$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Tongji Tıp Fakültesi, Liyuan Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır [Onay No.: 2026IEC(RYJ016)]. Tüm hastalar bilgilendirilmiş rıza sundu ve klinik örneklerin toplanması ve kullanımı Helsinki Bildirgesi'nin ilgili etik yönergelerine uygun oldu. Bu çalışmada kullanılan başlıca deneysel materyaller ve aletler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
Klinik doku örneklerinin toplanması ve CDCP1 ekspresyonunun tespiti
Ocak 2019 ile Aralık 2019 arasında hastanemizde nazofarengeal karsinom teşhisi konan yedi hastadan cerrahi doku örnekleri alındı. Aynı zamanda, rinitli altı hastadan burun dokusu örnekleri kontrol olarak alındı. Tüm doku örnekleri toplandıktan sonra hemen sıvı azotta donduruldu ve ardından RNA çıkarımı yapıldı.
RNA çıkarımı ve gerçek zamanlı nicel PCR tespiti
Üreticinin talimatlarına göre doku örneklerinden toplam RNA çıkarıldı. Her örnek için, 50–100 mg doku, 1 mL ekstraksiyon reaktifi, doku homojenizatörü kullanılarak buz üzerinde işlendi. Homojenizasyon 30 saniye boyunca gerçekleştirildi ve dokunun tamamen bozulmasını sağlamak için 3 kez tekrarlandı. Doku bozulmasından sonra, her lizat 200 μL kloroform aldı. Tüpler 15 saniye girdabla sertçe sallandı, oda sıcaklığında 3 dakika tutuldu ve ardından 12.000 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca dönerek fazlaları ayırdı. Şeffaf sulu tabaka, ara fazı bozulmadan çıkarıldı ve yeni bir tüpe aktarıldı.
RNA, bu sulu fraksiyondan izopropanol eklenerek 1:1 hacim oranında elde edilmiştir. Oda sıcaklığında 10 dakikalık kuluçkadan sonra, örnekler 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenerek RNA pellet edildi. Süpernatant atıldı ve pellet bir kez 1 mL %75 etanol ile durulandı. 7.500 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika süren ikinci santrifüj aşamasından sonra etanol yıkaması çıkarıldı. RNA peleti daha sonra oda sıcaklığında 5–10 dakika hava kurutuldu ve 20 μL RNase içermeyen suya yeniden süzüldü. RNA miktarı ve saflığı spektrofotometrik olarak belirlendi.
cDNA hazırlığı için, ters transkripsiyon için toplam RNA'nın 1 μg olduğu için kullanıldı. Reaksiyon 37 °C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi ve ardından 5 saniye 85 °C'ye kadar ısıtıldı. Daha sonra nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR), gerçek zamanlı PCR sistemi üzerinde TB Green Premix Ex Taq II ile gerçekleştirildi. Her 20 μL reaksiyonda 2 μL cDNA şablonu, her biri 0,4 μmol/L oranında ileri ve geri primerler, 10 μL SYBR Green premix ve nukleazsız su içeriyordu. Amplifikasyon protokolü, 95 °C'de 30 saniye boyunca denatürasyon ile başladı. Bunu 40 döngü takip etti; her döngü 5 saniye için 95 °C ve tavlama/uzatma için 30 saniye 60 °C oldu. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.
CDCP1 protein ekspresyonunun immünohistokimyasal tespiti
Doku örnekleri önce %4 paraformaldehit ile 24 saat sabitlendi, ardından standart dehidrasyon, parafin gömülmesi ve 4 μm kalınlığında kesitler hazırlandı. Parafin bölümleri daha sonra ksilen ile işlenerek parafin çıkarıldı ve sıralı olarak derecelendirilmiş etanol çözeltileriyle yeniden hidratlandırıldı. Antijenin açılması için, slaytlar sitrat tamponuna (pH 6.0) yerleştirilir ve çözelti kaynadıktan sonra 3 dakika boyunca bir düdüklü tencerede ısıtılır. Endojen peroksidaz aktivitesi, bölümlerin %3 hidrojen peroksite maruz bırakılmasıyla 10 dakika boyunca söndürüldü.
Endojen enzim aktivitesi bloke edildikten sonra, bölümler gece boyunca 4 °C'de inkubasyon edildi ve anti-CDCP1 birincil antikor 1:200'de seyreltildi. Ertesi gün, slaytlar oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikor ile işlendi. Sinyal görselleştirmesi bir DAB substrat kiti kullanılarak gerçekleştirildi ve bölümler daha sonra hematoksilin ile karşı boyandı. Son olarak, slaytlar kurutuldu, monte edildi ve optik mikroskop altında incelendi.
Hücre kültürü ve gruplanması
CNE2 ve HK1 insan nazofarengeal karsinom hücreleri, %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin takviyesi ile takviye edilmiş yüksek glikozlu DMEM'de tutuldu. Hücreler, %5 CO₂ içeren bir kuluçka makinesinde 37 °C'de kültürlendi. Hücreler %70–%80 birleşime ulaştığında, aşağıdaki gruplara göre transfekte edildiler: Kontrol grubu (Kontrol): boş vektör veya negatif kontrol siRNA ile transfekte edildi; CDCP1 aşırı ekspresyon grubu (CDCP1-OE): CDCP1 aşırı ekspresyon plazmidi ile transfekte edilir; CDCP1 susturma grubu (si-CDCP1): CDCP1 siRNA ile transfeksiyon edilir; Kurtarma deney grubu (CDCP1-OE + U0126): CDCP1 temelinde 48 saat boyunca ERK1/2-spesifik inhibitör U0126 (10 μmol/L) ile tedavi edildi. Aşırı ekspresyon.
Transfeksiyon, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Hücreler, transfeksiyondan 24 saat önce, 2 × 105 hücre aralığında 6 kuyu levhalarında kaplandı; her kuyu 2 mL antibiyotiksiz ortam içeriyordu. Transfeksiyon, kültürler yaklaşık %70 birleşimine ulaştığında başlatıldı. Kültür ortamı daha sonra çıkarıldı ve yerine taze, serumsuz ortam getirildi. Her kuyu için, 5 μL transfeksiyon reaktifinden ayrı ayrı olarak 2 μg plazmid DNA veya 100 pmol siRNA hazırlandı ve her bileşen 250 μL indirgenişlemiş serum içeren ortamda seyreltildi. Her iki karışım da oda sıcaklığında 5 dakika bekletildi. Sulandırılmış nükleik asit ve transfeksiyon reaktifi daha sonra birleştirilip oda sıcaklığında 20 dakika bekletilerek transfeksiyon kompleksleri oluşturuldu. Bu kompleksler hücrelere damla olarak eklendi, kuyu boyunca nazikçe dağıtıldı ve hücrelerle birlikte 6 saat kuluçka edildi. Kuluçka dönemi tamamlandıktan sonra, transfeksiyon karışımı çıkarıldı ve hücrelere %10 FBS içeren tam ortam verildi.
Hücre proliferasyon testi
Transfeksiyondan 48 saat sonra, her gruptan CNE2 ve HK1 hücreleri toplanıp 96 kuyu plakalarında, 3 × 103 hücre yoğunluğunda, her kuyu başına 100 μL ortam ile tohumlanmış, her grup başına beş çoğaltılmış kuyu. Hücreler 24, 48 veya 72 saat kültürlendikten sonra, her kuyuya 5 mg/mL ile 10 μL MTT çözeltisi eklendi. Plakalar daha sonra %5 CO₂ ile 37 °C'de tekrar 4 saat boyunca kuluçka edildi. Bu kuluçkadan sonra, kültür süpernatantı dikkatlice atıldı ve formazan kristallerinin çözülmesi için her kuyuya 100 μL dimetil sülfoksit (DMSO) eklendi. Plakalar tam çözülmesini sağlamak için 10 dakika boyunca çalkalandı. Soğukkans, daha sonra 570 nm'de bir mikroplaka okuyucu ile kaydedildi ve 630 nm referans dalga boyu olarak kullanıldı.
Apoptoz aktivite testi
Transfeksiyondan 48 saat sonra, her gruptan CNE2 hücreleri toplandı ve üreticinin talimatlarına göre Caspase-3 Aktivite Analiz Kiti kullanılarak Caspase-3 aktivitesi tespit edildi. Toplam 100 μL liz tamponu 1 × 106 hücreye eklendi, buzda 15 dakika lizlendi ve ardından 12.000 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi. Ortaya çıkan süpernatant, sonraki analiz için transfer edildi. Caspase-3 testi için, her kuyu 50 μL reaksiyon tamponu ve 5 μL Caspase-3 substratı (DEVD-pNA) aldı. Plaka daha sonra 2 saat boyunca 37 °C'de tutuldu ve mikroplaka okuyucu ile soğurma 405 nm olarak ölçüldü.
Western Blot analizi
Transfeksiyondan 48 saat sonra, her deneysel gruptan CNE2 ve HK1 hücreleri protein ekstraksiyonu için toplandı. Hücreler, proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponunda bozuldu ve 30 dakika buzda tutuldu. Ortaya çıkan lizatlar 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlenmiş, ardından süpernatan fraksiyonları toplanmıştır. Protein konsantrasyonu, BCA protein test kiti ile ölçüldü.
Western blot analizi için, her örnekten toplam 30 μg protein 5x yükleme tamponu ile karıştırıldı ve proteinler denatüre edilmek için 100 °C'de 10 dakika ısıtıldı. Örnekler, %10 SDS-PAGE jellerinde 120 V'da 90 dakika boyunca ayrıldı, ardından PVDF membranlarına 300 mA sabit akımda 90 dakika aktarıldı. Transferden sonra, membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız sütle tıkandı.
Zarlar, CDCP1 (1:1.000), E-cadherin (1:1.000), Vimentin (1:1.000), p-ERK1/2 (1:2.000), ERK1/2 (1:1.000) ve GAPDH (1:5.000) karşısında primer antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka altına alındı.
Ertesi gün, zarlar TBST'de 3 kez durulandı ve her yıkama 10 dakika sürdü. Daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş ikincil antikorlara maruz kaldılar. Üç ek TBST yıkamasından sonra, protein sinyalleri ECL kemilyüminsans substratı kullanılarak görselleştirildi. Bant yoğunluğu ImageJ yazılımıyla ölçüldü ve GAPDH normalizasyon kontrolü olarak kullanıldı.
İstatistiksel analiz
Tüm deneyler 3 kez bağımsız olarak gerçekleştirildi. Sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Birden fazla grup arasındaki farklar, tek yönlü varyans analiziyle (ANOVA) değerlendirildi ve Tukey'nin yöntemi çift olarak sonradan karşılaştırmalar için kullanıldı. < P-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.