Parkinson Hastalığı Hastalarının Bağırsak Mikrobiyotası Üzerindeki Piribedil'in Etkisi

Özet

Bu çalışma, sağlıklı kontrol grupları, tedavi edilmeyen PD hastaları ve piribedil tedavi edilen PD hastaları arasında bağırsak mikrobiyotasını karşılaştırmak için 16S rRNA dizileme kullandı ve piribedil tedavisiyle ilişkili mikrobiyal bileşim farklılıklarını tespit etti.

Özet

Bu çalışma, piribedil tedavisinin Parkinson hastalığı (PD) hastalarının bağırsak mikrobiyotasını değiştirip değiştirmediğini belirlemeyi amaçladı ve piribedil tarafından indüklenen bağırsak mikrobiyotası değişikliklerini ve bunların potansiyel klinik sonuçlarını anlamak için teorik bir referans sağladı. Dışkı örnekleri 16S ribozomal RNA (16S rRNA) gen dizilemesi kullanılarak analiz edildi. Piribedil alan PD'li hastalar (piribedil grubu), piribedil almayan PD hastalar (PD grubu) ve sağlıklı kontrol grupları (boş grup) arasında karşılaştırmalar yapıldı. Boş grupla karşılaştırıldığında, Staphylococcus, Rhodococcus ve diğer cinslerin göreceli bolluğu PD grubunda daha yüksekken, Achromobacter ve Delftia'nın göreli bolluğu daha düşüktü. Ayrıca, piribedil grubunda Achromobacter, Delftia ve Stenotrophomonas'ın göreceli bolluğu PD grubuna göre daha yüksekken, Staphylococcus, Rhodococcus ve diğer türlerin göreceli bolluğu daha düşüktü. Sağlıklı bireylere kıyasla PD'li hastaların bağırsak mikrobiyotasında önemli değişiklikler görüldü. Piribedil kullanan hastaların bağırsak mikrobiyotası, tedavi edilmemiş hastalardan anlamlı şekilde farklıdır. Bu sonuçlar, PD hastalarında piribedil ile değişmiş bağırsak mikrobiyotası arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir.

Giriş

Parkinson hastalığı (PD) görülürlüğü giderek artmaktadır; ancak etiyolojisi ve patogenezi henüz tam olarak netleşmemiştir. Daha fazla çalışma, bağırsak mikrobiyotasının PD'nin başlangıcı ve gelişimiyle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir. O ve ^ark.1, PD'li hastalarda bağırsak mikrobiyotası bileşiminin sağlıklı insanlardan farklı olduğunu ve bağırsak patojenlerinde artışın PD'nin başlangıcıyla ilişkili olabileceğini belgelemiştir. Scheperans ve ^ark.2, PD'li hastaların bağırsaklarındaki Prevotella ve Bacteroides'in göreceli bolluğunun azaldığını doğrulamıştır. ve bu bakteri cinslerinin bağırsak bariyer fonksiyonuyla güçlü şekilde ilişkili olduğunu belirtir.

Bağırsak mikrobiyotası ile PD arasındaki bağlantıyı araştıran çeşitli çalışmalar, disbiyozun PD'nin patofizyolojisinde kritik bir rol oynayabileceğini, iltihap ve metabolik bozukluklar dahil olmak üzere motor ve motor olmayan semptomları^{etkileyebileceğini göstermektedir 3}. Ayrıca, PD için ilaç tedavilerinin bağırsak^{mikrobiyomu 4,5'in} bileşimini değiştirdiği gösterilmiştir; bu da ilaçlar ile bağırsak mikrobiyomu arasındaki karmaşık etkileşimi vurgulamaktadır.

Seçici olmayan bir dopamin reseptör agonisti olarak piribedil, PD'nin yönetiminde çok önemlidir; Dopamin reseptörlerini uyararak hastalarda motor semptomları^{iyileştirebilir 6}. Ancak, klinik kullanımı genellikle yan reaksiyonlarla, özellikle mide bulantısı, kusması ve karın rahatsızlığı gibi gastrointestinal^{semptomlarla sınırlıdır 7}. Bu yan etkilerin temel mekanizması belirsizdir ve piribedil tarafından indüklenen bağırsak mikrobiyotasında değişikliklerle ilişkili olup olmadığı hâlâ bilinmemektedir.

Bağırsak mikrobiyotası ile yan ilaç reaksiyonları arasındaki bağlantı son yıllarda artan ilgi çekti. Hill-Burns ve ^ark.8, PD hastalarında bağırsak mikrobiyotasını analiz etti ve bağırsak mikrobiyotası çeşitliliğinin ilaç tedavisine yanıt ile ilişkili olduğunu buldu. Ayrıca, dopamin agonistleri bağırsak hareketliliğini ve mikrobiyal bileşimi etkileyebilir⁹. Bu değişikliklerin arkasındaki mekanizmaların, bağırsak taşınım zamanlamasında değişiklikler olduğu düşünülüyor; bu da mikrobiyal çeşitliliği ve bolluğu etkilemektedir. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotası ilaç emilimini ve metabolizmasını^{etkileyebilir,} böylece bu ilaçların etkinliği ve yan etkilerini etkiler. Ancak, Parkinson hastalığı için yaygın kullanılan bir ajan olan piribedilin bağırsak mikrobiyota yapısını modüle edip etmediğine ve bu tür mikrobiyal değişimler ile gastrointestinal yan reaksiyonlar arasındaki ilişkiye dair hâlâ sistematik araştırmalar eksiklik vardır.

Mevcut çalışmada, sağlıklı kontrol kontrol grupları, tedavi edilmemiş PD hastaları ve piribedil ile tedavi edilen PD hastaları arasında bağırsak mikrobiyota yapısını karşılaştırdık. Piribedil tedavisinin, PD hastalarında bağırsak mikrobiyota bileşiminde belirgin değişikliklerle ilişkili olduğunu ve bu mikrobiyal değişikliklerin piribedil ile ilişkili gastrointestinal yan etkilerle bağlantılı olabileceğini öne sürdük. Piribedil ile ilişkili spesifik mikrobiyal değişiklikleri belirlemeyi ve bunların gastrointestinal yan etkilerle potansiyel ilişkisini araştırmayı, böylece piribedil ile ilişkili yan reaksiyonların mekanizmasını anlamak için teorik bir temel sağlamayı amaçladık.

Bağırsak mikrobiyotası, PD^11'in patogenezi üzerine araştırmalar için önemli bir yöndür. PD hastalarında piribedilin bağırsak mikrobiyotası üzerindeki etkilerini gözlemleyerek, bu çalışma ilaçla ilişkili bağırsak mikrobiyotası değişikliklerinin klinik önemini netleştirmeye yardımcı olur ve piribedilin klinik kullanımı ve güvenlik yönetiminin optimize edilmesi için bir referans sağlar.

Protokol

Bu çalışma, Anhui Çin Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından incelenmiştir (Etik inceleme numarası: 2025AH-101, Etik onay tarihi: 2025-07-02).

Araştırma konuları

Anhui Çin Tıbbı Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi'nde yaşayan PD ve sağlıklı kontrol hastaları kayıt altına alındı. Takip analizi için taze dışkı örnekleri alındı. Taze dışkı örnekleri toplandı, steril EP tüplerine alındı, hemen sıvı azotta donduruldu ve uzun vadeli koruma için −80 °C'de saklandı. PD'li hastaların dahil etme kriterleri şöyleydi: (1) klinik olarak teşhis edilmiş PD; (2) >70 yaş; (3) Piribedil grubu için: kayıttan sonra piribedil monoterapisine başlamış ve bu ilaca önceden maruz kalmamıştı; PD grubu için: Parkinson karşıtı ilaçlarla tedavi edilmemek; (4) ciddi kalp hastalığı, karaciğer hastalığı, böbrek hastalığı veya kanser gibi başka ciddi sistemik hastalıklar yok. Kayıttan önce, her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Dışlama kriterleri şunlardı: (1) PD'nin ciddi komplikasyonları, örneğin ciddi motor disfonksiyon bozuklukları; (2) yakın zamanda antibiyotik tedavisi aldılar; (3) çalışma sonuçlarını etkileyebilecek diğer sağlık durumlarının varlığı, örneğin inflamatuar bağırsak hastalığı, irritabl bağırsak sendromu vb.; (4) piribedil'e alerjik. Sağlıklı kontrol denekleri (Blank grubu) yaş uyumlu bireylerdi (yaş >70 yaşında) ve nörolojik veya büyük gastrointestinal hastalık öyküsü olmadan.

Tüm katılımcıların kayıttan önce düzenli beslenme alışkanlıklarını sürdürmeleri gerekiyordu. Hiçbiri probiyotik, prebiyotik, diyet lifi takviyesi veya diğer besin takviyeleri almamıştı. Ayrıca, tüm katılımcılar numune alınmadan en az üç ay önce hiç antibiyotik tedavisi almamıştı. Çalışma sırasında standart bir diyet müdahalesi yapılmadı, ancak tüm katılımcılara bağırsak mikrobiyotası üzerindeki olası karıştırıcı etkileri en aza indirmek için istikrarlı bir yaşam tarzı ve diyet sürdürmeleri talimatı verildi.

Araştırma Grubu

Bu çalışma grubu üç gruba ayrıldı: PD grubu (n = 10): Parkinson hastalarından toplanan dışkı örnekleri, anti-Parkinson ilaç kullanmıyordu. Piribedil grubu (n=10): Parkinson hastalarından 21 gün ardışık piribedil tedavisinden sonra alınan dışkı örnekleri (50 mg, günde iki kez). Boş kontrol grubu (n=5): sağlıklı bireylerden alınan dışkı örnekleri.

16S ribozomal RNA dizileme

Dizileme işlemi diğer çalışmalarda bildirildiği gibi dizileme platformunda^{gerçekleştirildi 12,13}, Kısaca, sodyum dodesil sülfat (SDS) yöntemi kullanılarak dışkı örneklerinden toplam mikrobiyal DNA^{izole edildi} 14,15,16. Çıkarılan DNA'nın bütünlüğü %1 agaroz jel elektroforezi ile doğrulandı ve DNA konsantrasyonu ile saflığı bir spektrofotometre ile belirlendi. Bakteriyel 16S rRNA geninin hiperdeğişken bölgesi V3-V4, genomik DNA'dan, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) termosikleti ile dejenere primerler 341F (5'-CCTAYGGGGGGCAG-3') ve 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') kullanılarak genomik DNA'dan amplifikasyon edilmiştir. Bakteriyel 16S rRNA geninin amplifikasyonu aşağıdaki termal koşullarda gerçekleştirildi: 94 °C'de 2 dakika boyunca ilk ön-denatürasyon adımı, ardından 30 saniye boyunca 94 °C denatürasyon, 30 saniye 55 °C tavlama ve 30 saniye 72 °C uzamadan oluşan 28 döngü. Son bir uzatma 72 °C'de 10 dakika sürdü ve reaksiyon 4 °C'de tutuldu. PCR karışımları 2× PCR master karışımı 25 μL, ön primer (10 μM), 2 μL, ters primer (10 μM) 2 μL, şablon DNA 10 ng ve son olarak ddH₂O 50 μL'ye kadar içerir. PCR reaksiyonları üçlü olarak gerçekleştirildi. PCR karışımları 2× PCR master karışımı 25 μL, ön primer (10 μM), 2 μL, ters primer (10 μM) 2 μL, şablon DNA 10 ng ve son olarak_{ddH 2}O 50 μL'ye kadar içerir. PCR reaksiyonları üçlü olarak gerçekleştirildi. PCR ürünü, %2 agaroz jelinden çıkarıldı ve jel ekstraksiyon kiti kullanılarak saflaştırıldı. Kütüphane oluşturulmasında MGI V2 için Universal Plus DNA Library Prep Kit kullanıldı: (1) Splinter bağlantısı; (2) Eklemlerin birbirine bitişik segmentlerini çıkarmak için manyetik boncuk taraması kullanılır; (3) Kütüphane şablonlarının PCR amplifikasyonu ile zenginleştirilmesi; (4) PCR ürünlerini geri kazanmak için manyetik boncuklar; (5) PCR ürünlerinin döngüselleştirilmesi. Kütüphane doğrulamasından sonra sıralama yapıldı.

Kalite kontrol noktaları: Kontrol noktası 1 (Numune toplama): Örnekler toplandıktan hemen sonra snap-donduruldu ve −80°C'de saklandı. Görünür erime veya kontaminasyon belirtileri olan herhangi bir örnek atıldı. Kontrol noktası 2 (DNA çıkarımı): Kabul edilebilir saflık: A260/A280 = 1.8–2.0, A260/A230 ≥1.8; bütünlük, %1 agaroz jel üzerinde tek bir yüksek moleküler ağırlıklı bant ile doğrulanmıştır. Kontrol noktası 3 (PCR amplifikasyonu): %2 agaroz jel üzerinde ~460bp seviyesinde tek bir bant, başarılı amplifikasyonu gösterir (primerler 341F/806R, V3-V4 bölgesi); Eğer yoksa veya spesifik değilse, tavlama sıcaklığını veya şablon konsantrasyonunu ayarlayın. Kütüphane hazırlığı için ≥0.5 ng/μl iyileşme konsantrasyonu gerekiyordu. Kontrol Noktası 4 (Kütüphane hazırlığı ve dizileme): Dizileme tesisi tarafından standart doğrulanmış protokollerine uygun olarak gerçekleştirilir; ek bir kurum içi kontrol noktası (örneğin, Biyoanalizör ölçüleri) uygulanmadı.

Güvenlik ve atık bertarafı: Tüm numune işleme sırasında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyildi. Çalışma yüzeyleri %70 etanol ile temizlendi. Tüm kirlenmiş tüketim maddeleri (uçlar, tüpler, jeller) biyotehlike atık olarak bertaraf edilmeden önce 121°C, 20 dakika boyunca otoklavlanmıştır.

Biyoinformatik

16S rRNA geninin ham dizileme okumaları önce demultiplexlenmiş, fastp (sürüm 0.20.0) kullanılarak kaliteli filtreleme uygulanmış ve standart tarama kriterleri altında FLASH (sürüm 1.2.11) ile montaj edilmiştir. Kısaca: (i) Ham 300 bp dizileri, ortalama kalite puanı 50 bp kaydırma penceresi içinde 20'nin altına düştüğünde kesildi. 50 bp'den kısa kısaltılmış veya belirsiz tabanlara sahip okumalar kaldırıldı; (ii) Dizi montajı yalnızca 10 bp'yi aşan örtüşmeler için yapıldı ve örtüşen bölgenin maksimum uyumsuzluk oranı 0.2 olarak belirlendi. Birleştirilemeyen eşleşmemiş okumalar kaldırıldı; (iii) Bireysel örnekler, sonraki yönelim ayarlaması için barkod ve primer dizilerine göre bölündü. Barkod eşleştirme tam hizalama ile yapılırken, primer eşleştirme maksimum 2 nükleotid uyumsuzluğuna izin verirdi. 16S rRNA okumaları, Mikrobiyal Ekolojiye Nicel Insights (QIIME) boru hattı (sürüm 1.8.0) kullanılarak analiz ^edildi17. Etiket dizileri, FLASH (sürüm 1.2.11) kullanılarak eşleştirilmiş uçlu okumalara ^eklendi18. Kesme, minimum 200 bp uzunlukta ve ortalama 25 kalitede UPARSE (sürüm 7.0.1090) kullanılarak gerçekleştirildi, ardından %97 bir kesme noktasında kümelenme yapılarak operasyonel taksonomik birimler (OTU'lar)¹⁹ oluşturuldu. Temsilci OTU okumaları, taksonomik olarak RDP Sınıflandırıcı 2.2 ile sınıflandırıldı ve güven sınırı ≥0.6 ile belirlendi. Etiket ve okuma bollukları USEARCH global²⁰ kullanılarak karşılaştırma yoluyla belirlendi. Kimerik dizilerin tanımlanması, UCHIME (v4.2.40)²¹ kullanılarak Gold veritabanı ile yapılan karşılaştırmalara dayandı. Daha sonra ana koordinat analizi (PCoA), Bray–Curtis benzersizliğine dayalı seyrek veri setinde yapıldı ve kümeleme için dizi benzerlik eşiği %97 olarak belirlendi. Temsilci OTU'lar ve ilgili taksonomik profiller, R yazılımı (sürüm 3.1.1) kullanılarak daha fazla analiz edilmiştir. Lineer ayırt edici analiz (LDA) etkisi boyutuna dayanan Lineer ayırt edici analiz etkisi boyutu (LEfSe) algoritması, OTU seviyesinde anlamlı diferansiyel bolluğa sahip ekran biyobelirteçlerine uygulanmıştır. Bu yöntem, önce gruplar arasında tutarlı farklılıklara sahip özellikleri belirleyerek (çok gruplu karşılaştırma için Kruskal-Wallis testi kullanılarak) hem istatistiksel anlamlılığı hem de biyolojik önemi vurgular; ardından her farklı bol özelliğin etki boyutunu LDA ile tahmin eder. LDA puanı >2.0, önemli ölçüde artan^{bolluk 22} olarak tanımlanır.

İstatistiksel Yöntemler

İstatistiksel analizler SPSS kullanılarak yapılmıştır. Normalde dağılımlı veriler, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. Normal dağılıma uymayan veriler Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak analiz edildi. Tüm nicel veriler, normal dağılıma uygun parametreler için ortalama ± standart hata (SE) olarak ifade edilirken, normal dağılım olmayan veriler ise ortanca ve çeyreklerarası aralıkla sunuldu. P< değeri 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Piribedil tedavisiyle ilişkili mikrobiyal çeşitlilik farklılıkları

DNA ekstraksiyon kalite kontrol sonuçları (konsantrasyon aralığı, saflık) Ek Tablo 1'de sunulmaktadır. PCR amplifikasyonu kalite kontrolü (bant boyutu, iyileşme konsantrasyonları) Ek Tablo 2'de gösterilmiştir. Sıralama kalite kontrol metrikleri (okuma sayıları, derinlik, kapsama) Ek Tablo 3'te detaylandırılmıştır. ACE, Chao1, InvSimpson, Shanno...

Tartışma

Parkinson hastalığı, dünyada en yaygın ikinci nörodejeneratif bozukluk olarak sıralanır; Alzheimer hastalığından önce²³. 1970'ten beri, piribedil, dopamin reseptör agonisti olarak PD²⁴ tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak klinik uygulamada, piribedil bulantı, kusma ve gastrointestinal rahatsızlık gibi bazı yan reaksiyonlara neden olabilir. Artan araştırmalar, Parkinson hastalığının gelişiminin ve dopamin reseptör agonistleriyle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2× reaction buffer (Taq MasterMix)	Kangweii	CW0690
Agarose	(genel)	uygun değil	moleküler biyoloji sınıfı
AxyPrep DNA Gel Extraction Kit	Axygen Biosciences	(sağlanmamış)
Tezgah üstü yüksek hızlı dondurma santrifüjü	Hunan Kosei	GTR116C
DNA ekstraksiyon reaktifleri (SDS, fenol, kloroform, etanol)	(genel)	uygun değil
DNBSEQ-G99 PE300 sekanslama platformu	MGI Tech Co., Ltd	DNBSEQ-G99
Jel elektroforez aparatı	Beijing Liuyi	DYY-8C
Jel görüntüleme sistemi	Shanghai Jiapeng	JP-2880
LEfSe yazılımı	(açık kaynak)	çevrimiçi sürüm
NanoDrop spektrofotometre	Hangzhou Haipe	Aurora-900
PCR makinesi	Hangzhou Langji	A200
Piribedil	Servier	6094078
Primers: 341F ve 806R (sentezlenmiş)	(özel sentez)	uygun değil
QIIME yazılımı	(açık kaynak)	http://qiime.org	sürüm 1.8.0
Quantus Florometre	Promega	E6150
Qubit 4.0 Florometre	Invitrogen	Q33226
SDS (sodyum dodesil sülfat)	(genel)	uygun değil
UPARSE yazılımı	(açık kaynak)	http://drive5.com/uparse	sürüm 7.0.1090
VAHTS Universal Plus DNA Kütüphanesi Hazırlama Kiti MGI V2 için	Vazyme	NDM627-01