Yöntem makalesi

Bex-Plex, sağlam dokunun derin mekansal profillenmesi için protein belirteçleri ve ribonüklein asit transkriptlerinin eşzamanlı görselleştirilmesini sağlar

DOI:

10.3791/70303

⸱

3 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Allergy, Immunology, and Rheumatology, University of California San Diego

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yüksek çözünürlüklü mekansal profilleme uygulamaları için sağlam sabit donmuş dokuların derin mekansal fenotiplenmesi amacıyla, iteratif protein boyama (IBEX) ile RNAscope in situ hibridizasyon teknolojisini birleştirme protokolünü sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, sağlam dokularda tek hücre çözünürlükte protein ve ribonüklein asit (RNA) belirteçlerinin eşzamanlı mekansal profillenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Katı tümör kanserleriyle ilgili temel sorunlardan biri, hastaların terapötik müdahaleye yanıt vermesini öngörememektir. Bu karmaşıklıkları çözmek, sağlam dokular içindeki hücresel davranışların, etkileşimlerin ve fenotiplerin nicel ölçümünü gerektirir. Özellikle, proteom ve transkriptom, rasyonel immünoterapi tasarımı için kritik olabilecek örtüşen ancak tekrarsız bilgi sağlar. Ancak, tümör mikro ortamındaki tüm hücrelerin transkripsiyonel ve fonksiyonel durumunu derinlemesine profil ederken kritik mekansal lokalizasyon bilgilerini korumanın şu anda basit ve maliyet etkin bir yolu yoktur. Bu amaçla, IBEX (yinelemeli ağartma çokluğu genişletir) platformunu HiPlex RNAscope ile başarıyla birleştirerek aynı anda yüksek plex protein belirteçlerini ve yüksek plex ribonüklein asit (RNA) transkriptlerini tek hücre çözünürlüklü görselleştirdik. Bu yaklaşım, nükleer morfolojiyi korumak ve döngüler arasında doğru görüntü hizasını sağlamak için modifiye edilmiş bir RNA hedef alım adımını içerir. "Bex-Plex", sabit donmuş dokularda değiştirilmemiş bir IBEX protokolü ve ardından HiPlex RNAscope protokolünü uygulamamıza olanak tanır; bu protokolde IBEX döngüleriyle nükleer seviyede hizalanmayı sağlamak için modifiye edilmiş bir RNA hedef alımı kullanıyoruz. Bu protokol, sabit donmuş dokular için optimize edilmiştir ve transkripsiyonel ve fonksiyonel hücresel durumların entegre mekansal analizini sağlar. Bu tek hücre düzeyinde profil oluşturma gücü, doku hakkında derin bir bilgi kaynağı sağlamakla kalmaz, aynı zamanda terapötik yanıt vermeyi sağlayan incelikli hücresel etkileşimler hakkında tahminleri güçlendirir ve tümör mikro ortamlarında ve ilgili sistemlerde mekânsal biyolojiyi incelemek için bir çerçeve sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2011'de tanıtılmasından bu yana, PDL-1 ve CTLA-4 gibi inhibitör bağışıklık kontrol noktası moleküllerini engelleyerek sitotoksik T hücrelerinin baskılanmasını azaltan kanser immünoterapileri, katı tümör tedavisinde altın standart olarak ortayaçıkmıştır. Ancak, hastalarda yaygın kullanıma rağmen, bu ilaçların klinik etkileri büyük ölçüde değişir çünkü birçok katı tümör kanseri bu tedavilerle birlikte içsel olarak ortaya çıkar veya sonunda direnç oluşturur2. Birçok durumda bu, aynı kansertip 3 arasında bile katı tümörlerin aşırı heterojen doğasından kaynaklanır. Katı tümörlerde meydana gelen hücre ilişkilerinin daha derinlemesine anlaşılması, tedavi yöntemlerinin iyileştirilmesini sağlamanın anahtarıdır. Bu nedenle, bu direnci güçlendiren ve sürdüren kesin mekanizmaları ve etkileşimleri belirlemek kanser araştırmalarının ön saflarındadır. Burada, sağlam dokularda protein ve RNA ekspresyonunun entegre mekansal analizini mümkün kılan ve bu karmaşık hücresel etkileşimleri daha iyi karakterize etmeyi amaçlayan bir yöntem geliştirmeyi hedefledik.

Tümör mikro ortamı (TME), tümör büyümesini ve bağışıklık yanıtını şekillendiren kanser olmayan hücresel ve yapısal bileşenlerden oluşur; bunlar arasında kanserle ilişkili fibroblastlar, sızan bağışıklık hücreleri, damar bileşenleri ve ekstraselülermatriks 4 bulunur. Son zamanlarda, TME'nin bileşimi ve organizasyonunun, tümörlerin immün infiltrasyonuna izin vericiliğini veya dirençli olup olmadığını güçlü şekilde etkilediği ortaya çıktı; bu, immünoterapiye yanıt vermeyi belirleyen anafaktörlerden biridir 5. Birçok kanserde, düşük sayıda T hücresi ve yüksek immünosupresif miyeloid popülasyonların varlığıyla karakterize edilen "bağışıklık çölü" fenotipi, kontrol noktası blokaj tedavilerine kötü yanıt verme ileilişkilidir 6,7. Kemokin sinyalasyonu, bu işe alım dinamiklerinin çoğunu yönetir. Örneğin, CXCL1 ve CCL2 immünosupresif miyeloid hücreleri çekerken, CXCR3-CXCL9/CXCl10 ekseni hem sitotoksik hem de düzenleyici T hücrelerinitümör 8'e atar. Sonuç olarak, nişe özgü sinyal ortamı hücre fenotipini ve işlevini güçlü şekilde etkileyebilir. Örneğin, kolorektal kanser hastalarında CCL5-CCR5 ekseni tümör ilişkili makrofajların (TAM) baskılayıcı fonksiyonunu kontrol eder ve bu sinyali engellemek, TAM'ı anti-tümörjenik fenotipe doğru yönlendirir ve klinik yanıtların iyileşmesiylekorelasyon gösterir 9. Ayrıca, bağışıklık hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar ve/veya tümör hücreleri arasında ICAM ve PDL-1 yoluyla doğrudan etkileşimler, bağışıklık tükenmesini tetikleyebilir ve antitümör bağışıklığını küçümseebilir. Bu bulgular birlikte, TME'nin terapötik etkinliği nasıl etkilediğini anlamak için mekânsal olarak çözülmüş analizlerin önemini vurgular.

İmmünoffloresan (IF) görüntüleme, dokuda protein ekspresyonunu ve hücre-hücre etkileşimlerini görselleştirmek için temel bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Alan, geleneksel 3-4 renkli IF'den, yinelemeli boyama ve görüntülemeye dayanan yüksek içerikli görüntüleme iş akışlarına doğru ilerledi. Bu yöntemlerde, büyük veri setleri antikor etiketleme, görüntüleme ve florofor inaktivasyonu veya çıkarılması döngüleriyle oluşturulur; böylece ek işaretleyiciler boyanabilir vegörüntülenebilir. 11. Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX), yakın zamanda kullanıcı dostu ve maliyet etkin bir yinelemeli görüntülemeplatformu olarak tanıtıldı 12. Ticari antikorlar ve konvansiyonel mikroskopların kullanımıyla uyumlu olan IBEX, en yaygın kullanılan boyaların floresansını söndürmek için lityum borohidrit (LiBH4) kullanır ve doku epitoplarına zarar vermeden bu da tek bir doku için 75 parametreye kadar alınmasına olanaktanır 13. Bu döngüsel boyamadan elde edilen görüntüler, SimpleITK açık kaynak yazılımı kullanılarak hizalanarak yüksek boyutlu mekansal analizler için uygun bileşik veri setleri oluşturulur.

Protein düzeyinde fenotiplemeye tamamlayıcı olan mekansal transkriptomik yöntemler, hücrelerin doğal ortamlarındaki transkripsiyonel durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Özellikle, yerinde hibritleşme (ISH), belirli bir dokuda DNA veya RNA dizilerinin lokalizasyonunu tanımlamak için popüler birtekniktir 11. RNAscope, benzersiz bir Z kimyasına sahip probları kullanarak RNA transkriptlerini tek molekül çözünürlükte özel olarak güçlendiren ve birçok farklı örnek tipiyle uyumlu olan iyi köklü bir ISHyaklaşımıdır 14. Gelişmiş Hücre Tanılaması (ACD) aracılığıyla yaygın olarak benimsenen ve ticari olarak erişilebilir bir platform olarak, RNAscope çok çeşitli hedeflere karşı doğrulanmış problar sunarak çeşitli uygulamalar için deneysel tasarımı basitleştirir.

Hücre kimliği ve işlevlerine dair daha kapsamlı bir görüş, aynı doku içinde protein ve RNA algılamalarının birleştirilmesiyle elde edilebilir. Sitokinler ve kemokinler gibi kısa ömürlü salgılanan proteinler geleneksel olarak IHC ile güvenilir antikor boyamalarına sahip değildir, ancak ekspresyonları hakkında bilgi mRNA transkriptlerinin nicelendirilmesiyle elde edilebilir. Geleneksel kromojenik IHC veya TSA-OPAL gibi önceki RNA ve proteini birlikte algılama girişimleri, doğrusal olmayan sinyal amplifikasyonu ve zaman alıcı antijen toplama protokolleriylesınırlandırılmıştır 15. Bu yaklaşımlara kıyasla, Bex-Plex yöntemi yüksek pleksli protein ve RNA algılanmasını sağlarken, mekansal bağlamı ve nükleer morfolojiyi korurken doğru görüntü kaydı sağlar.

Burada, hücrelerin doğal dokularındaki transkripsiyonel ve translasyonel durumlarının eşzamanlı ve ölçülebilir karakterizasyonu için IBEX ve RNAscope platformlarını entegre eden "Bex-Plex" protokolünü sunuyoruz. Bex-Plex'te, sabit OCT gömülü dokular standart IBEX protokolünden geçer ve ardından biraz değiştirilmiş bir RNAscope HiPlex iş akışı uygulanır; burada hedef alım 60°C'de ve 1 saat kuluçka süresi ile gerçekleştirilir; orijinal 99°C kuluçka süresi ise 5 dakika sürer. Bu, çekirdeklerin mimarisini korur ve IF ve ISH döngülerinden ayrı görüntüler bir arada kaydedilirken fiducial marker'ların doğru hizalanmasını sağlar. Bu protokol, özellikle doku erişimi sınırlı olduğunda veya mekânsal mimarinin korunması kritik olduğunda, örneğin tümör mikroçevre analizi veya bağışıklık profilleme çalışmalarında olduğu gibi, sağlam dokularda protein ve RNA ekspresyonunun eşzamanlı mekansal analizini gerektiren çalışmalar için en uygundur.

Yaygın olarak erişilebilen reaktifler ve çoğu görüntüleme platformuyla uyumlu olan Bex-Plex, floresan görüntülemeye aşina olan ve geleneksel bir mikroskopa erişimi olan herhangi bir teknik eğitimli araştırma personeli tarafından gerçekleştirilebilir. Burada sunulan protokol, sabit donmuş örnekler için optimize edilmiştir. Şu anda protokol sabit donmuş dokularda doğrulanmış olup, FFPE veya insan klinik örnekleri gibi diğer örnek türlerine uygulanması için daha fazla optimizasyon gerekebilir.

Bu iş akışı, doku sınırlı veya değerli olduğu herhangi bir bağlamda, örneğin doku biyopsileri veya sınırlı örnek büyüklüğüne sahip hayvan deneyleri gibi, ayrıca dissosiyatif tekniklerle çıkarılması zor olabilecek hücrelerin fenotiplenmesi için de paha biçilmezdir. Bex-Plex, tek hücrelerin transkripsiyonel ve translasyonel profilleri hakkında eşzamanlı ve ölçülebilir bilgiler sunarken, mekansal bağlamlarını korurken, hücreler arasındaki ilişkiler ve çapraz konuşma konusundaki soruları yanıtlamaya benzersiz şekilde hazır verilerdir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde belirtilen prosedürler, Kaliforniya Üniversitesi, San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (protokol numarası S24049). Bu deneyler için C57BL/6 genetik geçmişe sahip ve belirli patojensiz koşullarda barındırılan 7-12 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı.

1. Doku hazırlığı

  1. Deneysel fareleri onaylanmış birincil ve ikincil önlemlerle (örneğin CO2 ötenazi ve servikal dislokasyon) ötenazi yapın ve ilgi çeken dokuları takviye ortamına alın.
  2. %4 paraformaldehit (PFA) stok çözeltisini %0,5 veya %1 PFA ile 1X PBS olarak seyreltirerek yeni bir doku fiksator stoku hazırlayın. Lenf düğümleri gibi düşük hacimli dokular için %0,5 PFA, tümörler gibi yüksek hacimli dokular için %1 PFA kullanın.
    DIKKAT: Paraformaldehit yutulduğunda yanıcı ve toksiktir. Uygun PPE ile ele alın ve cilt veya gözlerle temas etmekten kaçının.
  3. Dokuları, her kuyu başına 2 mL fiksatif olan 24 kuyruklu bir plakaya aktarın ve gece boyunca 4°C'de kuluçka yapın.
    Not: 16 saatten fazla kuluçka süreleri aşırı fiksasyon sorunlarına yol açabilir.
  4. Yeni 24 kuyruklu plakanın kuyularını 1X PBS ile doldurun ve dokuları fiksatif plakadan aktarın.
    Duraklama noktası: Gerekirse, dokular 1X PBS olarak 4°C'de 7 güne kadar saklanabilir.
  5. Fazla yağı/kalıntıyı bir diseksiyon dürbünü ve aletlerle birer tek tek temizleyin. Kesme sırasında doku susuzluğunu önlemek için dokuya doğrudan küçük bir hacimde 1X PBS ekleyin.
  6. 1X PBS ile toz halindeki sakaroz stokunu seyreltirerek %30 w/v sucrose çözeltisi hazırlayın.
  7. Dokuları 24 kuyruklu bir plakaya aktarın, her kuyuda 2 mL %30 sukroz bulunuyor ve gece boyunca 4°C'de kuluçka yapın. Kuyular kuyunun dibine battığında yeterince kurutulmuş olur.
  8. Etiketli kriyokalıpları OCT ile doldurun ve dokuları kalıplara teker teker yerleştirin. Doku yönelimi kökenine bağlı olacak, ancak standart önerimiz en büyük yüzey alanının kriyomold tabanla paralel olması olur. Dokuların tamamen OCT'ye batırıldığından emin olun.
  9. Kuru buzun üzerinde 10 dakika dondurulacak şekilde koyun ve -80°C'de sakla.

2. Doku kesitleri

Not: Bu protokol için kullanılan tüm reaktifler ve laboratuvar materyalleri RNase içermemelidir. Kaydıraklarla çalışırken kontaminasyonu önlemeye özen gösterin.

  1. RNase serbest mikroskop slaytlarını 15 μL krom alüm yapıştırıcıyla örtüp fırında 60°C'de 1 saat kuluçka için. Krom alum kaplamalı slaytlar, kullanımdan önce RT (oda sıcaklığı) altında bir aya kadar saklanabilir.
  2. OCT gömülü dokuları -80°C dondurucudan çıkarıp -20°C kriyostat/kriyotomda en az 20 dakika denge sağlamak için koyun.
  3. Dokuları krom alümin kaplı slaytlara kesin, 10–15 μm kalınlığında kesin.
  4. Kesilmiş kesitli slaytları 4°C'de saklayabilir veya aynı gün boyama yapılırsa sürgülerin RT ile dengelenmesine izin verin. Kesitli slaytlar 4°C'de kullanımdan önce 5 güne kadar saklanabilir.

3. Protein boyama

  1. Bir dunk tankında, sürgü üzerinde 5 dakika boyunca RNase içermeyen 1X PBS ile boyanacak şekilde ıslatın, böylece fazla OCT dokulardan alınır.
  2. Kaydıraktaki dokuların etrafına kutuları hidrofobik bariyer kalemi çizip 2 dakika kurut.
  3. RNaz-free 1X PBS içinde 10 μg·mL⁻1 anti-fare FC reseptör bloğundan oluşan bir bloklama çözeltisi hazırlayın. Bloklama tamponunu slayttaki örneklere ekleyin; dokuyu tamamen kaplayan bir baloncuk oluşturmak için yeterli miktarda kullanın (100–150 μL·kesit-1).
    Not: Bazen zor dokular ve/veya işaretleyiciler için bloklama tamponu için FBS veya BSA (genellikle %1–2) eklenmesi gerekir.
  4. Sürgüleri RT'de nemli bir boyama kutusunda 1 saat kuluçka edin, sonra RNase içermeyen 1X PBS dolu bir dunk tankında tamamen batırılarak 5 dakika boyunca yıkayın.
  5. Birincil antikor boyama çözeltisini RNase-free 1X PBS ile hazırlayın, doku kesiti başına 100-200 μL olarak planlayın. Standart antikor seyreltmeleri 1:50-1:200 arasında değişir, ancak belirli bir antikor ve/veya doku tipi için en iyi seyrelme faktörünü belirlemek amacıyla tek boyalı titrasyonlar yapılması tavsiye edilir. Vorteks ve pulse, antikorları pipetlemeden önce döndürerek floresan agregaları önler.
  6. Yıkamadan slaytları çıkarın ve antikor çözeltisinin seyreltilmesini önlemek için numune kutularının köşesindeki fazla sıvıyı emici bir iş mendiliyle nazikçe emeli.
  7. Antikor çözeltisini bloklayıcı çözeltiyle aynı şekilde uygulayın, doku üzerinde bir baloncuk oluşturun.
  8. Kaydırakları yatay olarak 37°C fırına yerleştirin ve 1 saat kuluçka yapın. Alternatif olarak, slaytları RT rejiminde nemli bir kutuda 3–4 saat kuluçka yapın. İstenilen doku için zaten optimize edilmiş standart IF protokolleri kullanılabilir. Susuz kalmayı önlemek için kuluçka sırasında kaydırakları nemli bir ortamda bulundurun. (örneğin, boyama tepsisinin altına ıslak bir kağıt havlu kullanın).
  9. Slaytları RNase-free 1X PBS'ye daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın. Boyama paneliniz için gerekirse, bu süre içinde RNase-içermeyen 1X PBS ile ikincil bir antikor boyama çözeltisi hazırlayın. Standart antikor seyreltmeleri 1:500-1:1000 arasında değişir, ancak belirli bir antikor ve/veya doku tipi için en iyi seyreltme faktörünü belirlemek amacıyla tek boyalı titrasyon yapılması tavsiye edilir.
  10. Fazla PBS'yi slaytlardan emici bir silme ile emin ve her doku bölümüne 100–200 μL ikincil antikor boyama çözeltisi ekleyin. Sürgüleri yatay olarak 37°C sıcaklıkta fırına yerleştirin ve 30 dakika kuluçka yapın. Alternatif olarak, slaytlar nemli bir kutuda 1–2 saat boyunca RT olarak boyanabilir.
  11. Slaytları 1X RNase-free PBS'ye batırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
  12. DAPI nükleer boyasını RNaz-free 1X PBS içinde son konsantrasyona 0,2 μg·mL⁻1'e kadar seyreldin ve her doku bölümüne 100–200 μL ekleyin.
  13. Slaytları nemli bir kutuda RT'de 10 dakika kuluçka yapın, sonra RNase içermeyen 1X PBS'ye daldırarak ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak bir kez yıkayın.
  14. Fazla sıvıyı slaytlardan emici bir silme ile emin ve her bölüme 20–30 μL sulu bazlı antiifade montaj ortamı ekleyin. Kaydıra dikkatlice bir kapak koyun, kabarcıkları en aza indirdiğinizden emin olun ve montaj malzemesinin 15–30 dakika boyunca kürlenmesine izin verin.
  15. Lekelenmiş slaytları hayal edin. IBEX için panel tasarımı ve görüntü edinimi konusundaki daha ayrıntılı açıklama için orijinal yayımlanmış IBEXprotokolleri 12,13'e bakınız.
    Duraklama noktası: Monte edilmiş kaydırakları karanlıkta 4°C'de 3 güne kadar saklayabilirsiniz, ancak minimum RNA bozulması için hemen ilerlemenizi öneririz.

4. Florofor ağartma ve yinelemeli protein boyama

  1. Kaydırakları RNase-free 1X PBS'ye batırın, ta ki kapak kayması kuvvet uygulanmadan kolayca kayana kadar. Coverslip'in ne kadar süre monte edildiğine bağlı olarak bu 16 saate kadar sürebilir.
  2. Slaytlar ıslanmışken, RNase-free DI H₂O içinde 1 mg·mL⁻1 LiBH₄ çözeltisi hazırlayın; tamamen çözünene kadar nazikçe karıştırın ve 10 dakika sonra aktive olmasını bekleyin. Aktivasyon, çözeltide baloncuklar bulunduğunda ve aktivite 4 saate kadar sürdüğünde gerçekleşir.
    Dikkat: LiBH4 suya reaktiftir, toz halindeki stokun neme aşırı maruz bırakılmasından kaçının ve atıkları uygun şekilde bertaraf edin.
  3. Slaytları RNase-içermeyen 1X PBS ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayarak montaj ortamı kalıntılarını giderin, ardından her dokuya 100–150 μLLiBH 4 çözeltisi pipetlenin. Nemli bir kutuda 15 dakika kuluçka yapın.
    Not: Boyama için kullanılan floroforlara bağlı olarak, bu kuluçka süresinin uzatılması gerekebilir (IBEX yöntemleri makalelerinde ayrıntılı olarak ele alınmıştır)12,13.
  4. Slaytları bir kez yıkayarak RNase-free 1X PBS'ye daldırıp kısa bir süre yukarı aşağı daldır.
  5. Slaytları ek protein belirteçleriyle boyamaya devam edin ve 3.5-3.15 adımlarını izleyin. Nükleer boyanın yeniden boyalmasına gerek yoktur çünkü LiBH4 ile ağartmaz. Gerekirse protein boyama işlemi tekrarlanın.
    Duraklama noktası: Monte edilmiş slaytlar, son protein/IBEX döngüsü ağartmadan ve RNA'ya geçmeden önce gece boyunca 4°C'de saklanabilir.
  6. Son döngüdeki floroforları ağarttıktan sonra hemen RNAscope HiPlex'e geçin. Standart IBEX'in altı döngüsü doku veya epitop kaybı olmadan gerçekleştirilmiş olmasına rağmen, bu protokol için protein boyamanın üç döngüden fazla olmasını önermiyoruz; çünkü RNA transkript kalitesinin uzun sürelerde düşme potansiyeli vardır.

5. RNAscope HiPlex için slayt hazırlığı

  1. Kaydırakları tamamen RNase-free 1X PBS içine batırın, ta ki örtü kayması kuvvet uygulanmadan kolayca kayana kadar. Coverslip'in ne kadar süre monte edildiğine bağlı olarak bu 16 saate kadar sürebilir. Montaj ortamı kalıntılarını çıkarmak için RNase içermeyen 1X PBS ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayın.
  2. 200 mL %50 etanol, 200 mL %70 etanol ve 400 mL %100 etanol hazırlayın.
  3. Hibritizasyon fırınını açın ve 60°C'ye ayarlayın. 10X Hedef Geri Alma Reaktifini RNase-içermeyen DIH 2Oiçinde 1X çalışan stokla seyreldin ve 5.8. adıma kadar fırına koyarak önceden ısıtın.
    Not: Hedef alım reaktifini önceden 60°C'ye ısıtmamak, ayrı döngülerden alınan görüntülerin aşağı akış kaydını etkiler. Hedef geri alma reaktifi, toplama adımı boyunca 60°C sıcaklıkta kalmalıdır.
  4. Slaytları %50 etanole batırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
  5. Slaytları %50 etanolden çıkarın ve %70 etanol'e daldırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
  6. Slaytları %70 etanolden çıkarın ve %100 etanole daldırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın ve taze %100 etanol ile tekrarlayın.
  7. Slaytları %100 etanolden çıkarın ve RT'de 5 dakika kurumasına izin verin.
  8. Her doku bölümüne 100–150 μL 60°C 1X Hedef Geri Alma Reaktifi eklenin ve slaytları hibridizasyon fırınına yerleştirin. 60°C'de 1 saat kuluçka yapın.
  9. Slaytları çıkarın ve RNase-free DI H2O'ya batırarak 15 saniye durulayın. Bu sırada, fırında ayarlanmış sıcaklığı 40°C'ye ayarlayın.
  10. Slaytları %100 etanole aktarın ve 5 dakika kuluçkalayın, ardından RT'de en az 5 dakika kurutun.
  11. Proteaz III'ü slaytlara uygulayın, doku kesitlerine 1–2 damla. Slaytları hibritizasyon fırınına yerleştirin ve 40°C'de 30 dakika kuluçka yapın.
  12. Kaydırakları RNase-free DIH 2O ile batırın ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak yıkayın. Taze damıtılmış suyla tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.

6. RNA koskobu reaktif hazırlığı ve prob hibridizasyonu

  1. RNAscope HiPlex prob stoklarını ve HiPlex prob seyrelticini fırında veya su banyosunda 10 dakika boyunca 40°C'ye ısıtarak hazırlayın.
  2. Kısa bir süreliğine tüm 50X sonda stoklarını aşağı indirin. Her benzersiz hedef probu RNAscope Prob Syuduceri ile 1X seviyesinde seyreltileyerek çalışan bir prob karışımı hazırlayın. Her doku başına 50–100 μL prob karışımı kullanmayı ve kullanmadan önce vortexing ile iyi karıştırmayı planlayın. RNAscope HiPlex protokolü, 4 probdan oluşan 3 çevrime kadar (toplamda 12 prob ve T1-12 olarak gösterilen) barındırabilir. Prob tasarımı hakkında rehberlik için, orijinal yayımlanmış RNAscopeprotokolü 14'e başvurun.
  3. RNAscope HiPlex Amp 1–3 ve HiPlex Fluoro T1-T4 reaktiflerini RT konumuna yerleştirerek denge sağlanır.
  4. Proteaz III ile işlenmiş slaytları alın ve her doku bölümüne 50–100 μL prob karışımı pipet yapın. Hibritizasyon fırınına yatay olarak yerleştirin ve 40°C'de 2 saat kuluçka yapın.
  5. Slaytları tamamen 1X Wash tamponuna 2 dakika batırarak yıkayın. Taze tampon ile tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.
    Duraklama noktası: Slaytlar, ACD'nin RNAscope protokolünde tanımlandığı gibi RT'de 5X SSC tamponunda gece boyunca saklanabilir. Bu duraklama noktası kullanılırsa, ertesi sabah 1X yıkama tamponunda iki 2 dakikalık yıkama gerekeceğini unutmayın.

7. Prob amplifikasyonu

Not: Slaytlara uygulamadan önce tüm reaktiflerin RT ile dengelendiğinden emin olun.

  1. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp1 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
  2. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp2 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
  3. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp3 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
  4. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Fluoro T1-T4 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 15 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
  5. Her doku bölümüne 3–4 damla HiPlex DAPI reaktifi ekleyin ve RT'de 1 dakika kuluçka yapın.
  6. DAPI'yi emici bir silme ile sıvıyı sürgülerden çekip çıkarabilirsiniz. Her bölüme hemen 100 μL sulu tabanlı antiifade montaj ortamı (IBEX boyama aşamalarında kullanılanla aynı olabilir) ekleyin. Kaydıra dikkatlice bir örtü yerleştirin, köpükleri en aza indirdiğinizden emin olun ve montaj malzemesinin 15–30 dakika kurumasına izin verin.
  7. Görüntülemeye geçin.
    Duraklama noktası: Monte edilmiş kaydıraklar karanlıkta 4°C sıcaklıkta 3 güne kadar saklanabilir, ancak minimum RNA bozulması için hızlı ilerlemenizi öneririz.

8. Flüoforların bölünmesi ve yinelemeli RNA hibridizasyonu

  1. Kaydıraklardan kapak kaymalarını çıkarmak için, RT'de en az 30 dakika 4X SSC tamponunda bekletin. Sürgüleri tamamen taze 4X SSC tamponuna batırarak ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak bir kez yıkayın.
  2. Taze bir ampul kısıtlama çözeltisi açın ve 4X SSC tamponu ile seyreltilerek %10 çalışkan stok yapın.
  3. Slaytları nemli bir kutuya yerleştirin ve %10 parçalama çözeltisinden 3–4 damla ekleyin. RT'de 15 dakika kuluçka yapın, ardından slaytları tamamen %0,5 PBST'ye batırarak 2 dakika yıkayın. Taze PBST ile tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.
  4. RNA panelinin görüntüleme döngüsü 2'ye devam etmek için, HiPlex Fluoro T5-T8 reaktifini RT ile dengeleyin.
  5. Hibritizasyon fırınını açın ve sıcaklığı 40°C'ye ayarlayın.
  6. HiPlex Fluoro T5-T8 reaktifini slaytlara ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 15 dakika kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
  7. Sürgülerden fazla sıvıyı dikkatlice emeli. Her bölüme hemen 100 μL montaj ortamı ekleyin ve kaydırağa dikkatlice bir kapak yerleştirin. Montaj ortamını 15–30 dakika kurutsun ve görüntülemeye geçin.
  8. HiPlex Fluoro T9-T12 reaktifiyle 8.1–8.7 adımlarını tutarsa toplamda 3 RNA çevrimi için tekrarlayın. RNAscope HiPlex protokolü ile 3 döngü mümkün olsa da, bu protokolle protein boyama için gereken ek zamanın RNA kalitesini etkileyebileceğini unutmayın. Bu nedenle, hedeflenen belirli transkriptlere bağlı olarak 3 döngü her zaman mümkün olmayabilir.

9. Görüntü İşleme

  1. Her turdan ham dosyaları ayrı ayrı işliyor ve arka plan çıkarma ayarları, yumuşatıcı filtreler ve kayıt dönüşüm türü gibi tutarlı parametrelerle görüntü işleme gerçekleştir. Kanallar tutarlı bir ayırıcı karakterle adlandırılmalıdır (örneğin Döngü 1: CD45 AF532, burada ":" döngü ile işaretleyici/flor arasındaki ayrımı gösterir).
  2. SimpleITK yazılımını (https://github.com/niaid/sitk-ibex) başlatın ve SimpleITK > Imaris uzantılarına tıklayın > ortak kanal kullanarak z-stack'in Affine kaydı.
  3. Her çoklu döngüden bir görüntü dosyası yükleyin ve tüm adlandırılmış kanallar için ayırıcı karakteri girin (örneğin ":").
  4. Görüntü kaydı için kullanılacak kanalı ve diğer tüm görüntülerin hizalanacağı sabit görüntüyü seçin. DAPI'nin fiducial belirteç olarak kullanılması önerilir, ancak tüm döngüler arasında herhangi bir ortak adlandırılmış kanal kullanılabilir.
  5. "Register" ve ardından "Yeniden örnekle ve birleşik görüntüyü kaydet" seçeneğine tıklayın.
  6. Seçtiğiniz yazılımla sonraki analizlere devam edin. Görüntü işleme ve kayıt hakkında daha fazla bilgi için orijinal IBEXprotokolü 12,13'e başvurun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1 : Bex-Plex iş akışına genel bakışı.
Krom alum kaplamalı slaytlara kesimlendirilen sabit donmuş dokular, standart IBEX'in 3 döngüsüne kadar uygulanır, ardından ilk hedef geri alma adımı 60°C'de 1 saat boyunca gerçekleştirilir. Ayrı döngülerden gelen görüntüler, daha sonra bir fiducial işaretleyici (örneğin DAPI) kullanılarak kaydedilir ve hizalanarak aşağıya doğru analiz için ç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bex-Plex iş akışı, yineleyici protein boyama platformu IBEX'i RNAscope in situ hibridizasyonu ile entegre ederek proteinlerin ve RNA transkriptlerinin tek hücre çözünürlükte eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar. Bu protokolün temel amacı, sağlam dokular içinde protein ve RNA ekspresyonunun entegre mekânsal analizi için tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Aynı dokuda hem protein hem de RNA ekspresyonunu ölçebilme yeteneği daha önce teknik zorluklar doğurmuştur: yüksek ma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir. Bu makalenin hazırlanmasında yapay zeka tabanlı araçlar kullanılmamıştır.

Yazar katkıları:

SK, veri kürasyonu, veri analizi, araştırma ve yazıma katkılarında bulundu. CM, veri kürasyonuna katkıda bulundu. PH, veri analizine katkıda bulundu. AV, veri derlemesine katkıda bulundu. VM, kavramsallaştırma, veri küratörlüğü, veri analizi, denetim ve yazıma katkılarında bulundu.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kaliforniya Üniversitesi San Diego Pediatri Bölümü, Alerji, İmmünoloji ve Romatoloji Bölümü ve NIH NIGMS R00GM147841 (MOSAIC K99/R00) ve NCI U54CA272220 (UC San Diego FIRST bursu) tarafından desteklendi. Yazarlar ayrıca orijinal IBEX yöntemini kurduğu için Andrea Radtke'ye teşekkür etmek isterler; bu yöntem olmadan Bex-Plex'i yaratamazdık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

```html

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 ml microcentrifuge tubesBiopioneerMCNT-1.5F
200 proof EtOHFisher ScientificBP28184
20X SSC bufferInvitrogenAM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b AntibodyBiolegend101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e AntibodyInvitrogen58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G AntibodyBiolegend127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 AntibodyBiolegend137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solutionBD554722
Chrome alum gelatinFisherNC1692262
Konfokal mikroskop (örneğin Leica Stellaris)
CryomoldsVWR25608-922
Cryostat (örneğin CryoStar NX50 Cryostat)Thermofisher Scientific957100
Cryostat bıçakları (örneğin Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)Leica Biosystems14035843496
DAPIThermofisher Scientific62248
Diseksiyon mikroskobu (örneğin Zeiss SteREO Discovery.V8)
Diseksiyon aletleri
Kuru buz
Slayt boyama için batırma tankı (örneğin Simport Scientific EasyDip Slayt Boyama Kavanozları)Fisher Scientific 22-038-489
Fluoromount-GFisherOB10001
Isıtmalı su banyosu
Histoloji fırçaları (örneğin Ted Pella Camel Hair Fırçaları)Fisher ScientificNC2023341
Hibridizasyon fırını (örneğin HybEZ II Hibridizasyon Sistemi)ACD321710
Tercih edilen görüntü analiz yazılımı
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP KalemVector LaboratoriesH-4000
Kimwipes VWR21905-026
Lityum borohidürSTREM Chemicals93-0397
Mikropipetler (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Mikrosantrifüj (örneğin Corning LSE Mini Mikrosantrifüj)Corning6770
Mouse BD Fc BlockBD553142
No 1.5 Kapak camıVWR48393-241
Pipet uçları (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Prob, mm-CD274-T7ACD420501-T7
RNAscope HiPlex Prob, mm-IL-10-T6ACD317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (tespit kiti, kesici stok solüsyonu, proteaz reaktifleri, hedef geri alma reaktifleri ve yıkama tamponu içerir)ACD324409
RNAscope Protease IIIACD322337
RNase ZAPMillipore SigmaR2020-250
Simple ITK yazılımı: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slayt boyama tepsi/nem odası
Sükroz BioxtraSigmaS7903-1KG
Superfrost Plus Mikroskop slaytlarıVWR48311-703
Tissue-Tek OCTVWR25608-930
Tween-20, Moleküler Biyoloji sınıfıPromegaH5152
UltraPure DNase/RNase içermeyen suFisher Scientific10977023
```

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  2. Zhao, X., Subramanian, S. Intrinsic resistance of solid tumors to immune checkpoint blockade therapy. Cancer Res. 77 (4), 817-822 (2017).
  3. Bailey, P., et al. Exploiting the neoantigen landscape for immunotherapy of pancreatic ductal adenocarcinoma. Sci Rep. 6 (35848), (2016).
  4. Belli, A., et al. Targeting the microenvironment in solid tumors. Canc Treat Rev. 65 (1), 22-32 (2018).
  5. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautès–Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 14 (1), 717-734 (2017).
  6. Bonaventura, P., et al. Cold tumors: A therapeutic challenge for immunotherapy. Front Immunol. 10 (168), (2019).
  7. Li, J., et al. Tumor cell-intrinsic factors underlie heterogeneity of immune cell infiltration and response to immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
  8. Tokunaga, R., et al. CXCL9, CXCL10, CXCL11/CXCR3 axis for immune activation - A target for novel cancer therapy. Cancer Treat Rev. 63 (1), 40-47 (2018).
  9. Halama, N., et al. Tumoral immune cell exploitation in colorectal cancer metastases can be targeted effectively by anti-CCR5 therapy in cancer patients. Cancer Cell. 29 (1), 587-601 (2016).
  10. Kawasaki, K., et al. PD-L1-expressing cancer-associated fibroblasts induce tumor immunosuppression and contribute to poor clinical outcome in esophageal cancer. Cancer Immunol Immunother. 72 (11), 3787-3802 (2023).
  11. Lee, C. Y. C., McCaffrey, J., McGovern, D., Clatworthy, M. R. Profiling immune cell tissue niches in the spatial -omics era. J allergy Clin Immunol. 155 (3), 663-677 (2025).
  12. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (1), 378-401 (2022).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  14. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Maltez, V. I., et al. Agonistic anti-CD40 antibody treatment converts resident regulatory T cells into activated type 1 effectors within the tumor microenvironment. Immunity. , (2026).
  17. Ben-Chetrit, N., et al. Integration of whole transcriptome spatial profiling with protein markers. Nat Biotechnol. 41, 788-793 (2023).
  18. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PLoS ONE. 10 (3), e0120120(2015).
  19. Dikshit, A., Zong, H., Anderson, C., Zhang, B., Ma, X. J. Simultaneous visualization of RNA and protein expression in tissue using a combined RNAscope in situ hybridization and immunofluorescence protocol. Methods Mol Biol. 2148, 301-312 (2025).
  20. Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cancer ResearchAllIBEXCancerImagingTumor MicroenvironmentSpatial Transcriptomics
Video yakında

İlgili makaleler