Bu protokol, kamuya açık veri edinimi ve Seurat tabanlı kalite kontrolden başlayarak entegrasyon, mekânsal özellik tespiti, hücre tipi dekonvolsiyonu, ilgi bölgesi anotasyonu ve hücre-hücre iletişimi analizine kadar uzanan, şeffaf yürütmeyi destekleyen pratik kontrol noktalarıyla birlikte, mekânsal transkriptomik verilerin analizi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Siyasal Transkriptomik Veri Analizi İçin Pratik Bir İş Akışı: Veri Eldesinden İleri Analizlere
Bu makalede
Özet
Özet
Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitleri içindeki mRNA moleküllerinin iki boyutlu uzamsal bağlamını koruyarak genom genelindeki gen ifadesini profiller ve böylece doku mimarisi ve mikroçevreyle ilişkili biyolojinin incelenmesine olanak tanır. Ancak, veri aktarımı, kalite kontrolü, entegrasyon, dekonvolüsyon, uzamsal istatistikler ve görselleştirme genellikle birden fazla yazılım ortamı ve tekrarlanabilir parametre seçimleri gerektirdiğinden, ST analizi zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Bu protokol, veri edinimi ve yazılım kurulumu ile başlayıp Seurat tabanlı veri yükleme, kalite kontrolü, normalizasyon, çoklu örnek entegrasyonu, kümeleme ve uzamsal olarak değişken gen analizi ile devam eden, R dilinde halka açık ST veri setleri için pratik bir hesaplama iş akışı sunmaktadır. İş akışı daha sonra, referans kılavuzlu SPOTlight analizi ve denetimsiz STdeconvolve konu modellemesini içeren tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejilerini, ardından Giotto tabanlı uzamsal hücre-hücre iletişimi analizini ve özel bir Python Dash uygulaması kullanılarak etkileşimli ilgi alanı (ROI) seçimini uygular. Betik tabanlı yürütmeye, açık parametre gerekçelerine, beklenen çıktılara ve sorun giderme kontrol noktalarına vurgu yapan bu protokol, veri setine ve platforma özgü parametre değerlendirmesinden sonra, standart dizi tabanlı ST veri setleri ve ilgili platformlar için uyarlanabilir bir çerçeve sağlar.
Giriş
Uzamsal transkriptomik (ST), doku kesitlerindeki haberci RNA (mRNA) moleküllerinin uzamsal koordinatlarını korurken genom genelindeki gen ekspresyonunu ölçen dönüştürücü bir teknoloji ailesidir. ST yöntemleri, konum barkodlu diziler kullanan sekanslama tabanlı yaklaşımları ve bozulmamış doku mikroortamlarındaki transkripsiyonel sinyalleri haritalayan in situ görüntüleme yaklaşımlarını içerir1,2. Uzamsal bağlamı koruyarak ST; doku mimarisinin, hücresel komşuluk organizasyonunun, hücre-hücre iletişiminin ve doku disosyasyonundan sonra tam olarak çözümlenemeyen mikroortamla ilişkili biyolojik süreçlerin analizine olanak tanır3.
Kamuya açık ST veri depolarının hızla büyümesi, ikincil analizler ve yöntem geliştirme için benzeri görülmemiş fırsatlar yaratmıştır3. CROST veri tabanı gibi kaynaklar, birden fazla tür ve teknoloji platformunda yüzlerce mekânsal olarak çözünürlemiş transkriptomik veri setini derlerken, STOmicsDB gibi özel koleksiyonlar Stereo-seq gibi belirli metodolojilere odaklanmaktadır4,5. Bu veri bolluğuna rağmen, mekânsal veri yapılarının karmaşıklığı, analitik araçların çeşitliliği ve tekrarlanabilir iş akışlarının uygulanmasındaki teknik engeller nedeniyle hesaplamalı analizler zorlayıcı olmaya devam etmektedir6,7,8,9,10,11.
Tek bir yazılım ortamına güvenmenin getirdiği sınırlamaları gidermek amacıyla, burada tamamlayıcı analitik araçlar kullanan entegre bir hesaplamalı iş akışı sunulmaktadır. Mevcut kapsamlı ST analiz ekosistemleri temel olarak Seurat, Giotto ve Squidpy6,7,12 gibi Python tabanlı çerçeveleri içermektedir. Squidpy gibi Python tabanlı araçlar uzaysal grafik analizi için kapsamlı işlevler sunsa da temel hesaplama hattının tek bir programlama dili ortamında birleştirilmesi, diller arası teknik engelleri en aza indirir. Bu nedenle, diller arası teknik engelleri azaltmak için ana işlem hattı temel olarak R dilinde uygulanmıştır. Tek hücreli ve uzaysal transkriptomik iş akışlarındaki yaygın kullanımını yansıtacak şekilde, bu R tabanlı iş akışında Seurat; veri yükleme, kalite kontrol, normalizasyon, boyut indirgeme, görselleştirme ve çoklu örnek entegrasyonu için kullanılmıştır. Daha sonra, uzaysal ağ kurulumu ve ligand-reseptör tabanlı hücre-hücre iletişimi analizi için Giotto kullanılmıştır. Dolayısıyla bu işlem hattı, iki araç seti arasındaki veri transferini açık ve tekrarlanabilir tutarken, Seurat tabanlı ön işleme ve entegrasyonu Giotto tabanlı uzaysal analizle ilişkilendirmektedir.
Bu çerçeve kapsamında, iki tamamlayıcı dekonvolüsyon stratejisi uygulanmaktadır: hücre tipi oranlarını tahmin etmek için scRNA-seq verilerini kullanan referans kılavuzlu bir yöntem olan SPOTlight ve gizli transkripsiyonel paternleri tanımlayan denetimsiz bir konu modelleme yöntemi olan STdeconvolve8,11. Elde edilen çıktılar, mekânsal hücresel heterojenliğe dair birbirini tamamlayıcı görünümler sunar; ancak kullanıcılar protokolde açıklanan isteğe bağlı uyumluluk analizini gerçekleştirmediği sürece bunlar nicel bir çapraz doğrulama olarak değerlendirilmez. İnteraktif ilgi alanı (ROI) anotasyonu için özel bir Python Dash uygulaması olan Select Spatial Spots entegre edilmiştir ve bu uygulama, sonraki alt analizlerde kullanılabilecek standart koordinat tabanlı anotasyon dosyaları dışa aktarır.
Pratik uygulanabilirlik açısından, bu iş akışı öncelikle standart dizi tabanlı ST verileri (örneğin, 55 µm çözünürlüklü Visium) için tasarlanmıştır ve parametre değerlendirmesinin ardından diğer doku türlerine uyarlanabilir. Analizden önce temel sınırlamalar dikkate alınmalıdır. İlk olarak, referans kılavuzlu dekonvolüsyon modülü, yüksek kaliteli ve dokuyla eşleşen bir scRNA-seq referansına bağlıdır. İkinci olarak, hücre altı veya tek hücreye yakın platformlar, entegrasyon öncesinde modifiye edilmiş ön işleme, mekansal kutucuk agregasyonu veya görüntü tabanlı hücre segmentasyonu gerektirebilir2. Temsili fare kolon veri seti, evrensel platform uyumluluğunun bir kanıtı olarak değil, iş akışının mekansal alanları ve belirteçle tanımlanmış doku organizasyonunu nasıl değerlendirebileceğini göstermek için bir gösterim vakası olarak kullanılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik veri setleri halka açıktır ve yalnızca gösterim amacıyla kullanılmıştır. Belirli veri erişim numaraları ve kaynak depoları ilgili adımlarda belirtilmiştir. Orijinal veri setleri, her bir kaynak çalışma için geçerli olan kurumsal etik yönergelerle uyumlu olarak orijinal araştırmacılar tarafından oluşturulmuştur. Gerekli tüm yazılım ve R-paket versiyonlarını doğrulamak için Materyal Tablosuna bakınız.
Donanım gereksinimleri: Bu iş akışı için gereken hesaplama belleği, analiz edilen örnek ve nokta sayısına bağlı olarak değişir. Tipik bir uzamsal transkriptomik veri seti için (örneğin, üç örneğe kadar örnek başına yaklaşık 3.000 nokta), bor hattını yürütmek için minimum 16 GB RAM'e sahip standart bir iş istasyonu yeterlidir. Bununla birlikte, özellikle SCTransform normalizasyonu ve dekonvolüsyon sırasındaki matris faktörizasyonu gibi bellek yoğun hesaplama adımları sırasında optimal performans ve kararlılığı sağlamak için 32 GB RAM veya daha fazlası şiddetle önerilir.
1. Veri toplama ve dizin yapısının hazırlanması
- Kamuya açık mekansal transkriptomik veri setlerini (örneğin, 26 Mart 2021 gönderim tarihli ve 6 Mart 2022 son güncelleme tarihli GEO erişim numarası GSE169749) ve tek hücreli RNA-seq referans verilerini (örneğin, 19 Nisan 2024 gönderim tarihli ve 10 Aralık 2024 son güncelleme tarihli GEO erişim numarası GSE264408) edinin.
- Ham veri arşivini (örneğin, GSE169749_RAW.tar) depodan indirin ve arşivi ayıklayın.
NOT: Bu protokolde kullanılan temsilci veri seti için, ayıklanan dizin her örnek için birden fazla dosya içerir ve dosya adları genellikle GEO örnek erişim numarasını (örneğin, GSM5213483) kapsar. - Dosyaları, Seurat Load10X_Spatial fonksiyonu ile uyumlu standartlaştırılmış bir dizin yapısında düzenleyin.
- Bir ana veri dizini oluşturun (örneğin, ./data/).
- Her örnek için özel bir alt dizin oluşturun (örneğin, ./data/sample_A1/).
- Her örnek için aşağıdaki temel dosyaları ilgili alt dizine aktarın (kopyalayın veya taşıyın).
- filtered_feature_bc_matrix.h5 dosyasını örneğin ana alt dizinine yerleştirin.
- Her örnek dizini içinde bir spatial/ alt klasörü oluşturun.
- Aşağıdaki dosyaları spatial/ alt klasörüne yerleştirin: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz ve tissue_hires_image.png.gz.
- spatial/ klasöründeki .gz dosyalarını açın. Orijinal dosya adlarının Load10X_Spatial fonksiyonunun gerektirdiği şekilde kalmasını sağlayın (örneğin, tissue_positions_list.csv).
NOT: Sorunsuz yükleme için nihai düzenlenmiş yapı, örnek A1 kullanılarak şu şablonu izlemelidir:
./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png
2. Yazılım ortamının kurulumu
- R'yi (versiyon 4.4.3 veya üzeri) kurun.
- Analiz betiklerini (1_ReadSpatialData.R'den 8_Giotto_Communication.R'ye kadar), GitHub deposundan (tekrar üretilebilirlik için 2d85e18 commit hash'inde https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow adresinden) temin edin.
- setup.R betiğini çalıştırarak CRAN ve Bioconductor üzerinden gerekli R paketlerini kurun.
NOT: Bu iş akışında kullanılan spesifik paket versiyonlarının kapsamlı bir listesi Malzeme Tablosunda sunulmuş olup, aynı zamanda ilgili GitHub deposundaki (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow) session_info.txt dosyasında da mevcuttur. - Resmi dokümantasyonda verilen kurulum komutlarını çalıştırarak Giotto Suite kurulumunu yapın.
- Kurulum betiklerini almak için resmi kurulum URL'sine gidin: https://giottosuite.com/articles/installation.html
- Adım adım talimatlara uygun olarak gerekli Python ortamını ve sistem bağımlılıklarını başlatın.
- Gelişmiş görselleştirme için ek paketleri kurun.
- Şunu çalıştırın: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
- Özel Select Spatial Spots aracını kurun. İşletim sisteminin Windows, macOS veya Linux olduğundan ve Python versiyon 3.8 veya üzerinin kurulu olduğundan emin olun. Bu adım isteğe bağlıdır.
- GitHub deposuna giderek (tekrar üretilebilirlik için d20946e commit hash'inde https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots adresinden) kaynak kodunu indirip aracı temin edin.
- Aracın dizinine gidin ve Python bağımlılıklarını kurun: pip install -r requirements.txt
- SCTransform normalizasyonunu hızlandırmak için BiocManager::install("glmGamPoi") komutunu çalıştırarak glmGamPoi paketini kurun.
NOT: Temel iş akışı yalnızca 2.1–2.3 ve 2.6 adımlarında listelenen paketleri gerektirir. Rfast2 paketi, Moran's I istatistiğinin hesaplamasını hızlandırmak için kullanılır. 2.5 adımındaki isteğe bağlı paketler, prism tarzı bir tema ile yayına hazır grafikler oluşturmak (ggprism) ve renk körlüğü dostu bir palete erişmek (colorBlindness) içindir. 2.6 adımındaki araç, etkileşimli spot seçme işlevselliğini sağlar. sessionInfo() komutunu çalıştırın ve tüm konsol çıktısını bir metin dosyasına kaydedin. Bu işlem, uzun vadeli tekrar üretilebilirliği sağlamak için kritik olan kesin yazılım versiyonlarını ve paket bağımlılıklarını belgeler.
3. Mekansal verilerin yüklenmesi ve kalite kontrolü (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)
- Uzamsal verileri Seurat nesnelerine aktarın.
- image.dir ve image.name değerlerini belirterek, yüksek çözünürlüklü doku görüntüsünü manuel olarak yüklemek için Read10X_Image fonksiyonunu kullanın.
- Seurat nesnesini oluşturmak için image parametresini adım 3.1.1'de oluşturulan görüntü nesnesine ayarlayarak Load10X_Spatial fonksiyonunu kullanın.
- Kalite kontrol metriklerini hesaplayın.
- ^mt- deseni ile PercentageFeatureSet kullanarak mitokondriyal okuma yüzdesini hesaplayın.
- Verileri QC metriklerine göre görselleştirin ve yorumlayın.
- VlnPlot kullanarak nCount_Spatial, nFeature_Spatial ve percent.mt
- Doku alanı dışındaki spotları belirlemek için SpatialFeaturePlot kullanarak bu metriklerin uzamsal özellik grafiklerini oluşturun.
NOT: Görsel kontrol noktası: Doku alanı dışındaki spotlar genellikle düşük UMI sayıları (nCount_Spatial < 500) ve düşük gen tespiti (nFeature_Spatial < 200) sergiler. - Gösterim amaçlı olarak, düşük kaliteli spotları kaldırmak için filtreler uygulayın (örneğin, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Bu isteğe bağlı bir adımdır.
NOT: Uzamsal transkriptomikte QC'nin temel amacı, doku dışındaki spotlar gibi teknik artefaktları belirlemek ve işaretlemektir. Gösterim için kullanılan Visium kolon verilerinde, nFeature_Spatial > 200 ve nCount_Spatial > 500 değerleri düşük kompleksiteli/arka plan spotlarını temizler. Düşük RNA içeriğine sahip veya degrade olmuş kesitli dokularda, eşikleri yükseltmeden önce keman ve uzamsal özellik grafiklerini inceleyin; yoğun veya yüksek UMI'li dokular için daha katı eşikler uygun olabilir. Dubletler, doku katlanmaları veya belirgin artefaktlar görülmedikçe yalnızca yüksek ekspresyon değerlerine göre filtreleme yapmaktan kaçının. Filtreleme, uzamsal konumları fiziksel olarak kaldırdığı ve bu durumun sonraki uzamsal analizler için doku yapısının sürekliliğini bozabileceği nedeniyle genellikle önerilmez.
4. Veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme (3_IntegrationAndClustering.R)
- Bireysel örnekleri normalize edin ve ön işlemeden geçirin.
- SCTransform normalizasyonunu, assay = parametresini kullanarak her bir örneğe ayrı ayrı uygulayın. Konumsal.
- Birden fazla örneği entegre edin.
- Entegrasyon için SCT-normalleştirilmiş nesne listesini hazırlayın. Her bir nesnenin şunlara sahip olduğundan emin olun: "RNA" ...kopyalayarak analiz edin "Uzamsal" analiz: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Uzamsal"]]
NOT: Kopyalama işlemi "Mekansal" bir standarda karşı analiz/test/deneyle karşılaştırma "RNA" analiz yuvası, başlangıçta tek hücreli Seurat nesneleri için tasarlanmış olan alt akış entegrasyon fonksiyonlarıyla uyumluluğu sağlamak için gerekli bir geçici çözüm işlevi görmektedir. - Kullanım Entegrasyon Özelliklerini Seçin ve PrepSCTIntegration ortak değişken özellikleri belirlemek için.
- şunları kullanarak entegrasyon çapaları bulun: Entegrasyon Çapaları Bulma ile normalizasyon.yöntemi = "SCT".
- IntegrateData ile verileri şu şekilde entegre edin: normalizasyon.yöntemi = "SCT".
- Entegrasyon için SCT-normalleştirilmiş nesne listesini hazırlayın. Her bir nesnenin şunlara sahip olduğundan emin olun: "RNA" ...kopyalayarak analiz edin "Uzamsal" analiz: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Uzamsal"]]
- Entegre analiz üzerinde boyut indirgeme ve kümeleme işlemlerini gerçekleştirin.
- Entegre edilmiş veriler üzerinde şu yöntemi kullanarak PCA gerçekleştirin: PCA'yı Çalıştır.
- Kümülatif açıklanan varyansı hesaplayarak, sonraki analizler için optimal temel bileşen (PC) sayısını belirleyin. Şuradaki kodu kullanarak, dirsek noktasını programatik olarak (örneğin, kümülatif varyansın %90'ı aştığı ve marjinal kazancın %0,1'in altına düştüğü nokta) tespit edin. 3_EntegrasyonVeKümeleme.R, satırlar 36-38Elde edilen temel bileşen (PC) sayısı bundan sonra şu şekilde adlandırılacaktır: pc.use.
- RunUMAP'ı şununla çalıştırın: boyutlar = 1:pc.use.
- Hücreleri şunları kullanarak kümeleyin: KomşularıBul ile dims = 1:pc.use ve FindClusters ile çözünürlük = 0,5Çözünürlüğü yalnızca küme kararlılığı ve belirteç gen tutarlılığı incelendikten sonra ayarlayın.
- Hedef gruplar arasında (örneğin, "B1_kolon_d14" karşı "A1_kolon_g0") kullanarak Markerleri Belirleme işlev
NOT: Görsel kontrol noktası: Başarılı bir entegrasyon, biyolojik olarak farklı kümeler korunurken UMAP grafiğinde örneklerin uygun şekilde karıştığını gösterecektir.
- Mekansal olarak değişken genleri belirleyin.
- Her bir orijinal örnek için çalıştırın MekansalOlarakDeğişkenÖzellikleriBul kullanarak "moransi" yöntemi üzerine "SCT" uzamsal otokorelasyonu hesaplamak için analiz.
5. Tek hücreli referans veri ön işlemesi (4_scDataPreProcessing.R)
- Read10X kullanarak tek hücreli RNA-seq sayım matrisini okuyun ve bir Seurat nesnesi oluşturun.
- Standart kalite kontrol (QC), normalizasyon ve kümeleme işlemlerini gerçekleştirin.
- Mitokondriyal okuma yüzdesini (percent.mt) hesaplayın ve hücreleri filtreleyin (örneğin, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
- vars.to.regress = "percent.mt" parametresini ayarlayarak verileri SCTransform ile normalize edin.
- PCA ve UMAP analizlerini çalıştırın ve hücreleri adım 4.3.2'de açıklanan dinamik PC seçim yöntemini kullanarak kümeleyin.
- Hücre tiplerini açıklayın (annote edin).
- AddModuleScore kullanarak kanonik hücre tipi belirteç genleri için modül skorlarını hesaplayın.
- Kümeleri modül skorlarına ve bilinen biyolojik verilere dayanarak açıklayın. Alternatif olarak, önceden hesaplanmış açıklamaları metadata'dan içe aktarın.
6. SPOTlight ile Referans Rehberli Dekonvolüsyon (5_SPOTlight_Deconv.R)
- SPOTlight için verileri hazırlayın.
- Açıklamalı tek hücreli Seurat nesnesini ve mekansal Seurat nesnesini SingleCellExperiment nesnelerine dönüştürün.
- Tek hücreli verileri logNormCounts kullanarak log-normalize edin.
- SPOTlight dekonvolüsyonunu çalıştırın.
- modelGeneVar ve getTopHVGs kullanarak tek hücreli veriler üzerindeki hipervariable genleri (HVG'ler) belirleyin.
- scoreMarkers kullanarak hücre tipi marker genlerini hesaplayın ve yüksek kaliteli markerlar için filtreleme yapın (örneğin, mean.AUC > 0.8).
- Hesaplama süresini azaltmak için her hücre tipi için tek hücreli referansı yönetilebilir bir sayıya (örneğin, 50 hücre) indirgeyin (downsample).
- weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" ve gene_id = "gene" parametreleri ile SPOTlight fonksiyonunu kullanarak dekonvolüsyonu gerçekleştirin.
- Sonuçları görselleştirin ve dışa aktarın.
- Dekonvolüsyon sonuç matrisini (spot başına hücre tipi oranları) çıkarın.
- Hücresel kompozisyonu mekansal koordinatlarda görselleştirmek için plotSpatialScatterpie kullanın.
- AddMetaData kullanarak dekonvolüsyon sonuçlarını mekansal Seurat nesnesinin metadata kısmına ekleyin. Beklenen çıktı: her bir mekansal spot için hücre tipi oranı sütunlarını içeren bir dekonvolüsyon matrisi, yerel hücresel kompozisyonu gösteren mekansal scatterpie grafikleri ve dekonvolüsyon oranlarını metadata olarak içeren bir Seurat nesnesi.
7. STdeconvolve ile Referanssız Dekonvolüsyon (7_STdeconvolve.R)
- Uzamsal verileri hazırlayın.
- Uzamsal Seurat nesnesinden ham sayım matrisini slot = "counts" ile GetAssayData kullanarak çıkarın.
- STdeconvolve içindeki cleanCounts fonksiyonunu kullanarak düşük kaliteli spotları ve genleri kaldırın (örneğin, min.lib.size = 100).
- Gizli hücre tiplerini belirleyin.
- Minimum spot fraksiyonunda eksprese edilen genler için korpusu restrictCorpus kullanarak daha fazla filtreleyin (örneğin, removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
- fitLDA kullanarak bir dizi potansiyel konu sayısı (K) üzerinden (örneğin, Ks = seq(2, 9, by = 1)) bir Gizli Dirichlet Tahsisi (LDA) modeli uydurun.
- opt = "min" ile optimalModel kullanarak minimum perplexity'ye dayalı optimal modeli seçin.
- Sonuçları analiz edin ve görselleştirin.
- Optimal modelden hücre tipi (konu) oranlarını (theta) ve gen profillerini (beta) getBetaTheta kullanarak çıkarın.
- Dekonvolüye edilmiş konuların biyolojik yorumuna yardımcı olmak için, "Select Spatial Spots" aracı tarafından oluşturulan ilgi alanı (ROI) anotasyonlarını içe aktarın (bkz. adım 9.3.3). Dekonvolüye edilmiş hücre tipi oranlarını tekrar uzamsal koordinatlar üzerine yansıtmak ve spotları ROI'lerine göre renk kodlamak için bu anotasyonları vizAllTopics fonksiyonunda groups parametresi olarak kullanın. Bu isteğe bağlı bir adımdır.
NOT: Beklenen çıktı: STdeconvolve, spot başına konu oranlarını temsil eden theta değerlerini ve her konu için gen profillerini temsil eden beta değerlerini döndürmelidir. Kullanıcılar, gözetimsiz STdeconvolve sonuçlarını referans kılavuzlu SPOTlight çıktılarıyla (Adım 6'dan) nicel olarak karşılaştırmak isterlerse, her iki oran matrisini de (STdeconvolve'dan theta ve SPOTlight matrisi) dışa aktarabilir ve standart R fonksiyonlarını kullanarak spot başına korelasyon veya uyum metriklerini (örneğin, Pearson veya Spearman korelasyonu) hesaplayabilirler. SPOTlight ve STdeconvolve arasındaki nicel karşılaştırma isteğe bağlıdır ve temel iş akışının yürütülmesi için gerekli değildir; ancak, böyle bir analiz yapmak isteyen kullanıcılar için ilgili çıktı matrisleri Adım 6.3.1 ve 7.3.1'de mevcuttur.
8. Giotto kullanarak mekansal hücre-hücre iletişimi(8_Giotto_Communication.R)
- Seurat nesnesini bir Giotto nesnesine dönüştürün.
- Ham sayım matrisini ve uzaysal koordinatları sağlayarak createGiottoObject fonksiyonunu kullanın.
- Giotto nesnesini ön işlemeden geçirin ve dekonvolüsyon sonuçlarını ekleyin.
- normalizeGiotto kullanarak verileri normalize edin.
- addCellMetadata kullanarak hücre tipi anotasyonlarını (örneğin, SPOTlight dekonvolüsyonundan elde edilen ana hücre tipi) hücre meta verilerine ekleyin.
- Uzaysal bilgiye dayalı hücre-hücre iletişimini çıkarın.
- method = "Delaunay" ve name = "Delaunay_network" parametreleri ile createSpatialNetwork kullanarak bir uzaysal ağ oluşturun.
- R ortamına bir ligand-reseptör veri tabanı yükleyin. Yüklenen nesnenin, ligand ve reseptör gen sembollerini temsil eden iki ayrı sütuna sahip bir veri çerçevesi (data frame) şeklinde biçimlendirildiğinden emin olun (örneğin, Zenodo'dan önceden derlenmiş bir fare ağı: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versiyon v6, 7 Nisan 2025 tarihinde yayınlanmıştır).
- Uzaysal yakınlıkta bulunan hücre tipleri arasındaki anlamlı ligand-reseptör etkileşimlerini belirlemek için cluster_column = "celltype_major" parametresiyle exprCellCellcom fonksiyonunu çalıştırın. Beklenen çıktı: ligand-reseptör çiftlerini, kaynak ve hedef hücre tipi kombinasyonlarını, log2 kat değişim (fold-change) değerlerini ve düzeltilmiş P değerlerini içeren bir sonuç tablosudur; görselleştirme için anlamlı etkileşimleri (örneğin, p.adj < 0.05) saklayın.
9. select spatial spots ile interaktif nokta seçimi (6_SelectSpatialSpots.R)
- İnteraktif araç için verileri hazırlayın.
- GetTissueCoordinates kullanarak Seurat nesnesinden uzaysal koordinatları çıkarın.
- Verileri formatlayın ve dışa aktarın.
- Koordinat veri çerçevesini (data frame), tam olarak şu sütun başlıklarını içerecek şekilde formatlayın: CELL_ID, X ve Y.
- Formatlanmış veri çerçevesini bir CSV dosyasına aktarın.
- İlgi alanı (ROI) analizini gerçekleştirin.
- Özel Select Spatial Spots Dash uygulamasını başlatın ve CSV dosyasını yükleyin.
- Uzaysal konuma göre noktaları interaktif olarak seçin.
- Seçilen noktaların listesini ve atanan grup/ROI etiketlerini yeni bir CSV dosyası olarak dışa aktarın. Beklenen çıktı: nokta tanımlayıcıları, X/Y koordinatları ve CELL_ID aracılığıyla Seurat nesnesiyle tekrar eşleştirilebilecek atanmış grup/ROI etiketlerini içeren bir CSV dosyasıdır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İş akışının uygulanması ve veri entegrasyonu, temel doku özelliklerini örneklendirmektedir
Hesaplama iş akışı, analitik aşamalar boyunca beklenen çıktıları örneklendirmek için fare kolon mekansal transkriptomik verilerine uygulanmıştır. İş akışı şemasında (Şekil 1) gösterildiği gibi, boru hattı, mekansal özellik grafiklerinin doku sınırlarını belirlediği veri edinimi ve kalite kontrolü ile başlamıştır (Şekil 2A
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, analitik derinlik ile pratik erişilebilirliği dengeleyen, mekansal transkriptomik veri analizi için kapsamlı bir hesaplamalı iş akışı sunmaktadır. Adım adım ilerleyen bu yaklaşım, kritik karar noktalarını ve olası pitfalls'leri vurgularken, araştırmacıya başlangıç veri ediniminden gelişmiş mekansal analizlere kadar tüm analitik hatt boyunca rehberlik eder.
Protokoldeki birkaç adım, sonraki sonuçlar üzerindeki etkileri nedeniyle özel dikkat gerektirmektedir. Kalite kontrol ve filtr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, herhangi bir rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Yazarlar, destekleri ve dokümantasyonları için Seurat, Giotto ve SPOTlight paketlerinin geliştiricilerine ve yöneticilerine teşekkür ederler. Kamu veri depolarının katkıları ve veri setlerini cömertçe paylaşan araştırmacılar da minnetle anılmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ggplot2 | Posit Software, PBC | v4.0.0(CRAN) | Gelişmiş veri görselleştirme |
| Giotto | Dries Lab | v4.2.2 (GitHub) | Uzamsal ağ ve hücre-hücre iletişimi analizi |
| patchwork | Thomas Lin Pedersen | v1.3.2 (CRAN) | Grafik kompozisyonu ve düzenleme |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.4.3 | Çekirdek yürütme ortamı (macOS aarch64) |
| scater | Davis McCarthy et al. | v1.34.1 (Bioconductor) | Tek hücreli kalite kontrolü ve görselleştirme |
| scran | Aaron Lun et al. | v1.34.0 (Bioconductor) | Tek hücreli varyans modelleme ve belirteç tespiti |
| Select Spatial Spots (Özel Python Aracı) | LeafLight | v1.0.0 (GitHub) | Etkileşimli uzamsal ilgi alanı (ROI) seçimi (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots) |
| Seurat | Satija Lab | v5.3.0 (CRAN) | Uzamsal veri ön işleme, entegrasyon ve kümeleme |
| SeuratObject | Satija Lab | v5.2.0 (CRAN) | Tek hücreli ve uzamsal veriler için veri yapıları |
| SingleCellExperiment | Bioconductor Core Team | v1.28.1 (Bioconductor) | scRNA-seq için standartlaştırılmış veri konteyneri |
| SPOTlight | Marc Elosua-Bayes et al. | v1.10.0 (Bioconductor) | Referans kılavuzlu uzamsal dekonvolüsyon |
| Stdeconvolve | Jean Fan Lab | v1.3.2 (Bioconductor) | Denetimsiz gizli konu modelleme |
| tidyverse | Posit Software, PBC | v2.0.0 (CRAN) | Çekirdek veri manipülasyonu ve biçimlendirme paketi |
Kaynaklar
- Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
- Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
- Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
- Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
- Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
- Chen JG, Chávez-Fuentes JC, O’Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w
- Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.
- Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.
- McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.
- Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2
- Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.
- Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.
- Luecken MD, Büttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.
- Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.
- Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.
- Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.
- Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell–cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.
- Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell–cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.
- Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.
- Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.
- Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.
- Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
