Tümör içi immünoterapiye artan ilgi nedeniyle, erişilebilir ve pratik tümör modelleri seçmek çok önemlidir. Deri altı tümörleri oluşturmak kolaydır ancak görselleştirmek ve manipüle etmek zordur. Bu protokolte, daha iyi görünürlük ve erişilebilirlik sağlayan deri içi tümörlerin oluşumu için yöntemleri tanımlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İntradermal Tümör İmperasyonu Olarak Mısır Kanseri İçin Sağlam Bir Model Olarak İntümörlü İmmünoterapi Çalışmaları
Bu makalede
Özet
Özet
Tekrarlanabilir fare tümörü modelleri oluşturmak, kanser biyolojisi ve immünoterapi stratejilerini değerlendirmek için gereklidir. Tümör içi immünoterapi, yerleşik tümörleri yerel bağışıklık baskısını tersine çevirmek ve sistemik antitümör bağışıklığı uyarmak için imimmün uyarıcı reaktiflerle tedavi eder. Çoğu kanser çalışması, fare üzerinde tümörleri deri altı alanda konumlandırır; bu da intratümör enjeksiyonları görselleştirememesi nedeniyle deneysel intratümörsel immünoterapi için doğasında zorluklar yaratır. Tümör hücrelerinin intradermal enjeksiyonu, doğru ve tekrarlanabilir intratümör enjeksiyonunu destekleyen, büyüme kinetiği ve terapötik yanıtların izlenmesini destekleyen görselleştirilebilir tümörler oluşturmak için güvenilir bir yaklaşım sunar. Burada, örneğin C57BL/6 farelerinde fare B16F10 melanom modelini kullanarak intradermal tümörlerin oluşturulması ve tedavisi için tekrarlanabilir bir metodoloji sunuyoruz. Tümör hücresi süspansiyonları derme içine enjekte edilir ve tümör implantasyonundan 7–10 gün sonra, tümörler ~60 mm3 boyutuna ulaştığında, bağışıklık uyarıcı maddelerin tümör içi enjeksiyonu veya elektroporasyon veya ısıtma gibi fiziksel tedavi doğrudan uygulanabilir. Bu, tedavilerin hassas şekilde sunulmasını ve tümör büyümesinin kaliperlerle ölçülmesini sağlar ve görselleştirilemeyen birden fazla deri altı tümörü tedavisinin doğasında olan değişkenliği ortadan kaldırır. Bu tekniğe dair ayrıntılı bilgiler sunarak, bu makale tekrarlanabilirliği desteklemeyi ve intratümörsel immünoterapide preklinik araştırmaları ilerletmeyi amaçlamaktadır.
Giriş
Fare tümörü modelleri, kanser araştırmalarında vazgeçilmez bir araçtır. Optimal bir fare modelinde, hem genetik hem de morfolojik seviyelerde insan tümörlerini yakından taklit eden tümörlerindüklemek mümkün olur. 1. Bu, intratümörsel immünoterapi (ITIT) dahil olmak üzere farklı alanlarda yeni terapötik yaklaşımların değerlendirilmesini ve verimliliğini sağlar. ITIT, tümör mikro ortamına (TME) doğrudan bağışıklık uyarıcı ajanların verilmesini içeren kanser tedavisinde gelişmekte olan bir alandır. Bu lokal teslimat, yerel bağışıklık aktivasyonunu artırabilir, immünosupresif tümör mikro-ortamını tersine çevirebilir ve abskopal etki olarak bilinen sistemik antitümör bağışıklık yanıtlarınıtetikleyebilir 2. Ancak, intratümör uygulamanın verimliliği, doğruluğu ve tutarlılığı, farklı tümör modellerinde enjeksiyon parametrelerinin görselleştirilmesi ve kontrol edilmesi yeteneğine bağlıdır.
Çoğu preklinik kanser çalışması subkutan tümör implantasyonu kullanır. Ancak, bu yaklaşımın intratümör tedaviler için sınırlamaları vardır çünkü tümör enjeksiyon sırasında doğrudan görselleştirilemez, ancak ameliyat yapılmazsa. Birçok intratümör immünoterapi stratejisi, reaktiflerin küçük fare tümörlerine hassas şekilde verilmesini gerektirir ve genellikle bu görevi birden fazla kez yerine getirmeyi gerektirir. Görsel doğrulama olmadan, enjeksiyon doğruluğu ve deri altı tümörlerde reaktif tutulması kötü kontrol edilen değişkenler haline gelir. Bu, deneysel verilerin yanlış yorumlanmasına/varyasyonuna yolaçabilir 3.
Deri içi tümör implantasyonu, tümör gözlemi, ölçümü ve intratümör enjeksiyonu için doğrudan, erişilebilir, görgörülebilir ve tekrarlanabilir bir alternatif sunarak tutarlılığı artırır. Ayrıca, çalışmalar deri içi implante edilen tümörlerin, subkutan enjeksiyonlar yerine immünojenliği artırdığını ve tümör hücrelerinin tümörjenliklerini baskıladığınıgöstermiştir 4. Derme içi enjekte edilen tümörler, lenf düğümlerine hızlı ve güçlü dendritik hücre kaçakçılığını tetikledi ve tümör-spesifik sitotoksik T hücrelerinin daha erken ve daha sağlam aktivasyonunayol açtı 4. Mevcut çalışma, C57BL/6 farelerinde intradermal B16F10 melanom tümörlerinin oluşturulması ve ardından intratümörsel tedavilerin uygulanması için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir protokolü tanımlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm işlemler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerinin onayı ve uyumlu olarakyürütülmüştür. 5. Tüm hayvan işlemleri Dartmouth'un Hayvan Tesisi'nde gerçekleştirildi. 6–8 haftalık dişi C57BL/6 fareler, standart koşullar altında, yiyecek ve su ile havalandırmalı raflarda tutuldu. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Fare tıraş etmek
NOT: Tüm personel, bu işlemleri uygulamadan önce canlı hayvan kullanımı ve anestezi konusunda kurumsal eğitimi tamamlamalıdır.
- Deri içi enjeksiyondan önce, aşağıda açıklandığı şekilde her farenin yan kısmını tıraş edin; Sağ yan enjeksiyonlar ve tarif edilen prosedürler için kullanıldı. Tümör hücreleri enjekte edilmeden bir gün önce fareleri tıraş edin.
- Fareyi sabit bir yüzeye yerleştirin. Fareyi sol başparmak ve işaret parmağıyla ense derisinden kazın, sol tarafı nazikçe avuca sıkıştırarak sağ tarafı açığa çıkarın. Sol bacak ve kuyruğu tutarak yüzük ve/veya serçe parmakları kullanın, böylece sağ bacak tamamen açıkta kalsın.
- Arka bacaktan alt kaburgaya kadar kürkleri tıraş ederek enjeksiyon için açık bir alan oluşturun.
- Ek antrenman alanı gerekirse her iki kanat da tıraş edilebilir.
NOT: Yeni başlayanlar, tıraş olmayı ve düzgün şekilde kaşmayı öğrenirken fareleri anestezi altına alabilirler.
2. Boya enjeksiyonları pratik yapın
NOT: Pratik hem canlı (anestezilen) hem de ötenazi edilmiş farelerde ve her iki cinsiyette de yapılabilir. Erkek fareler genellikle dişilere göre daha kalın ve daha esnek cilde bulunur, bu da işlemi teknik olarak daha zor hale getirir. Bu nedenle, erkekler üzerinde pratik yapmak yeterlilik geliştirmek için faydalıdır.
- Çözelti koyu olana kadar 1,5 mL Eppendorf tüpünde fosfatla tamponlanmış tuzlu su (PBS) ile karıştırın (bu çalışmada mavi gıda boyası kullanılmıştır).
- Uygulama fareleri edinin ve kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına göre anestezi edinin.
- Anestezi altındaki fareyi burun konisinin altına yerleştirin ve vücudunu eğip sağ balanı ortaya çıkarın. Ayak pedini hafifçe sıkarak ve yanıt görmeyerek yeterli anestezi olduğunu doğrulayın.
- 30 μL boya çözeltisini, 29 G, 1/2" iğneyle 0.3 mL insülin şırıngasına yükleyin. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
- Baskın olmayan eli kullanarak bacağı/deriyi hafifçe çimdikleyip esnetleyerek pürüzsüz, gergin bir yüzey elde edin (deriyi yukarı kaldırmaktan kaçının). İğneli eğimlik , dermise dermise dermise sığ bir paralel açıyla yerleştirin. Dermal yerleşimi doğrulamak için iğneyi yüzeyin altında görün tutun.
NOT: Uygulama sırasında, parmakları iğne yolundan uzak tutmak için farklı el tutma pozisyonlarını deneyin; böylece deri gerilimini sabit koruyun. İğneyi deriye ~2 mm soku. Geri akışı azaltmak için iğneyi ~3 mm içine sok, ardından enjeksiyondan önce hafifçe çekerek bir "cep" oluşturun. Bu, boyanın enjeksiyon bölgesinde kalmasına yardımcı olur. - Boyanın tüm 30 μL'sini yavaşça enjekte ederek cilt yüzeyinin altında küçük, belirgin bir "baloncuk" oluşana kadar
NOT: Görünür kabarcıkların olmaması, enjeksiyonun deri içi değil, deri altı yoluyla yapıldığını gösterir. Eğimi yukarı doğru tutmak, dermal yerleşimin doğru olmasını sağlar ve aşırı derin enjeksiyonu önler. - Sürekli intradermal kabarcıklar oluşana kadar pratik yapmaya devam edin. Her taraf için altı ila sekiz enjeksiyon yapılabilir.
- Uygulama enjeksiyonları tamamlandıktan sonra, fareleri onaylanmış Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC)protokollerine uygun olarak ötenazi yapın 5.
3. Tümör hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması
NOT: Tüm hücre ile ilgili adımları steril bir kapüşonda yapın. Farklı fare tümörü hatlarının farklı şekilde büyüdüğünü unutmayın.
- Tümör hücrelerini (bu çalışmada kullanılan B16F10) intradermal enjeksiyonlardan birkaç gün önce eritmek.
- Kültür hücreleri %70–80 birleşimine ulaşır ve yeterli taze ortam korunur
NOT: %100 birleşmeden kaçının; bu da proliferasyonu durdurur ve tümör büyümesini engeller. - Hücreleri 7 x 106 hücre/mL olarak 1x PBS, serumsuz RPMI veya hücrelerin yetiştirilmesi için kullanılan diğer ortamlarda hasat edip hazırlayın.
NOT: Laboratuvarda kullanılan B16F10 tümör modeli, 30 μL'de 2 x 105 hücre kullanır. 30 μL enjeksiyon hacmi uygundur, ancak hücre sayısı gerektiğinde ayarlanarak istenen tümör modelini oluşturmak mümkündür. Hücreler tüpün dibinde yerleşir ve toplanır, bu yüzden hücre konsantrasyonunun sabit kalması için hücreleri periyodik olarak nazikçe karıştırarak askıda kalırlar. - İşlemden sonra hücreleri buzda tutun ve hızlıca enjeksiyona başlayın. Buz üzerinde uzun süreli depolama hücre yaşamını azaltır, bu da canlı hücre sayısını azaltabilir ve tümör oluşumunu olumsuz etkileyebilir6.
NOT: Hücreler hemen laboratuvarda toplanır ve kullanılır. Enjeksiyonlar, hücreleri işledikten ve buz üzerine konduktan sonra 20–60 dakika içinde yapılır. Büyük gruplarla çalışırken buzda kalan zamanı en aza indirmek için bir partner kullanın.
4. Deri içi enjeksiyonlar
- Deneysel fareleri anestezi edin.
NOT: Laboratuvarda izofluran gazı ile anestezi kullanılır, ancak enjekte edilebilir anestezikler de kullanılabilir. - Anestezi indüksiyonundan sonra, fareyi burun konisinin altına yerleştirin ve vücudunu sağ kanadı tamamen açığa çıkaracak şekilde konumlandırın.
- Hücre süspansiyonunu nazikçe ters çevirerek eşit karışımı sağlayın.
- 30 μL hücre süspansiyonunu 0.3 mL bir şırıngaya 29 G, 1/2" iğne ile çekin. Hava kabarcıklarını çıkarın.
- Baskın olmayan eli kullanarak, bacağı/deriyi nazikçe yana doğru gererek pürüzsüz ve sıkı hale getirin (yukarı doğru kaldırmayın). İğne eğimli iğnesini dermise sığ paralel bir açıyla sokun. İğne derinin altında görünür kalmalıdır, bu da çok derin olmadığını gösterir.
NOT: İğne derinliği deriye ~2 mm olmalıdır. Hücrelerin geri akmasını önlemek için, iğneyi deriye ~3 mm sok, iğneyi hafifçe geri çekerek hücrelerin enjekte edileceği bir "cep" oluşturun. Bu, geri akışı önemli ölçüde azaltır. - Çok yavaş bir şekilde tüm 30 μL hücre süspansiyonunu enjekte edin, ta ki derinin altında küçük, görünür bir "baloncuk" oluşana kadar. İğneyi çıkarmadan önce 5–10 saniye bekleyin.
NOT: İğneyi çok hızlı çıkarmak, basınç nedeniyle çözeltinin deriden çıkmasına neden olabilir. - Her fare için tekrarlayın. İğnelerin kütleşmesini önlemek için her kafesin ardından (4–5 fare) şırıngaları değiştirin.
- Tüm fareleri anesteziden tamamen iyileşene kadar izleyin.
- Farelerde tümör oluşumu için izlenin.
5. Tümüür içi enjeksiyonlar
NOT: Tümörler genellikle implantasyondan 7–10 gün sonra, uygun boyuta ulaştıklarında tedaviye hazır olur. Laboratuvarda kullanılan uygun boyut ~50 mm3 veya daha fazladır, formül kullanılarak: Hacim = (Uzunluk/2) * (Genişlik*Genişlik)7,8.
- Tüm tedavi çözümlerini önceden hazırlamak (örneğin, bu çalışmada 1x PBS kullanılmıştır). Çözeltileri belirli tedavinin gerektirdiği şekilde buz üzerinde veya oda sıcaklığında sakla.
- Kurumsal yönergelere göre anestezi başlatın.
- Faresi burun konisinin altına yerleştirin ve tümörün açığa çıkması için konumlandırın.
- Gerekli hacmi (örneğin, burada kullanılan 30 μL) 29 G, 1/2" iğne ile 0.3 mL insülin şırıngasına çekin. Hava kabarcıklarını çıkarın.
NOT: Hacim, tercih edilen tedavi ve optimize edilmiş koşullara göre değişecektir. - İğneyi yatay olarak tümörün içine sokun ve tümör kütlesinin merkezine doğru ilerleyin.
NOT: Enjeksiyonu üst veya dik açıyla sokmaktan kaçının, çünkü bu enjeksiyonun çok derine veya çevre dokuya ulaşmasına neden olabilir. Tarif edilen tedavi tek enjeksiyon olarak uygulandı. Dozlar ve sıklık, tercih edilen tedaviye ve optimize edilmiş koşullara bağlıdır. Küçük tümörlerde tedavinin dağılımı için tek doz yeterlidir, ancak daha büyük tümörlerde tedavinin tümör kütlesine eşit şekilde dağıtılması için birden fazla enjeksiyon gerekebilir. - Tedaviyi yavaş ve düzenli olarak enjekte edin. İğneyi yavaşça çekmeden önce geri akışı veya sızıntıyı en aza indirmek için 10 saniye duraklayın. Bazı tümörlerde yüksek iç basınç vardır ve enjeksiyonun iğne deliğinden sızmaması için özen gösterilmelidir.
- Her fare için işlemi tekrarlayın. Her 4–5 farelik kafesten sonra ve işlem grupları değiştirirken çapraz kontaminasyonu önlemek için şırıngaları değiştirin.
- Anestezi sonrası fareleri hareketlilik ve normal solunum kazanana kadar izleyin. Tedavi yanıtı ve genel sağlık için günlük izlemeye devam edin.
NOT: Farklı hücre hatlarının tümörlerin farklı zamanlarda ülserleşmesine neden olabileceğini unutmayın. Her deney ve her IACUC protokolünde son noktalar ve dışlama kriterleri açıkça belirtilir. Laboratuvarda fare deneylerinin son noktaları 1500 mm3 olup, ortaya çıkan ülserasyonlar kabul edilir ve çalışmadan dışlanmaz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Boya enjeksiyonları yapılırken, enjeksiyon bölgesinde görünür bir "baloncuk" oluşumu gözlemlenerek fareyi ötenazi yapmadan başarılı intradermal doğum doğrulanabilir. Doğru şekilde yapılan bir deri içi enjeksiyon, büyük, iyi tanımlanmış ve yükseltilmiş bir "baloncuk" oluşturur (Şekil 1A–F). Küçük veya düz kabarcıklar, enjeksiyonun kısmen deri altı olabileceğini gösterir. Eğer "baloncuk" oluşmuyorsa ve boya veya hücreler derinin altına yayılır...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolün başarısı (Şekil 4), dermis altı katman yerine dermise ulaşımı sağlamak için tutarlı bir dermal enjeksiyon derinliği ve hassas iğne yerleştirmesinin korunmasına bağlıdır. İğne açısı çok dik veya enjeksiyon basıncı çok yüksekse, boya veya tümör hücreleri deri yoluyla deri altı boşluğa birikebilir. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yavaşça çekmeden önce kısa bir duraklama, yan bölgede çift tümörlerin (kardan adam) oluşmasını veya sızıntısını önlemeye ya...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
AS, İmmünoloji Eğitim Bürüsü, T32 AI007363'yi kabul etmektedir. KSK, Schlumberger Vakfı'na Gelecek Fakültesi programı aracılığıyla destek verdiği için minnettarlık sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | izofluran |
| Food Coloring | Durkee | pratik için | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | fareleri tıraş etmek için makas |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | anestezi makinesi |
Kaynaklar
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
