kullanımlık filtreleri kullanarak tampon çözeltilerini ve deiyonize suyu filtreleyin.
5. Kapiller temizleme çözeltisini ( bkz. Malzemeler Tablosu) 2–8 °C sıcaklıkta sakla ve yağıntıdan kaçın.
   NOT: Her kapiller temizlik çözeltisi konsantre şişesi (25 mL/şişe) proteolitik enzimler, yüzeyaktif maddeler ve diğer katkı maddeleri içerir. Katkı maddeleri uygulama konsantrasyonunda tehlikeli değildir ve optimal performans için gereklidir. Çözüm, kapiller tıkanıklığı önler ve optimal performansı korur.
6. Gözenek boyutu 0,45 μm, iletkenliği 3 μS/cm'nin altında ve direnç 0,33 MΩ·cm'≤ üzerinde filtrelenmiş deiyonize su kullanın. Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için suyu her gün değiştirin. Bu suyu elektroforez analizörünün kapiller tüplerini temizlemek için kullanın.
7. %2–3 mevcut klor içeren sodyum hipoklorit çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi örnek prob temizliği için kullanarak adsorbe edilmiş proteinleri çıkarabilirsiniz. Çalışan klorlu çözeltiyi oda sıcaklığında kapalı bir kapta saklayın. Çözüm 3 aya kadar stabil kalır. Güneş ışığı, ısı, alevlenme kaynakları, asitler veya amonyak yakınında depolamayın.

2. Örnek toplama

1. Hastaların kan almadan önce en az 8–12 saat oruç tutmasını sağlayın.
2. Hemodinamiği stabilize etmek için hastalardan 10–15 dakika boyunca oturarak veya sırtüstü pozisyonda dinlenmelerini istekleyin.
3. Aşağıdaki malzemeleri hazırlayın: tek kullanımlık venöz kan iğneleri, vakum kan toplama tüpleri (serum tüpleri), turnike, steril pamuk çubukları, %75 alkol veya iyodofor dezenfektan, tıbbi yapıştırıcı bandaj ve biyolojik tehlike atık konteyneri.
   NOT: Dirsek fossasındaki median kubital ven tercih edilen delme noktasıdır.
4. Damarı yeterince doldurmak için delme noktasının 3–5 cm yukarısına turnike uygulayın.
5. Deri, merkezden dışa doğru santrifüj spiral deseniyle %75 alkol veya iyodofor ile dezenfekte edin; ≥5 cm çapında bir alanı kaplayın ve dezenfektanı tekrar dokunmadan doğal olarak hava kurumasına izin verin.
6. İğneyi eğimi yukarı doğru 15–30° açıda cilde tutun ve deri ile damar duvarını pürüzsüzce delin.
7. Kan geri dönüşünü gözlemledikten sonra iğneyi sabitleyin ve vakum tüpünü bağlayın. Hemolizi önlemek için manuel kompresyon olmadan negatif basınç altında kanın tüpü pasif şekilde doldurmasına izin verin.
8. Toplandıktan sonra turniketi serbest bırakın, ardından iğneyi nazikçe çıkarın ve hemostazı sağlamak için steril pamuk çubukla delme yerine hemen 3–5 dakika boyunca baskı uygulayın.
9. Toplanan örneği oda sıcaklığında dik konuma koyup kanın doğal olarak pıhtılaşmasına izin verin.

3. Numune kalite değerlendirmesi

1. Santrifüj serumu örnekleri 2.095 x g ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca alın.
2. Serum örnekleri, yeterli doğal ışık altında düz beyaz bir arka plan altında sıkı görsel kalite değerlendirmesine tabi tutulun.
3. Hemoliz, üst yüzeyin rengini ve berraklığını inceleyerek değerlendirin. Üst yüzey şeffaf ve sarı görünüyorsa örnekler hemolizlenmemiş olarak sınıflandırılırken, pembe veya kırmızı renk değişikliği hafif veya şiddetli hemolizin işaretidir.
   NOT: Hemoliz çift alfa-2 bölgesi oluşturabilir. Beta-2 fraksiyonu, yaşlanmış veya yanlış depolanmış serum örneklerinde azalabilir.
4. Fibrinojen girişimi için görünür fibrin zincirleri, pıhtılar veya jelatinimsi ağlar ile tamamlanmamış faz ayrımı, bulanıklık veya tutarsız analitik sinyaller kontrol edilsin.
   NOT: Fibrinogen beta-2 pozisyonunda (omuz beta-2 üzerinde veya beta-2 bölgesi ile üst üste biniştirilmiş, muhtemelen bu fraksiyonun artması olabilir) göç eder. Bazı örneklerde (plazma, tam defibrinasyonlu olmayan serum veya antikoagülan tedavi alan hastalar) fibrinojen analizi engelleyebilir ve monoklonal bant şüphesi veya beta-2 fraksiyonunun artışı gibi yanlış yoruma yol açabilir.
5. Analizden tespit edildikten sonra hemoliz, fibrinojen girişimi veya diğer ön analitik anormallikler gösteren örnekleri hariç tutun.
6. Uygun pıhtılaşma süresi ve standart santrifüj parametrelerini garanti ederek standart flebotomi ve işlem protokollerine uygun yeni bir kan örneği alın. Sonraki testler için yalnızca tatmin edici görünüme sahip örnekler kullanın—berrak, hemoliz, fibrin, lipemi veya kontaminasyon içermemiş.
7. Ayrılmış serum örneklerini mümkün olan en kısa sürede oda sıcaklığında test edin. Hemen test yapılamazsa, örnekler 2–8 °C'de 10 güne kadar, -20 °C'de ise 30 güne kadar saklanır. Numuneleri tekrar tekrar dondurup eritmeyin.
   NOT: Plazma örneklerinden kaçının. Yaşlanmış plazma örnekleri analiz edilirken (ki bu önerilmez), C3 komplementi gibi değişken bileşenler zamanla bozulur, bu nedenle beta-2 bölgesi esasen fibrinojenle eşleşir.
8. Test öncesi örnekleri oda sıcaklığına geri getirin ve iyice karıştırın. Dondurulmuş örneklerin kullanımdan önce tamamen çözüldüğünden emin olun.
   NOT: Seyreltilmemiş serum protein örnekleri kullanın. Bazı soğutucu serumlar, özellikle kriyoglobulin veya kriyogel içerenler, viskoz veya bulanık hale gelebilir. Poliimmünoglobulin içeren örnekleri doğrudan ek ön işlem olmadan kullanın.

4. Operasyonel prosedürler

1. Otomatik kapiler elektroforez analizörüne (bkz. Malzemeler Tablosu) ve bağlı bilgisayar sistemine güç veriliyor. Enstrüman tamamen başlatılana kadar bekle.
   NOT: Kapiller uzunluğu ve iç çapı sırasıyla 17,5 cm ve 25 μm'dir. Ayırma voltajı 8.000–10.000 V arasında değişir. Elektrokinetik enjeksiyon kullanılır ve ayırma sıcaklığı yaklaşık 25 °C'de tutulur. Toplam çalışma süresi örnek başına yaklaşık 10 dakikadır.
2. Bilgisayara yüklenen PHORESIS yazılımını ( bkz. Materyaller Tablosu) veri işleme için başlatın.
3. Yazılım arayüzünden PROTEIN (E) 6 programını seçin ve ardından çalışan tampon şişeyi enstrumana yerleştirin.
   NOT: Bu program, serum protein fraksiyonlanması için özel olarak tasarlanmış fabrika kalibrasyonlu bir ön ayar protokolüdür. Tüm parametreler enstrümanın PHORESIS yazılımında önceden yapılandırılmıştır ve manuel modifikasyona gerek yoktur.
4. Gerekirse, çözünürücü temizlik solüsyesi içeren reaktif şişesini cihazın içine yerleştirin.
5. Yeni bir reaktif kupunu kapiler elektroforez analizörünün otomatik yükleme platformuna takın.
6. Kullanılan reaktif kapları için kapiller elektroforez analizörünün standart atık bertaraf pozisyonuna yeni bir atık kutusu takın.
7. Örnek raflarını sağ taraftaki açıklıktan (maksimum kapasite: 15 rack) analizöre yükleyin.
   NOT: Her raf 8 örnek tüpünü barındırabilir. Her test tüpünün barkodu, raf açıklığından görünür olmalıdır.
8. Kontrol serumu için örnek rafı No. 0'ı kullanın. 20 test veri noktasından hesaplanan kümülatif ortalama ve varyasyon katsayısına dayalı üçüncü taraf kalite kontrolünü kullanın.
9. Tamamlanmış numune rafını sol taraftaki boşaltma tepsisinden çıkarın. Gerekirse kullanılan reaktif kaplarını içeren atık kutusunu çıkarın ve atın.
   DIKKAT: Kullanılmış reaktif kaplarını dikkatli kullanın, çünkü biyolojik örnekler içerebilirler.
10. Kapiller temizleme çözeltiyi ikincil reaktif odasında S2 pozisyonuna yerleştirin. Enstrüman ekranında Bakım ve Temizlik'e tıklayın, ardından Capiclean'i başlat'ı seçin.
11. %2-3 sodyum hipoklorit çözeltisi ikincil reaktif odasına (T1 pozisyonu) yerleştirilin. Cihaz ekranında Bakım ve Temizlik seçeneğine tıklayın ve Dekontamasyon Başlat'ı seçin.
    NOT: Tüm kapiller temizleme süreci otomatik olarak 45 dakika sürer.
12. Temizleme işlemini haftada en az bir kez başlatın.

5. Sonuç analizi

1. Her analiz çalışması tamamlandıktan sonra, ham verileri enstrümandan işleme için yazılıma iletin. Yazılım, bilgisayar ekranında gösterilen bir elektroferogram üretir.
2. Elektroferogramı analiz edin ve yazılım kullanarak 200 nm dalga boyunda her protein bandının göreli emilim yoğunluklarını nicelikle ölçebilirsiniz.
   NOT: Tam otomatik biyokimyasal analizör tarafından ölçülen toplam protein konsantrasyonlarına dayanarak, yazılım her protein bandının konsantrasyonunu hesaplar.
3. Oluşturulan elektroferogramları anormal bantların görsel değerlendirmesi ve tanımlaması için kullanın.
   NOT: Varsayılan olarak, sistem elektroferogramları yeniden çizim modunda gösterir.
4. Gerekirse ham veriden türetilen ilk elektroferogramları sunmak için standart bir mod kullanın.
   NOT: Kapiller elektroforetik analizörün referans aralıkları, normal trigliserid seviyelerine sahip 246 sağlıklı yetişkin katılımcının (hem erkek hem kadın) istatistiksel analiziyle belirlenmiştir (Tablo 1). Her laboratuvarın kendi standartlarını oluşturması önerilir.

6. Alet kapanması

1. Her analiz dizisinin sonunda, kapiler elektroforez analizörünün kapanma prosedürünü başlatarak kapilleri ideal koşullarda depolayabilirsiniz.
   1. Kapatma prosedürünü başlatmak için ana menüden "Kapatma" seçeneğini seçin veya analizörün yanında verilen kapatma rafını kullanın.
   2. Ana menüde "Kapatma" tuşuna basın. Ekranda görünen pencerede, prosedürü başlatmak için tuşuna basın . Devam eden analiz programı tamamlandıktan sonra kapatma süreci otomatik olarak başlayacaktır.
   3. Kapatma rafı "SÖNME/KAPANMA KAPILLERLERI 3 & MC" olarak etiketlenmiştir. Bu rafı örnek raf kuyruğunun sonuna yerleştirirseniz, cihaz otomatik olarak kapatma işlemini başlatır.
      NOT: Kapatma işlemi tamamlandığında, cihaz kapanır ve ekran kapanır.
2. Analizörü şebeke gücünden ayırmak için cihazın arkasındaki fiziksel güç anahtarını kullanın.
3. İki reaktif odasından tüm reaktif şişelerini çıkarın ve önerilen saklama koşullarında saklayın. Tam otomatik elektroforez analizörünün yaygın arızaları, olası nedenleri ve çözümleri Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

7. Performans parametreleri

1. Kapiller elektroforez prosedürünün analitik hassasiyetini belirlemek için, gama bölgesinde anormal bir protein içeren serum örneğinin seri seyreltmelerini hazırlayıp analiz edin. Belirgin bir anormalliğe sahip en yüksek seyreltme, anormal proteinin 19 mg/dL konsantrasyonuna karşılık gelir.
   NOT: Anormal protein ve poliklonal arka planın gama bölgesindeki konumuna bağlı olarak tespit sınırı değişebilir.
2. Doğruluk değerlendirmesi – İçsel korelasyon
   1. Numune bütünlüğünü sağlamak için, tüm serum örnekleri (18 normal örnek ve 100 patolojik örnek dahil) aynı şekilde işleyin ve aynı yönergelere göre işlenin.
   2. Her protein fraksiyonunun seviyelerini, analizörde kapiller elektroforetik prosedürle elde edilen elektroforetik ayrımlar ve protein analizi için ticari olarak sunulan başka bir kapiller elektroforez tekniğiyle ölçün.
   3. Her iki prosedürden ölçülen değerleri doğrusal bir regresyon istatistiksel prosedürle analiz edin. Elde edilen sonuçlar, her iki prosedür arasında mükemmel bir korelasyon göstermiştir.

Sonuçlar

Her protein bandının göç pozisyonları, zirve özellikleri ve göreli yüzdeleri, serum proteininin emilimi tespit edilerek nicel olarak analiz edildi. Klinik yorumlama, elektroferogramda gözlemlenen anormal bantların varlığı ve desenine dayanarak gerçekleştirilmiştir. Serum protein fraksiyonlarının normal göç desenini gösteren temsilli bir kapiller elektroferogram Şekil 1'de gösterilmiştir. Zirve göç sürelerindeki değişiklikler, öncelikle kan matrisi özelliklerini etkileyen hastalar arasındaki ...

Tartışma

SPE, klinik laboratuvarlarda temel bir tanı tekniğidir ve serum proteinlerini izoelektrik noktaları, moleküler ağırlıkları ve konformasyonlarındaki farklılıklara göre^{ayırır. 19}. Bu çalışma, CE kullanılarak serum M proteininin hızlı tespiti ve nicelendirilmesi için sistematik bir protokol ortaya koymaktadır. Protokol, yöntemin mükemmel analitik performansını vurgular; temel avantajları yüksek hassasiyet, yüksek veri verimliliği ve tam otomasyon^20<...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CAPI 3 PROTEIN (E) 6 tampon	SEBIA	2503	Kapiller elektroforezde serum protein ayrımı için kullanılan koşturan tamponu (el yazmasında koşu tamponu olarak adlandırılır).
De lavage yıkama çözeltisi	SEBIA	2062	Elektroforezden sonra kapiller tüplerin temizlenmesinde kullanılan seyreltilmiş durulama çözeltisi.
Reaktif kupaları	SEBIA	2582	Tam otomatik enstrümanlarda örnek seyreltme için.
FILTRE KAPILLARLARI	SEBIA		Kapiller temizliği sırasında tampon çözeltileri ve deiyonize su filtrelemek için kullanılan tek kullanımlık filtre.
CAPICLEAN	SEBIA	2060	CAPILLARYS 3 OCTA enstrümanlarının kapiller tüplerini temizlemek için (el yazmasında kapiller temizleme çözeltisi olarak adlandırılır)
Sodyum hipoklorit çözeltisi	Guangzhou Kimyasal Reaktif Fabrikası	1703079	Numune prob temizliği için.
Deionize su	Watsonlar	/	Otomatik kapiler elektroforez analizöründe kapiller durulama için kullanılır.
Randox kalite kontrolü	Randox	HN1530	Kalite kontrolü için.
Tam otomatik kapiller elektroforez analizörü	SEBIA	KAPILLALAR 3 OCTA	Yüksek çözünürlüklü ve yüksek verimli serum protein analizi için kullanılan cihaz.
PHORESIS 9.30 yazılımı	SEBIA	/	Elektroforez desenlerinin otomatik olarak alınması ve analizi için kullanılan yazılımlar.