Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Dışkısı Örnekleri için DNA Viral Boyut Fraksiyonu Metagenomikleri

389 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

24 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

Bu makalede

Özet

İnsan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli viral boyutlu fraksiyon metagenomları (viromlar) üretmek için esnek bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta toprak viromikleri için geliştirilen bu protokol, burada dışkı örneklerine başarıyla uygulanarak insan bağırsak virosferinin sağlam bir şekilde karakterizasyonu sağlanmıştır.

Özet

Sağlıklı insan virosferini (mikrobiyomun viral bileşeni) anlamak, çeşitli viral tiplerde viral topluluk bileşiminin doğru ölçümlerini gerektirir. Toprak viral topluluk ekolojisi yöntemleriyle ilgili önceki deneyime dayanarak, burada insan dışkı örneklerindeki ekstraselük DNA virüslerinden DNA zenginleştirme ve çıkarma için bir dizi laboratuvar yaklaşımı gösteriyoruz. Çalışan bir birincil protokol sunulur ve farklı adımlarda sapma seçenekleri sunulur. Genel yaklaşım, dışkı matriksinden serbest viral partiküllerin çıkarılmasını kolaylaştırmak için sıvı tampon (varsayılan olarak: proteinle güçlendirilmiş fosfat tamponlu tuzlu süzme, PPBS) eklemesini, viral partikülleri içeren sıvı fraksiyonu ayırmak için santrifüjlemeyi, çoğu hücreyi çıkarmak için filtreleme (varsayılan olarak 0,2 μm gözenek büyüklüğünü), viral partiküllerin konsantrasyonunu (varsayılan: ultrasantrifüjleme), virion lizisinden önce nükleazlarla serbest nükleik asitlerin çıkarılmasını içerir. ardından dizileme için DNA çıkarımı yapılır. Farklı tamponlar, filtre boyutları ve konsantrasyon yöntemleri gibi alternatif teknikler de belirtilmektedir. Genel olarak, dizileme için yüksek kaliteli viromik DNA üretmek için birden fazla seçenek sunulmaktadır. Yaklaşımı belirli ekipman ve kaynaklara göre uyarlamak yerine, protokolün esnekliği onu farklı standart moleküler biyoloji ekipmanlarına sahip laboratuvarlarda geniş çapta uygulanabilir hale getirmelidir.

Giriş

Viromik, yani karışık toplulukların viral boyut fraksiyonunun hedeflenmemiş metagenomik dizilenmesi, kültürlenmemiş virüslerin çeşitliliği, evrimi ve ekolojisi hakkında içgörüler sağlayabilir. 20 yıldan fazla bir süre önce bağırsak viral topluluklarını kataloglama için yapılan ilk çalışmalardan bu yana, özellikle deniz suyu gibi çevresel örnekler için geliştirilen yöntemlerkullanılarak gerçekleştirilen viromik yaklaşımlar insan mikrobiyomunda viral ekolojide keşiflerin yapılmasını sağlamayadevam etmiştir 2. Ancak, tek bir evrensel viromik protokolü yoktur ve tekniklerdeki farklılıklar dizilemesonuçlarını etkileyebilir 3,4, bu da nihayetinde viral topluluk dinamiklerinin yorumlanmasını etkileyebilir ve çalışmalar arası karşılaştırmaları engeller. İnsan virosferini sağlam bir şekilde karakterize etmek için optimize edilmiş protokoller ve metodolojik seçimlerin virom profillerini nasıl şekillendirdiğine dair kapsamlı bir anlayış gereklidir.

Evrensel bir viromik protokolü olmasa da, viromik yöntemlerin genel temeli, hücre dışı virüs benzeri parçacıkların (virionların) boyutları ve/veya yoğunluklarına göre fiziksel olarak ayırıp yoğunlaştırılması, virion lizisinden önce hücresel kalıntılardan veya zayıf viral kapsidlerden elde edilen serbest nükleik asitlerin çıkarılmasını ve dizileme için DNA ve/veya RNA çıkarılmasını içerir. Bazı viromik teknikleri, araştırmacıların kasıtlı seçimi ya da istenmeyen bir metodolojik sınırlama olarak belirli viral tipleri tercih eder veya onlara karşı seçim yapar. Mikrobiyal hücreleri ve diğer kalıntıları temizlemek için sıkça şırınga veya vakum filtreleme kullanılır ve filtre boyutu, geri kazanılabilir viromun kalitesini ve bileşimini doğal olarak etkiler. Örneğin, filtreleme viromsaflığını artırabilir 5, ancak daha büyük viralparçacıkları 6,7 dışlayabilir. Ultrasantrifüj, polietilen glikol (PEG) çöktüm, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme ve ultrafiltrasyon gibi virion konsantrasyon yöntemleri de saflık, veri verimliliği ve ekipmanmaliyetleri arasında 3,8 farklı değişiklikler sunar. Çoklu tampon kimyalarının viromikler için etkili olduğu bilinmektedir. Virom karakterizasyonu üzerinde çok büyüketkileri olmayabilirler 9, ancak depolama ve yeniden süspansiyon tamponları virüs iyileşmesini ve biyoinformatik analizden elde edilen viromprofillerini etkileyebilir 10,11. Son olarak, doğal örneklerde viral nüklein asit konsantrasyonları düşük olabildiğinden, birçok çalışma kütüphane yapımından önce viral DNA'yı amplifikasyonu tercih eder (örneğin, çoklu yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) veya dizisiz tek primer amplifikasyonu (SISPA) ile). Ancak bu tekniklerin bazıları önemli bir önyargı(12,13) getirir. Genel olarak, birçok viromik yöntemi viromları başarıyla üretebilse de, önyargıları kabul eden ve bir ölçüde standartlaştırılmış optimize edilmiş protokoller, doğru ve tekrarlanabilir virom araştırmalarını mümkün kılacaktır.

Bu makale, insan dışkı örneklerinden virom üretmek için esnek bir iş akışı sunmaktadır. Kanıtlanmış toprak viromiktekniklerinden uyarlanan bu protokol, araştırmacıların kendi ekipmanlarına ve araştırma ihtiyaçlarına uyarlamasını sağlayan birkaç adım içerir. Aşağıda belirtilen standart toprak viromik yöntemi, hem toprak hem de donmuş dışkı örneklerine başarıyla uygulanarak, kütüphane yapımından önce viral DNA amplifikasyon aşaması olmadan yüksek kaliteli viromlar üretir. Protokol değişiklikleri önerileri diğer çalışmalarda çeşitli derecelerde test edilmiştir, ancak insan dışkı virom dizileri üzerindeki özgül, sonraki etkileri burada incelenmemiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Dışkı örneği toplamak için işe alınan tüm denekler bilgilendirilmiş onay verdi. Örnek toplama protokolleri Kaliforniya Üniversitesi Davis Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve çalışmalar Helsinki Bildirgesi'ne uygundur. Bu protokol Emerson ve ark. (2022)17'den uyarlanmıştır.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Proteinle güçlendirilmiş fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PPBS, 10x PBS, %1 K-sitrat, 150 mMMgSO 4, %2 sığır serum albümini (BSA))18 hazırlanın.
    NOT: Viromik protokollerinde yaygın olarak kullanılan diğer tamponlar ise tuzlu magnezyum (SM)19 ve değiştirilmiş potasyum-sitrat asal (AKC') tampon11'dir.
    1. 10 ml 10x PBS, 10 g K-sitrat, 18,05 g susuzMgSO 4 ekleyin ve 1 litreye ultra saf laboratuvar suyuyla doldurun. pH 6.5'e ayarlanır (genellikle yaklaşık 50 μL 6 M HCl veya yaklaşık 100 μL 2 M HCl gerektirir). Şişenin içinde bir karıştırma çubuğu bırakın, Adım 1.1.2'de kullanın.
    2. Şişeyi tampon ve bir boş 1 L otoklavlanabilir cam şişe ile otoklav yapın. Otoklavlama sonrası, tampon oda sıcaklığına soğuduktan sonra, manyetik bir karıştırma plakasına koyup şişeye yavaşça 20 g BSA ekleyin, aynı anda yaklaşık 5 g BSA ekleyin (köpürtmeyi önlemek için, çözeltiyi aşırı karıştırmayı en aza indirin, örneğin yavaş bir karıştırma hızıyla başlayın ve kademeli olarak artırın).
    3. Tüm tampon hacmini, steril 0.22 μm vakum filtresinden 1.1.2. adımdan itibaren boş otoklavlanmış 1 L şişeye filtreleyin. Tamponu 4 °C'de tutun ve kullanıma kadar kullanın.
      NOT: PPBS tamponu yaklaşık 3 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir, ancak donma noktasının üzerinde saklandığında uzun vadede stabil olmaz.
  2. Ultrasantrifüj tüplerini hazırlayın.
    NOT: Bu protokol, virionları konsantre etmek için ultrasantrifüj kullanır. Diğer yaygın yaklaşımlar arasında polietilen glikol (PEG) çökeltilmesi, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu (örneğin, sezyum klorür gradyanları) ve ultrafiltrasyon yer alır.
    1. Ultrasantrifüj tüplerini temizlemek için önce tüpleri ultra saf laboratuvar suyuyla ovala. Sonra tüpleri ultra saf laboratuvar suyla durulayın.
    2. Tüpleri 1 M NaOH ile doldurun ve en az 1 saat bekletin (gece boyunca bekletebilirsiniz). Plastik/kauçuk ultrasantrifüj kapaklarını ve o-ringlerini 1 M NaOH'ya daldırarak temizleyin.
      NOT: Metal vida kapaklarını NaOH'ya daldırmayın.
    3. Beklettikten sonra ultra saf laboratuvar suyla üç kez durulayın, ardından nükleaz içermemiş, moleküler biyoloji kalitesinde suyla bir kez durulayın. Tüpleri ters çevirerek ve hafifçe tıklayarak ya da gece boyunca tamamen kurumasına izin vererek kurutun. Her ultrasantrifüj tüpünü örnek tanımlayıcı ile etiketleyin.
  3. Ultrasantrifüj rotorunu 4 °C'de önceden soğutarak rotoru gece buzdolabında veya soğuk odada bırakın.

2. Virion arındırması ve konsantrasyonu

  1. Dışkıyı steril, DNaz-, RNase- ve DNA-içermeyen 50 mL konik tüpe şeklinde tartınız.
    NOT: Kullanılan dışkı miktarı, mevcut numune malzeme miktarına bağlı olabilir. Burada 2 g dışkı kullanıldı. Kullanılmayan numune materyalinin dondurulmuş olarak saklanması gerekiyorsa, gelecekteki donma-erime döngülerini en aza indirmek için dondurmadan önce tüm örneği alikot etmeyi düşünün.
  2. 8 mL PPBS tamponu doğrudan dışkıyı içeren konik tüplere ekleyin (konik #1). Vortexleme ile tamamen yeniden askıya alın.
  3. Tüpleri 300 RPM'de 4 °C'de 10 dakika boyunca sallayın.
    NOT: Gerekirse, sallama oda sıcaklığında yapılabilir, ancak 4 °C önerilir.
  4. Santrifüj örnekleri konik #1 içinde 4.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 10 dakika boyunca alın.
    NOT: Mümkünse, dikey yoğunluk ayrımını kolaylaştırmak için sallanan bir kovalı rotor kullanın; böylece sonraki adımları kolaylaştırabilirsiniz.
  5. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 50 mL'lik bir konik (konik #2) içine boşaltın ve 4 °C'de saklanın (burada süpernatant viryonları içerir). Peleti içeren konik tüpü (konik #1) atmayın, çünkü bu tüp Adım 2.6'da tekrar kullanılıyor.
  6. 2.2-2.5 adımlarını iki kez daha tekrarlayın (böylece konik #1'deki örnek toplamda tampon, 3x sarsma ve 3x santrifüjleme ile 3 kez yeniden süspansiyondan geçmiş olur) ve üst yüzeyi konik #2'ye toplamaya devam edin.
    NOT: Üç mermi toplamda ~24 mL süpernatant biriktirmelidir.
  7. Birikmiş süpernatantı (konik #2) içeren 50 mL konik tüpü 8 dakika boyunca 10.000 x g ve 4 °C'de santrifüj yapın.
  8. İkinci bir santrifüj turu yapın. İlk olarak, konik #2'den süpernatantı yeni bir 50 mL'lik konik tüpe (konik #3) içine dekant edin. Santrifüj konik #3'ü 8 dakika boyunca 10.000 x g ve 4 °C'de kullanabilirsiniz.
  9. Şırınga filtrelemesiyle, konik #3'ten süpernatantı sıralı olarak filtreleyin, peleti tüpün dibinde/yakınında koymaktan kaçının. Steril 5.0 μm polietersülfon (PES) şırınga filtresi ile ön filtre, ardından steril 0.20 μm PES şırınga filtresi ile doğrudan ultrasantrifüj tüpüne bağlanır.
    NOT: 5.0 μm filtrelerle ön filtreleme amacı, 0.20 μm filtrelerin tıkanmasını azaltmaktır. Tıkanırsa şırınga filtrelerini atıp değiştirmek yine de gerekebilir. Filtreleme tek adımda, 5 μm filtrenin 0.20 μm filtrenin üzerine yığılması, tek bir şırıngaya bağlanarak ve doğrudan bir ultrasantrifüj tüpünün içine yerleştirilerek gerçekleştirilebilir. PES membranları tercih edilir, çünkü diğer membran malzemeleri virionları tutabilir (örneğin cam lif) veya daha hızlı tıkanabilir (örneğin, poliviniliden florür, PVDF). 0.45 μm ise yaygın bir filtre boyutudur.
  10. Tüm ultrasantrifüj tüplerinin kütlesini örnek içerikleriyle kontrol edin ve ultrasantrifüjdeki tüpleri kütleye göre eşleştirin. Gerekirse, her çiftin hafif tüpüne PPBS ekleyerek ağırlığı eşitleyin (eşleştirilmiş tüpler için 0,05 g hata marjı içinde).
  11. 112.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de vakumda 2 saat 25 dakika ultrasantrifüj.
    NOT: Kullanılan rotora bağlı olarak, dönüş süresi (sediment katsayısına (s) = 58'e göre değişecektir. Burada kullanılan rotor için Malzeme Tablosu'na bakınız. Tüpleri ultrasantrifüjden çıkarmadan önce, viral pelletin yerini belirlemeye yardımcı olmak için rotordaki her tüpün yönünü not edin. Bazen, ultrasantrifüjasyondan sonra viral pellet görünmez ve sonraki adımda süpernatantı çıkarırken ekstra dikkatli olmak gerekir.

3. Viral pelet yeniden süspansiyonu ve DNaz tedavisi

  1. Süpernatantı ya dekantasyon yoluyla ya da pipet kullanarak çıkarın; pellet kırılgan olabilir (pellet konsantre virionları içerir).
    NOT: Adım 2.11'de belirtildiği gibi, pelet görünür olabilir ya da görünmeyebilir, ancak 'delik deliği boyutunda' kahverengi veya sarı bir pelet sıklıkla görülebilir.
  2. Örnekleri DNAZ'la tedavi edin.
    NOT: DNaz tedavisi örneklerini tercih etmemeyi tercih ederseniz, 4. Adıma geçin ve "DNaz tedavisi yapılmadıysa" prosedürünü takip edin. DNaz tedavisinin yapılmasıyla ilgili değerlendirmeler için Tartışmaya bakabilirsiniz.
    1. Pellet, 100 μL nükleazsız, moleküler biyoloji kalitesinde suya yeniden askıya alın, etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir.
    2. Her işlem yapılacak örnek için 10 μL DNaz reaksiyon tamponu ve 10 μL DNaz ekleyerek DNaz işlem ana karışımı yapın. Pipet ile iyice karıştırın.
      NOT: Pipetleme sırasında potansiyel hacim kaybını hesaba katmak için ekstra reaksiyonlar için yeterli DNaz işlem master karışımı hazırlamak için Step 3.2.3'te.
    3. Resüspansiyonlu virionlara 20 μL DNaz işlem master karışımı ekleyin. Nazik pipetle iyi karıştırın. 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    4. Nukleazları inaktive etmek için 10 μL DNaz stop çözeltisi ekleyin. Kısa bir girdap oldu.

4. Viral nüklein asitlerin ekstraksiyonu

  1. DNA çıkarımını, Materyaller Tablosu'nda listelenen DNA çıkarma kiti kullanarak gerçekleştirin.
    NOT: Üreticinin talimatlarında iki değişiklik yapın. 1) Kit prosedürünün 1. adımından sonra, virionları içeren boncuk borusunu tampon CD1'de 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın, ardından üreticinin talimatlarına göre ekstraksiyona devam edin. 2) DNA elusasyon aşamasında (kit prosedüründe 16. adım), C6 eklendikten sonra kolonları oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka altına alın.
    1. DNaz tedavisi yapıldıysa: Nukleazlar inaktive edildikten sonra (Adım 3.2.4'te), tüm hacmi DNA çıkarımı için giriş olarak kullanın (yani, DNA çıkarma kiti prosedürünün 1. adımında, bu hacmi 800 μL CD1 içeren boncuk tüpüne ekleyin). Geride hiçbir çözelti bırakmadığınızdan emin olun (bu çözelti virionları içerir).
    2. DNaz tedavisi yapılmadıysa: Step 3.1'den pellet içeren ultrasantrifüj tüpüne 100 μL nükleaz içermemiş, moleküler kalitede su ekleyin. Pelleti nazikçe kazıyıp tekrar süzül. DNA çıkarımı için yeniden askılanmış pelleti giriş olarak kullanın.

5. DNA niceliklendirmesi

  1. Çıkarılan DNA'yı tercih ettiğiniz floresans tabanlı yöntemle nicelikle ölçün.
    NOT: Virom DNA verimleri nadiren emilim temelli nicelik için yeterince yüksek olur; ancak bu kimyasal kirleticileri tanımlamak için yine de faydalı olabilir.
  2. Kısa süreli depolama için, nicelikten sonra DNA'yı -20 °C'de depolayın. Daha uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanın. DNA artık kütüphane hazırlığı ve dizilemesi için hazırdır. Burada kullanılan kütüphane hazırlık kiti ve sıralama platformu için Materyaller Tablosu'na bakınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolü, iki toprak örneğiyle birlikte tek bir dondurulmuş dışkı örneğine (viromlar için teknik üçlükte işlenmiş) ve iki toprak örneği ile birlikte uygulanması, farklı örnek türlerinden yüksek kaliteli viromlar üretmedeki etkinliğini göstermiştir. Bu protokol tarafından üretilen kalite filtreli dizileme verileri ve de novo derlenmiş kontigler kullanılarak, varsayılan viral diziler açık kaynaklı virüs tanımlama aracıkullanılarak tanımlanmıştır 20

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, virom üretmek için nispeten basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunar. 14,15,16,21 topraklarında kanıtlanmış olup, burada insan dışkı örneklerine başarıyla uygulanmıştır. Bu protokol, hücre dışı ve sağlam DNA virüslerini en iyi şekilde geri kazanmayı sağlar ve kasıtlı olarak hücre içi virüsleri veya profajları (bazıları kontamine hücrelerden elde ed...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Dr. Sean Adams, Trina Knotts ve Mohamed R. Ali'ye (Kaliforniya Üniversitesi, Davis Tıp Fakültesi) dışkı örneğini IRB protokolleri ve etik standartlara uygun şekilde topladıkları ve sağladıkları için teşekkür ederiz. Dr. Matthew R. Olm'a (Colorado Üniversitesi, Boulder) dışkı örneği analizlerinde iş birliği için teşekkür ederiz. Bu araştırma, NIH Ortak Fonu (İnsan Virome Programı), Ödül # U01DE034198 tarafından desteklendi. LSH ayrıca ABD Enerji Bakanlığı (DOE), Bilim Ofisi, Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi (BER), Genomik Bilim Programı, DE-SC0023127 ödül numarası (JBE'ye hibe, PI Sydney Glassman) tarafından kısmen desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır Serum Albümini (BSA) DNaz ve Proteaz Içermeyen TozFisher BiyoreaktifleriBP9706100PPBS tarifi için (Adım 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitiQIAGEN47016DNA çıkarma kiti (Adım 4.1)
KAPA DNA HyperPrep kütüphane kitiRocheN/aBu kit tarafından oluşturulan kütüphaneler, Illumina NovaSeq 6000 platformu (2 x 150 bp) kullanılarak sıralanmıştır.
Magnezyum sülfat (MgSO4), susuz ≥ 99.5%Sigma-AldrichM7506PPBS tarifi için (Adım 1.1)
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-freeInvitrogenAM9624PPBS tarifi için (Adım 1.1)
Polietersülfon (PES) membran şırınga filtreleri, steril, 28 mm, 0.2 μ mCorning431229Şırınga filtreleme için (Adım 2.9)
Polipropilen konik santrifüj tüpleri, steril, 50 mLOlympus Plastikleri28-108
Potasyum Sitrat Monohidrat (Kristal/Sertifikalı)Fisher ChemicalP222PPBS tarifi için (Adım 1.1)
Qubit  Analiz TüpleriInvitrogenQ32856DNA niceliği için (Adım 5.1)
Qubit 4 FluorometreInvitrogenQ33238DNA niceliği için (Adım 5.1)
Kubit dsDNA Niceliklendirme Testi KitleriInvitrogenQ32850DNA niceliği için (Adım 5.1)
RQ1 RNaz-Free DNazPromegaPR-M6101Reaksiyon tamponu, DNaz ve stop çözeltisi içerir
Supor hidrofilik polietersülfon (PES) membran şırınga filtreleri, steril, 32 mm, 5.00 ve mikro; m Cytiva (eski adıyla Pall Lab)28150-956Şırınga filtreleme için (Adım 2.9)
Ultrasantrifüj rotoru: Tip 50.2 Ti Sabit Açılı Rotor, 50.000 rpm, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Ayrıca Beckman Coulter Type 70 Ti Sabit Açılı Titanyum Rotorunu (Cat. 337922) kullanıyoruz. 70 Ti kullanıyorsanız 3 saat santrifüj yapın.
Ultrasantrifüj tüpleri: 26.3 mL Kapağı Montajlı Polikarbonat Şişe, 25 x 89mmBeckman Coulter355618Type 50.2 Ti (Cat. 337901) ve Type 70 Ti (Cat. 337922) Beckman Coulter rotorlarıyla uyumlu
Ultrasantrifüj: Beckman Instruments Optima LE-80K Zemin UltrasantrifüjBeckman Coulter365668Ayrıca Beckman Coulter L8-70M Soğutmalı Ultrasantrifüj (Cat. 344196) kullanıyoruz

Kaynaklar

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Viral Metagenomiknsan ViromuD k ViromuDNA EkstraksiyonuUltrasantrif gasyonViral Topluluk KompozisyonuFiltrasyon Y ntemiShotgun MetagenomikVirom Sekanslama
İnsan Dışkısı Örnekleri için DNA Viral Boyut Fraksiyonu Metagenomikleri
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.