Bex-Plex, sağlam dokunun derin mekansal profillenmesi için protein belirteçleri ve ribonüklein asit transkriptlerinin eşzamanlı görselleştirilmesini sağlar

Summary

Burada, yüksek çözünürlüklü mekansal profilleme uygulamaları için sağlam sabit donmuş dokuların derin mekansal fenotiplenmesi amacıyla, iteratif protein boyama (IBEX) ile RNAscope in situ hibridizasyon teknolojisini birleştirme protokolünü sunuyoruz.

Abstract

Burada, sağlam dokularda tek hücre çözünürlükte protein ve ribonüklein asit (RNA) belirteçlerinin eşzamanlı mekansal profillenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Katı tümör kanserleriyle ilgili temel sorunlardan biri, hastaların terapötik müdahaleye yanıt vermesini öngörememektir. Bu karmaşıklıkları çözmek, sağlam dokular içindeki hücresel davranışların, etkileşimlerin ve fenotiplerin nicel ölçümünü gerektirir. Özellikle, proteom ve transkriptom, rasyonel immünoterapi tasarımı için kritik olabilecek örtüşen ancak tekrarsız bilgi sağlar. Ancak, tümör mikro ortamındaki tüm hücrelerin transkripsiyonel ve fonksiyonel durumunu derinlemesine profil ederken kritik mekansal lokalizasyon bilgilerini korumanın şu anda basit ve maliyet etkin bir yolu yoktur. Bu amaçla, IBEX (yinelemeli ağartma çokluğu genişletir) platformunu HiPlex RNAscope ile başarıyla birleştirerek aynı anda yüksek plex protein belirteçlerini ve yüksek plex ribonüklein asit (RNA) transkriptlerini tek hücre çözünürlüklü görselleştirdik. Bu yaklaşım, nükleer morfolojiyi korumak ve döngüler arasında doğru görüntü hizasını sağlamak için modifiye edilmiş bir RNA hedef alım adımını içerir. "Bex-Plex", sabit donmuş dokularda değiştirilmemiş bir IBEX protokolü ve ardından HiPlex RNAscope protokolünü uygulamamıza olanak tanır; bu protokolde IBEX döngüleriyle nükleer seviyede hizalanmayı sağlamak için modifiye edilmiş bir RNA hedef alımı kullanıyoruz. Bu protokol, sabit donmuş dokular için optimize edilmiştir ve transkripsiyonel ve fonksiyonel hücresel durumların entegre mekansal analizini sağlar. Bu tek hücre düzeyinde profil oluşturma gücü, doku hakkında derin bir bilgi kaynağı sağlamakla kalmaz, aynı zamanda terapötik yanıt vermeyi sağlayan incelikli hücresel etkileşimler hakkında tahminleri güçlendirir ve tümör mikro ortamlarında ve ilgili sistemlerde mekânsal biyolojiyi incelemek için bir çerçeve sağlar.

Introduction

2011'de tanıtılmasından bu yana, PDL-1 ve CTLA-4 gibi inhibitör bağışıklık kontrol noktası moleküllerini engelleyerek sitotoksik T hücrelerinin baskılanmasını azaltan kanser immünoterapileri, katı tümör tedavisinde altın standart olarak ortaya^{çıkmıştır.} Ancak, hastalarda yaygın kullanıma rağmen, bu ilaçların klinik etkileri büyük ölçüde değişir çünkü birçok katı tümör kanseri bu tedavilerle birlikte içsel olarak ortaya çıkar veya sonunda direnç oluşturur². Birçok durumda bu, aynı kanser^{tip 3} arasında bile katı tümörlerin aşırı heterojen doğasından kaynaklanır. Katı tümörlerde meydana gelen hücre ilişkilerinin daha derinlemesine anlaşılması, tedavi yöntemlerinin iyileştirilmesini sağlamanın anahtarıdır. Bu nedenle, bu direnci güçlendiren ve sürdüren kesin mekanizmaları ve etkileşimleri belirlemek kanser araştırmalarının ön saflarındadır. Burada, sağlam dokularda protein ve RNA ekspresyonunun entegre mekansal analizini mümkün kılan ve bu karmaşık hücresel etkileşimleri daha iyi karakterize etmeyi amaçlayan bir yöntem geliştirmeyi hedefledik.

Tümör mikro ortamı (TME), tümör büyümesini ve bağışıklık yanıtını şekillendiren kanser olmayan hücresel ve yapısal bileşenlerden oluşur; bunlar arasında kanserle ilişkili fibroblastlar, sızan bağışıklık hücreleri, damar bileşenleri ve ekstraselüler^{matriks 4} bulunur. Son zamanlarda, TME'nin bileşimi ve organizasyonunun, tümörlerin immün infiltrasyonuna izin vericiliğini veya dirençli olup olmadığını güçlü şekilde etkilediği ortaya çıktı; bu, immünoterapiye yanıt vermeyi belirleyen ana^{faktörlerden biridir 5}. Birçok kanserde, düşük sayıda T hücresi ve yüksek immünosupresif miyeloid popülasyonların varlığıyla karakterize edilen "bağışıklık çölü" fenotipi, kontrol noktası blokaj tedavilerine kötü yanıt verme ile^{ilişkilidir 6,7}. Kemokin sinyalasyonu, bu işe alım dinamiklerinin çoğunu yönetir. Örneğin, CXCL1 ve CCL2 immünosupresif miyeloid hücreleri çekerken, CXCR3-CXCL9/CXCl10 ekseni hem sitotoksik hem de düzenleyici T hücrelerini^{tümör 8'e} atar. Sonuç olarak, nişe özgü sinyal ortamı hücre fenotipini ve işlevini güçlü şekilde etkileyebilir. Örneğin, kolorektal kanser hastalarında CCL5-CCR5 ekseni tümör ilişkili makrofajların (TAM) baskılayıcı fonksiyonunu kontrol eder ve bu sinyali engellemek, TAM'ı anti-tümörjenik fenotipe doğru yönlendirir ve klinik yanıtların iyileşmesiyle^{korelasyon gösterir 9}. Ayrıca, bağışıklık hücreleri, kanserle ilişkili fibroblastlar ve/veya tümör hücreleri arasında ICAM ve PDL-1 yoluyla doğrudan etkileşimler, bağışıklık tükenmesini tetikleyebilir ve antitümör bağışıklığını küçümseebilir^. Bu bulgular birlikte, TME'nin terapötik etkinliği nasıl etkilediğini anlamak için mekânsal olarak çözülmüş analizlerin önemini vurgular.

İmmünoffloresan (IF) görüntüleme, dokuda protein ekspresyonunu ve hücre-hücre etkileşimlerini görselleştirmek için temel bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Alan, geleneksel 3-4 renkli IF'den, yinelemeli boyama ve görüntülemeye dayanan yüksek içerikli görüntüleme iş akışlarına doğru ilerledi. Bu yöntemlerde, büyük veri setleri antikor etiketleme, görüntüleme ve florofor inaktivasyonu veya çıkarılması döngüleriyle oluşturulur; böylece ek işaretleyiciler boyanabilir ve^{görüntülenebilir. 11}. Iterative Bleaching Extend Multiplexity (IBEX), yakın zamanda kullanıcı dostu ve maliyet etkin bir yinelemeli görüntüleme^{platformu olarak tanıtıldı 12}. Ticari antikorlar ve konvansiyonel mikroskopların kullanımıyla uyumlu olan IBEX, en yaygın kullanılan boyaların floresansını söndürmek için lityum borohidrit (LiBH₄) kullanır ve doku epitoplarına zarar vermeden bu da tek bir doku için 75 parametreye kadar alınmasına olanak^{tanır 13}. Bu döngüsel boyamadan elde edilen görüntüler, SimpleITK açık kaynak yazılımı kullanılarak hizalanarak yüksek boyutlu mekansal analizler için uygun bileşik veri setleri oluşturulur.

Protein düzeyinde fenotiplemeye tamamlayıcı olan mekansal transkriptomik yöntemler, hücrelerin doğal ortamlarındaki transkripsiyonel durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Özellikle, yerinde hibritleşme (ISH), belirli bir dokuda DNA veya RNA dizilerinin lokalizasyonunu tanımlamak için popüler bir^{tekniktir 11}. RNAscope, benzersiz bir Z kimyasına sahip probları kullanarak RNA transkriptlerini tek molekül çözünürlükte özel olarak güçlendiren ve birçok farklı örnek tipiyle uyumlu olan iyi köklü bir ISH^{yaklaşımıdır 14}. Gelişmiş Hücre Tanılaması (ACD) aracılığıyla yaygın olarak benimsenen ve ticari olarak erişilebilir bir platform olarak, RNAscope çok çeşitli hedeflere karşı doğrulanmış problar sunarak çeşitli uygulamalar için deneysel tasarımı basitleştirir.

Hücre kimliği ve işlevlerine dair daha kapsamlı bir görüş, aynı doku içinde protein ve RNA algılamalarının birleştirilmesiyle elde edilebilir. Sitokinler ve kemokinler gibi kısa ömürlü salgılanan proteinler geleneksel olarak IHC ile güvenilir antikor boyamalarına sahip değildir, ancak ekspresyonları hakkında bilgi mRNA transkriptlerinin nicelendirilmesiyle elde edilebilir. Geleneksel kromojenik IHC veya TSA-OPAL gibi önceki RNA ve proteini birlikte algılama girişimleri, doğrusal olmayan sinyal amplifikasyonu ve zaman alıcı antijen toplama protokolleriyle^{sınırlandırılmıştır 15}. Bu yaklaşımlara kıyasla, Bex-Plex yöntemi yüksek pleksli protein ve RNA algılanmasını sağlarken, mekansal bağlamı ve nükleer morfolojiyi korurken doğru görüntü kaydı sağlar.

Burada, hücrelerin doğal dokularındaki transkripsiyonel ve translasyonel durumlarının eşzamanlı ve ölçülebilir karakterizasyonu için IBEX ve RNAscope platformlarını entegre eden "Bex-Plex" protokolünü sunuyoruz. Bex-Plex'te, sabit OCT gömülü dokular standart IBEX protokolünden geçer ve ardından biraz değiştirilmiş bir RNAscope HiPlex iş akışı uygulanır; burada hedef alım 60°C'de ve 1 saat kuluçka süresi ile gerçekleştirilir; orijinal 99°C kuluçka süresi ise 5 dakika sürer. Bu, çekirdeklerin mimarisini korur ve IF ve ISH döngülerinden ayrı görüntüler bir arada kaydedilirken fiducial marker'ların doğru hizalanmasını sağlar. Bu protokol, özellikle doku erişimi sınırlı olduğunda veya mekânsal mimarinin korunması kritik olduğunda, örneğin tümör mikroçevre analizi veya bağışıklık profilleme çalışmalarında olduğu gibi, sağlam dokularda protein ve RNA ekspresyonunun eşzamanlı mekansal analizini gerektiren çalışmalar için en uygundur.

Yaygın olarak erişilebilen reaktifler ve çoğu görüntüleme platformuyla uyumlu olan Bex-Plex, floresan görüntülemeye aşina olan ve geleneksel bir mikroskopa erişimi olan herhangi bir teknik eğitimli araştırma personeli tarafından gerçekleştirilebilir. Burada sunulan protokol, sabit donmuş örnekler için optimize edilmiştir. Şu anda protokol sabit donmuş dokularda doğrulanmış olup, FFPE veya insan klinik örnekleri gibi diğer örnek türlerine uygulanması için daha fazla optimizasyon gerekebilir.

Bu iş akışı, doku sınırlı veya değerli olduğu herhangi bir bağlamda, örneğin doku biyopsileri veya sınırlı örnek büyüklüğüne sahip hayvan deneyleri gibi, ayrıca dissosiyatif tekniklerle çıkarılması zor olabilecek hücrelerin fenotiplenmesi için de paha biçilmezdir. Bex-Plex, tek hücrelerin transkripsiyonel ve translasyonel profilleri hakkında eşzamanlı ve ölçülebilir bilgiler sunarken, mekansal bağlamlarını korurken, hücreler arasındaki ilişkiler ve çapraz konuşma konusundaki soruları yanıtlamaya benzersiz şekilde hazır verilerdir.

Protocol

Bu protokolde belirtilen prosedürler, Kaliforniya Üniversitesi, San Diego Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (protokol numarası S24049). Bu deneyler için C57BL/6 genetik geçmişe sahip ve belirli patojensiz koşullarda barındırılan 7-12 haftalık erkek ve dişi fareler kullanıldı.

1. Doku hazırlığı

1. Deneysel fareleri onaylanmış birincil ve ikincil önlemlerle (örneğin CO₂ ötenazi ve servikal dislokasyon) ötenazi yapın ve ilgi çeken dokuları takviye ortamına alın.
2. %4 paraformaldehit (PFA) stok çözeltisini %0,5 veya %1 PFA ile 1X PBS olarak seyreltirerek yeni bir doku fiksator stoku hazırlayın. Lenf düğümleri gibi düşük hacimli dokular için %0,5 PFA, tümörler gibi yüksek hacimli dokular için %1 PFA kullanın.
   DIKKAT: Paraformaldehit yutulduğunda yanıcı ve toksiktir. Uygun PPE ile ele alın ve cilt veya gözlerle temas etmekten kaçının.
3. Dokuları, her kuyu başına 2 mL fiksatif olan 24 kuyruklu bir plakaya aktarın ve gece boyunca 4°C'de kuluçka yapın.
   Not: 16 saatten fazla kuluçka süreleri aşırı fiksasyon sorunlarına yol açabilir.
4. Yeni 24 kuyruklu plakanın kuyularını 1X PBS ile doldurun ve dokuları fiksatif plakadan aktarın.
   Duraklama noktası: Gerekirse, dokular 1X PBS olarak 4°C'de 7 güne kadar saklanabilir.
5. Fazla yağı/kalıntıyı bir diseksiyon dürbünü ve aletlerle birer tek tek temizleyin. Kesme sırasında doku susuzluğunu önlemek için dokuya doğrudan küçük bir hacimde 1X PBS ekleyin.
6. 1X PBS ile toz halindeki sakaroz stokunu seyreltirerek %30 w/v sucrose çözeltisi hazırlayın.
7. Dokuları 24 kuyruklu bir plakaya aktarın, her kuyuda 2 mL %30 sukroz bulunuyor ve gece boyunca 4°C'de kuluçka yapın. Kuyular kuyunun dibine battığında yeterince kurutulmuş olur.
8. Etiketli kriyokalıpları OCT ile doldurun ve dokuları kalıplara teker teker yerleştirin. Doku yönelimi kökenine bağlı olacak, ancak standart önerimiz en büyük yüzey alanının kriyomold tabanla paralel olması olur. Dokuların tamamen OCT'ye batırıldığından emin olun.
9. Kuru buzun üzerinde 10 dakika dondurulacak şekilde koyun ve -80°C'de sakla.

2. Doku kesitleri

Not: Bu protokol için kullanılan tüm reaktifler ve laboratuvar materyalleri RNase içermemelidir. Kaydıraklarla çalışırken kontaminasyonu önlemeye özen gösterin.

1. RNase serbest mikroskop slaytlarını 15 μL krom alüm yapıştırıcıyla örtüp fırında 60°C'de 1 saat kuluçka için. Krom alum kaplamalı slaytlar, kullanımdan önce RT (oda sıcaklığı) altında bir aya kadar saklanabilir.
2. OCT gömülü dokuları -80°C dondurucudan çıkarıp -20°C kriyostat/kriyotomda en az 20 dakika denge sağlamak için koyun.
3. Dokuları krom alümin kaplı slaytlara kesin, 10–15 μm kalınlığında kesin.
4. Kesilmiş kesitli slaytları 4°C'de saklayabilir veya aynı gün boyama yapılırsa sürgülerin RT ile dengelenmesine izin verin. Kesitli slaytlar 4°C'de kullanımdan önce 5 güne kadar saklanabilir.

3. Protein boyama

1. Bir dunk tankında, sürgü üzerinde 5 dakika boyunca RNase içermeyen 1X PBS ile boyanacak şekilde ıslatın, böylece fazla OCT dokulardan alınır.
2. Kaydıraktaki dokuların etrafına kutuları hidrofobik bariyer kalemi çizip 2 dakika kurut.
3. RNaz-free 1X PBS içinde 10 μg·mL⁻¹ anti-fare FC reseptör bloğundan oluşan bir bloklama çözeltisi hazırlayın. Bloklama tamponunu slayttaki örneklere ekleyin; dokuyu tamamen kaplayan bir baloncuk oluşturmak için yeterli miktarda kullanın (100–150 μL·^kesit-1).
   Not: Bazen zor dokular ve/veya işaretleyiciler için bloklama tamponu için FBS veya BSA (genellikle %1–2) eklenmesi gerekir.
4. Sürgüleri RT'de nemli bir boyama kutusunda 1 saat kuluçka edin, sonra RNase içermeyen 1X PBS dolu bir dunk tankında tamamen batırılarak 5 dakika boyunca yıkayın.
5. Birincil antikor boyama çözeltisini RNase-free 1X PBS ile hazırlayın, doku kesiti başına 100-200 μL olarak planlayın. Standart antikor seyreltmeleri 1:50-1:200 arasında değişir, ancak belirli bir antikor ve/veya doku tipi için en iyi seyrelme faktörünü belirlemek amacıyla tek boyalı titrasyonlar yapılması tavsiye edilir. Vorteks ve pulse, antikorları pipetlemeden önce döndürerek floresan agregaları önler.
6. Yıkamadan slaytları çıkarın ve antikor çözeltisinin seyreltilmesini önlemek için numune kutularının köşesindeki fazla sıvıyı emici bir iş mendiliyle nazikçe emeli.
7. Antikor çözeltisini bloklayıcı çözeltiyle aynı şekilde uygulayın, doku üzerinde bir baloncuk oluşturun.
8. Kaydırakları yatay olarak 37°C fırına yerleştirin ve 1 saat kuluçka yapın. Alternatif olarak, slaytları RT rejiminde nemli bir kutuda 3–4 saat kuluçka yapın. İstenilen doku için zaten optimize edilmiş standart IF protokolleri kullanılabilir. Susuz kalmayı önlemek için kuluçka sırasında kaydırakları nemli bir ortamda bulundurun. (örneğin, boyama tepsisinin altına ıslak bir kağıt havlu kullanın).
9. Slaytları RNase-free 1X PBS'ye daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın. Boyama paneliniz için gerekirse, bu süre içinde RNase-içermeyen 1X PBS ile ikincil bir antikor boyama çözeltisi hazırlayın. Standart antikor seyreltmeleri 1:500-1:1000 arasında değişir, ancak belirli bir antikor ve/veya doku tipi için en iyi seyreltme faktörünü belirlemek amacıyla tek boyalı titrasyon yapılması tavsiye edilir.
10. Fazla PBS'yi slaytlardan emici bir silme ile emin ve her doku bölümüne 100–200 μL ikincil antikor boyama çözeltisi ekleyin. Sürgüleri yatay olarak 37°C sıcaklıkta fırına yerleştirin ve 30 dakika kuluçka yapın. Alternatif olarak, slaytlar nemli bir kutuda 1–2 saat boyunca RT olarak boyanabilir.
11. Slaytları 1X RNase-free PBS'ye batırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda üç yıkama için iki kez tekrarlayın.
12. DAPI nükleer boyasını RNaz-free 1X PBS içinde son konsantrasyona 0,2 μg·mL⁻^1'e kadar seyreldin ve her doku bölümüne 100–200 μL ekleyin.
13. Slaytları nemli bir kutuda RT'de 10 dakika kuluçka yapın, sonra RNase içermeyen 1X PBS'ye daldırarak ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak bir kez yıkayın.
14. Fazla sıvıyı slaytlardan emici bir silme ile emin ve her bölüme 20–30 μL sulu bazlı antiifade montaj ortamı ekleyin. Kaydıra dikkatlice bir kapak koyun, kabarcıkları en aza indirdiğinizden emin olun ve montaj malzemesinin 15–30 dakika boyunca kürlenmesine izin verin.
15. Lekelenmiş slaytları hayal edin. IBEX için panel tasarımı ve görüntü edinimi konusundaki daha ayrıntılı açıklama için orijinal yayımlanmış IBEX^protokolleri 12,13'e bakınız.
    Duraklama noktası: Monte edilmiş kaydırakları karanlıkta 4°C'de 3 güne kadar saklayabilirsiniz, ancak minimum RNA bozulması için hemen ilerlemenizi öneririz.

4. Florofor ağartma ve yinelemeli protein boyama

1. Kaydırakları RNase-free 1X PBS'ye batırın, ta ki kapak kayması kuvvet uygulanmadan kolayca kayana kadar. Coverslip'in ne kadar süre monte edildiğine bağlı olarak bu 16 saate kadar sürebilir.
2. Slaytlar ıslanmışken, RNase-free DI H₂O içinde 1 mg·mL^⁻1 LiBH₄ çözeltisi hazırlayın; tamamen çözünene kadar nazikçe karıştırın ve 10 dakika sonra aktive olmasını bekleyin. Aktivasyon, çözeltide baloncuklar bulunduğunda ve aktivite 4 saate kadar sürdüğünde gerçekleşir.
   Dikkat: LiBH₄ suya reaktiftir, toz halindeki stokun neme aşırı maruz bırakılmasından kaçının ve atıkları uygun şekilde bertaraf edin.
3. Slaytları RNase-içermeyen 1X PBS ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayarak montaj ortamı kalıntılarını giderin, ardından her dokuya 100–150 μL_{LiBH 4} çözeltisi pipetlenin. Nemli bir kutuda 15 dakika kuluçka yapın.
   Not: Boyama için kullanılan floroforlara bağlı olarak, bu kuluçka süresinin uzatılması gerekebilir (IBEX yöntemleri makalelerinde ayrıntılı olarak ele alınmıştır)^12,13.
4. Slaytları bir kez yıkayarak RNase-free 1X PBS'ye daldırıp kısa bir süre yukarı aşağı daldır.
5. Slaytları ek protein belirteçleriyle boyamaya devam edin ve 3.5-3.15 adımlarını izleyin. Nükleer boyanın yeniden boyalmasına gerek yoktur çünkü LiBH₄ ile ağartmaz. Gerekirse protein boyama işlemi tekrarlanın.
   Duraklama noktası: Monte edilmiş slaytlar, son protein/IBEX döngüsü ağartmadan ve RNA'ya geçmeden önce gece boyunca 4°C'de saklanabilir.
6. Son döngüdeki floroforları ağarttıktan sonra hemen RNAscope HiPlex'e geçin. Standart IBEX'in altı döngüsü doku veya epitop kaybı olmadan gerçekleştirilmiş olmasına rağmen, bu protokol için protein boyamanın üç döngüden fazla olmasını önermiyoruz; çünkü RNA transkript kalitesinin uzun sürelerde düşme potansiyeli vardır.

5. RNAscope HiPlex için slayt hazırlığı

1. Kaydırakları tamamen RNase-free 1X PBS içine batırın, ta ki örtü kayması kuvvet uygulanmadan kolayca kayana kadar. Coverslip'in ne kadar süre monte edildiğine bağlı olarak bu 16 saate kadar sürebilir. Montaj ortamı kalıntılarını çıkarmak için RNase içermeyen 1X PBS ile 2 dakika boyunca bir kez yıkayın.
2. 200 mL %50 etanol, 200 mL %70 etanol ve 400 mL %100 etanol hazırlayın.
3. Hibritizasyon fırınını açın ve 60°C'ye ayarlayın. 10X Hedef Geri Alma Reaktifini RNase-içermeyen DI_{H 2O}içinde 1X çalışan stokla seyreldin ve 5.8. adıma kadar fırına koyarak önceden ısıtın.
   Not: Hedef alım reaktifini önceden 60°C'ye ısıtmamak, ayrı döngülerden alınan görüntülerin aşağı akış kaydını etkiler. Hedef geri alma reaktifi, toplama adımı boyunca 60°C sıcaklıkta kalmalıdır.
4. Slaytları %50 etanole batırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
5. Slaytları %50 etanolden çıkarın ve %70 etanol'e daldırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın.
6. Slaytları %70 etanolden çıkarın ve %100 etanole daldırın. RT'de 5 dakika kuluçka yapın ve taze %100 etanol ile tekrarlayın.
7. Slaytları %100 etanolden çıkarın ve RT'de 5 dakika kurumasına izin verin.
8. Her doku bölümüne 100–150 μL 60°C 1X Hedef Geri Alma Reaktifi eklenin ve slaytları hibridizasyon fırınına yerleştirin. 60°C'de 1 saat kuluçka yapın.
9. Slaytları çıkarın ve RNase-free DI H2O'ya batırarak 15 saniye durulayın. Bu sırada, fırında ayarlanmış sıcaklığı 40°C'ye ayarlayın.
10. Slaytları %100 etanole aktarın ve 5 dakika kuluçkalayın, ardından RT'de en az 5 dakika kurutun.
11. Proteaz III'ü slaytlara uygulayın, doku kesitlerine 1–2 damla. Slaytları hibritizasyon fırınına yerleştirin ve 40°C'de 30 dakika kuluçka yapın.
12. Kaydırakları RNase-free DI_{H 2}O ile batırın ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak yıkayın. Taze damıtılmış suyla tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.

6. RNA koskobu reaktif hazırlığı ve prob hibridizasyonu

1. RNAscope HiPlex prob stoklarını ve HiPlex prob seyrelticini fırında veya su banyosunda 10 dakika boyunca 40°C'ye ısıtarak hazırlayın.
2. Kısa bir süreliğine tüm 50X sonda stoklarını aşağı indirin. Her benzersiz hedef probu RNAscope Prob Syuduceri ile 1X seviyesinde seyreltileyerek çalışan bir prob karışımı hazırlayın. Her doku başına 50–100 μL prob karışımı kullanmayı ve kullanmadan önce vortexing ile iyi karıştırmayı planlayın. RNAscope HiPlex protokolü, 4 probdan oluşan 3 çevrime kadar (toplamda 12 prob ve T1-12 olarak gösterilen) barındırabilir. Prob tasarımı hakkında rehberlik için, orijinal yayımlanmış RNAscope^{protokolü 14'e} başvurun.
3. RNAscope HiPlex Amp 1–3 ve HiPlex Fluoro T1-T4 reaktiflerini RT konumuna yerleştirerek denge sağlanır.
4. Proteaz III ile işlenmiş slaytları alın ve her doku bölümüne 50–100 μL prob karışımı pipet yapın. Hibritizasyon fırınına yatay olarak yerleştirin ve 40°C'de 2 saat kuluçka yapın.
5. Slaytları tamamen 1X Wash tamponuna 2 dakika batırarak yıkayın. Taze tampon ile tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.
   Duraklama noktası: Slaytlar, ACD'nin RNAscope protokolünde tanımlandığı gibi RT'de 5X SSC tamponunda gece boyunca saklanabilir. Bu duraklama noktası kullanılırsa, ertesi sabah 1X yıkama tamponunda iki 2 dakikalık yıkama gerekeceğini unutmayın.

7. Prob amplifikasyonu

Not: Slaytlara uygulamadan önce tüm reaktiflerin RT ile dengelendiğinden emin olun.

1. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp1 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
2. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp2 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
3. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Amp3 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
4. Slaytlara 1–2 damla HiPlex Fluoro T1-T4 reaktifi ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 15 dakika boyunca kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
5. Her doku bölümüne 3–4 damla HiPlex DAPI reaktifi ekleyin ve RT'de 1 dakika kuluçka yapın.
6. DAPI'yi emici bir silme ile sıvıyı sürgülerden çekip çıkarabilirsiniz. Her bölüme hemen 100 μL sulu tabanlı antiifade montaj ortamı (IBEX boyama aşamalarında kullanılanla aynı olabilir) ekleyin. Kaydıra dikkatlice bir örtü yerleştirin, köpükleri en aza indirdiğinizden emin olun ve montaj malzemesinin 15–30 dakika kurumasına izin verin.
7. Görüntülemeye geçin.
   Duraklama noktası: Monte edilmiş kaydıraklar karanlıkta 4°C sıcaklıkta 3 güne kadar saklanabilir, ancak minimum RNA bozulması için hızlı ilerlemenizi öneririz.

8. Flüoforların bölünmesi ve yinelemeli RNA hibridizasyonu

1. Kaydıraklardan kapak kaymalarını çıkarmak için, RT'de en az 30 dakika 4X SSC tamponunda bekletin. Sürgüleri tamamen taze 4X SSC tamponuna batırarak ve kısa bir süre yukarı aşağı daldırarak bir kez yıkayın.
2. Taze bir ampul kısıtlama çözeltisi açın ve 4X SSC tamponu ile seyreltilerek %10 çalışkan stok yapın.
3. Slaytları nemli bir kutuya yerleştirin ve %10 parçalama çözeltisinden 3–4 damla ekleyin. RT'de 15 dakika kuluçka yapın, ardından slaytları tamamen %0,5 PBST'ye batırarak 2 dakika yıkayın. Taze PBST ile tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın.
4. RNA panelinin görüntüleme döngüsü 2'ye devam etmek için, HiPlex Fluoro T5-T8 reaktifini RT ile dengeleyin.
5. Hibritizasyon fırınını açın ve sıcaklığı 40°C'ye ayarlayın.
6. HiPlex Fluoro T5-T8 reaktifini slaytlara ekleyin ve hibritizasyon fırınında 40°C'de 15 dakika kuluçka yapın. Slaytları tamamen 1X Wash tampona daldırarak 2 dakika boyunca yıkayın. Toplamda 2 yıkama için tekrarlayın.
7. Sürgülerden fazla sıvıyı dikkatlice emeli. Her bölüme hemen 100 μL montaj ortamı ekleyin ve kaydırağa dikkatlice bir kapak yerleştirin. Montaj ortamını 15–30 dakika kurutsun ve görüntülemeye geçin.
8. HiPlex Fluoro T9-T12 reaktifiyle 8.1–8.7 adımlarını tutarsa toplamda 3 RNA çevrimi için tekrarlayın. RNAscope HiPlex protokolü ile 3 döngü mümkün olsa da, bu protokolle protein boyama için gereken ek zamanın RNA kalitesini etkileyebileceğini unutmayın. Bu nedenle, hedeflenen belirli transkriptlere bağlı olarak 3 döngü her zaman mümkün olmayabilir.

9. Görüntü İşleme

1. Her turdan ham dosyaları ayrı ayrı işliyor ve arka plan çıkarma ayarları, yumuşatıcı filtreler ve kayıt dönüşüm türü gibi tutarlı parametrelerle görüntü işleme gerçekleştir. Kanallar tutarlı bir ayırıcı karakterle adlandırılmalıdır (örneğin Döngü 1: CD45 AF532, burada ":" döngü ile işaretleyici/flor arasındaki ayrımı gösterir).
2. SimpleITK yazılımını (https://github.com/niaid/sitk-ibex) başlatın ve SimpleITK > Imaris uzantılarına tıklayın > ortak kanal kullanarak z-stack'in Affine kaydı.
3. Her çoklu döngüden bir görüntü dosyası yükleyin ve tüm adlandırılmış kanallar için ayırıcı karakteri girin (örneğin ":").
4. Görüntü kaydı için kullanılacak kanalı ve diğer tüm görüntülerin hizalanacağı sabit görüntüyü seçin. DAPI'nin fiducial belirteç olarak kullanılması önerilir, ancak tüm döngüler arasında herhangi bir ortak adlandırılmış kanal kullanılabilir.
5. "Register" ve ardından "Yeniden örnekle ve birleşik görüntüyü kaydet" seçeneğine tıklayın.
6. Seçtiğiniz yazılımla sonraki analizlere devam edin. Görüntü işleme ve kayıt hakkında daha fazla bilgi için orijinal IBEX^protokolü 12,13'e başvurun.

Results

Şekil 1 : Bex-Plex iş akışına genel bakışı.
Krom alum kaplamalı slaytlara kesimlendirilen sabit donmuş dokular, standart IBEX'in 3 döngüsüne kadar uygulanır, ardından ilk hedef geri alma adımı 60°C'de 1 saat boyunca gerçekleştirilir. Ayrı döngülerden gelen görüntüler, daha sonra bir fiducial işaretleyici (örneğin DAPI) kullanılarak kaydedilir ve hizalanarak aşağıya doğru analiz için çoklu veri seti oluşturulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yukarıda açıklanan protokolü, bir fare pankreas kanaltal adenokarsinom (PDAC) modelinin tümör mikro ortamını (TME) profillemek için kullandık (Şekil 1). Kras^LSL-G12D/+'dan izole edilmiş bir tümör hattı; Trp53^L/+; Pdx1-Cre; Pankreas kanseri gelişen ve insan PDAC'sının birçok temel özelliğini tekrarlayan Rosa26 YFP/YFP (KPCY) fareleri, C57BL/6^{farelerinin yan kısmına} deri altı enjekte edilmiştir 7. Tümör taşıyan fareler, implantasyondan sonraki 10. gün uygulanan ^anti-PD-1 (örneğin 200 μg•^mouse-1, RMP1-14) ve anti-CTLA-4 (i.p., 200 μg•^mouse-1, 9H10) kombinasyonlu immünoterapiyle tedavi edildi; implantasyon sonrası 10. gün uygulandı ve deney son noktasına kadar her 3 günde bir devam etti. Agonistik anti-CD40 (i.p., 100 μg•^mouse-1, FGK45) implantasyondan sonraki 13. gün tek doz olarak verildi. Birlikte, daha önce yayımlandığı gibi buna "FPC" diyoruz7,16. Deneysel grup başına üç tümör implantasyondan 16 gün sonra toplandı ve Bex-Plex için sabit-donmuş bölümler krom alümin kaplamalı slaytlara monte edildi.

Şekil 2: Temsilci IBEX + RNAscope (Bex-Plex) sonuçları.
(A) Pankreas kanaltal adenokarsinom (PDAC) tümör kesitlerinde birleşik IBEX ve RNA boyama, protein ve RNA hedeflerinin birlikte algılanmasını ve floresan kanallarının hizalanmasını gösterir. Ölçek çubuğu, 10 μm. (B) T hücresi (CD3+ CD11b-), makrofaj (CD11b+ CD68+) ve miyeloid (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) bağışıklık bölmelerinin protein belirtücü kanal yoğunluklarına göre nicelenmesi. Grafikler, tedavi grubuna göre her hücre tipinin ortalama hücre yoğunluğunu gösterir, n=3 tümör. (C) Daha önce protein tarafından tanımlanmış bağışıklık bölmelerinde Pdl1 ve Il10 transkript eksprese eden hücrelerin nicelendirilmesi. Grafikler, tedavi grubuna göre ortalama hücre yoğunluğunu gösterir, n=3 tümör. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tedavi grupları arasında miyeloid soy hücreleri üzerindeki etkileri değerlendirmek için üç FPC ile tedavi edilen tümör ve üç izotip ile tedavi edilen tümör üzerinde bir protein boyama döngüsü gerçekleştirildi. Yedi parametre alındı, ancak burada üç ilgi çekici göstergeye odaklanıyoruz: CD11b, Ly6G ve CD68 (Şekil 2A). Görüntü alındıktan sonra, protein boyamasından elde edilen floroforlar beyazlaştırıldı ve Il10 ile Pdl1 ile problarla bir tur RNA yapıldı (Şekil 2A). Ayrı görüntüler daha sonra DAPI ile hizalanmıştır (Şekil 2A). CD11b, CD68, Ly6G ve CD3'ün nicel ortalama floresans yoğunluğu, FPC ile tedavi edilen tümörlerde kontrol bölgelerine göre daha az makrofaj ve miyeloid hücre eğilimi göstermiştir (Şekil 2B). Tüm örnekler üzerinde nicel karşılaştırmalar yapılmış ve veriler ortalama değerler olarak sunulmuştur. Ayrıca, hem makrofaj hem de miyeloid bölmelerde Pdl1, Il10 veya her iki transkriptin kombinasyonunu ifade eden hücre sayısı, FPC tedavisinde kontrollere kıyasla azalma eğilimi göstermiştir (Şekil 2C). Bu sonuçlar, tedavi sonrası immünosupresif hücre popülasyonlarında potansiyel bir azalma olduğunu ve beklenen biyolojik yanıtlarla uyumlu olduğunu göstermektedir.

Şekil 3: Nükleer koruma için hedef geri alma koşullarının optimizasyonu.
(A) RT hedef geri alımından sonra nükleer şişlik ve belirsiz morfolojiyi gösteren bir dokunun temsil görüntüsü. Nükleer boyutlara örnekler sarı konturlarla gösterilmiştir. Ölçek çubuğu, 40 μm. (B) Değiştirilmiş hedef alımından sonra bir dokunun temsil ilü, ayarlanmış sıcaklık koşullarıyla gelişmiş nükleer morfolojiyi göstermektedir. Sarı konturlarla belirtilen nükleer boyut örnekleri. Ölçek çubuğu, 40 μm. (C) RT hedef alımından (önceden ısıtılmış olmayan), 60°C önceden ısıtılmış hedef buluşmasından veya hedef geri alınmayan standart IF koşullarında DAPI tabanlı segmentasyonla belirlenen ortalama nükleer hacm. Grafik çubukları ortalamayı, hata çubukları ise standart sapmayı gösterir. P < 0.0001 ile sıradan tek yönlü ANOVA (yıldızlar istatistiksel anlamlılık eşiğini gösterir); n= her koşul başına 1639 hücre. (D) Görüntü hizalamadan önce ve sonra üç görüntü arasındaki korelasyon puanlarını temsil eden ısı haritaları. Başarılı bir kayıt ile nükleer düzeyde farklılıklar nedeniyle uyum sağlayamayan kayıt için korelasyon puanları gösterilir.

Önemli olarak, Bex-Plex tarif edilen değiştirilmiş hedef alım olmadan yapıldığında, çekirdekler doğru şekilde uygulanan dokudan alınan çekirdeklere kıyasla belirsiz kenarlarla büyümüş görünüyordu (Şekil 3A ve B). Oda sıcaklığında hedef geri alma regenti kullanımı, DAPI boyamasına dayalı ortalama nükleer hacmde, 60°C'ye önceden ısıtılmış reaktifle yapılan hedef alımına kıyasla %33 artışa yol açtı (Şekil 3C). Nükleer hacim ölçümleri, DAPI tabanlı segmentasyon kullanılarak örnekler arasında temsil alanlardan alındı. Ayrıca, bu adım 60°C'de önceden ısıtılmış geri alma reaktifiyle gerçekleştirildiğinde, ortalama nükleer hacmi standart IF boyama sonrası ortalama nükleer hacminden anlamlı şekilde farklı olmamıştır (Şekil 3C). DAPI, görüntü hizalanması için en etkili referans parametresi olduğundan, bu karşılaştırma (Şekil 3), nükleer morfolojiyi korumada değiştirilmiş geri alma parametrelerinin kritik önemini vurgulamaktadır. Doğru görüntü kaydı, farklı döngülerin görüntüleri arasında benzerliği gösteren yaklaşık 1'e yakın hizalama korelasyon puanıyla gösterilir (Şekil 3D, önce ve başarılı olma).

Protokolün başarılı uygulanması, korunan nükleer morfoloji, güçlü ve özgül RNA sinyali ile protein ile RNA kanallarının doğru hizalanmasıyla gösterilir. Buna karşılık, optimal olmayan sonuçlar arasında nükleer bozulma, zayıf veya dağınık RNA sinyali ve görüntüleme döngüleri arasında uyumsuzluk olabilir (Şekil 3D, önce ve başarısız olma). Şekil 3C'de gösterildiği gibi, nükleer morfolojinin protokol boyunca korunması gerekir ve hem nitel hem de nicel olarak görünür olacaktır. Bex-Plex uygulamasından önce, kullanıcılar ilgilendikleri dokular için temel gerçekliği ayrı protein ve RNA boyama yoluyla belirlemelidir. Bu sadece hedef dokular için optimize protein ve RNA boyamalarını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda Bex-Plex için birleştirildiğinde korunması gereken ilgili mekansal desenleri sağlar. Örneğin, CD11b hem CD68 hem de Ly6G ile birlikte kolokalize olur ve hücre zarı ile lokalize bir boyalanma gösterir (Şekil 2A). Bu beklenen bir durumdur, çünkü CD11b bir pan miyeloid hücre belirteçidir ve CD68 ile Ly6G makrofaj ve nötrofil miyeloid alt kümeleri için belirteçlerdir. Başarılı RNA tespiti, bireysel hücrelere lokal olan belirgin nokta sinyallerle karakterize edilirken, optimal olmayan sonuçlar zayıf veya dağınık boyama olarak ortaya çıkabilir. RNA prob sinyali, transkript fonksiyonuna bağlı olarak çekirdek içinde ve çevresinde lokalizasyon göstermelidir. Vimentin gibi yapısal protein belirteçleri, karmaşık dokularda hücre zarlarını ortaya çıkararak transkript lokalizasyonunun hücresel çözünürlüğünü artırmak için dahil edilebilir. Negatif veya kontrol örneklerinde minimum arka plan boyama ve spesifik olmayan prob sinyali olmaması beklenmektedir; bu da hem protein hem de RNA algısının özgüllüğünü doğrular.

Discussion

Bex-Plex iş akışı, yineleyici protein boyama platformu IBEX'i RNAscope in situ hibridizasyonu ile entegre ederek proteinlerin ve RNA transkriptlerinin tek hücre çözünürlükte eşzamanlı olarak tespit edilmesini sağlar. Bu protokolün temel amacı, sağlam dokular içinde protein ve RNA ekspresyonunun entegre mekânsal analizi için tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Aynı dokuda hem protein hem de RNA ekspresyonunu ölçebilme yeteneği daha önce teknik zorluklar doğurmuştur: yüksek maliyetler, karmaşık antijen toplama adımları, sınırlı çoklama kapasitesi, çözünürlük sınırlamaları (tek hücre olmayan), doğrusal olmayan sinyal güçlendirme ve sonraki işleme için kapsamlı biyoinformatik ^{hatlar 17,18,19}. Multiplex immünofluoresans, OPAL/TSA boyama ve mekansal transkriptomik platformları gibi mevcut yaklaşımlara kıyasla, Bex-Plex tekrarlanabilir, nicel ve yüksek plex eşzamanlı tespiti sağlarken, mekansal bağlamı ve nükleer morfolojiyi koruyarak doğru görüntü hizalanması sağlar. Ayrıca, Bex-Plex standart bir laboratuvar ortamında gerçekleştirilebilir ve kolayca işlenebilen tek hücre çözünürlüğünde veri üretir. Bu protokolden yararlanarak, tümör mikro ortamı gibi çeşitli doku bağlamlarında hücre-hücre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde anlamak, daha etkili immünoterapiler geliştirmek ve hastalık durumları arasında hasta sonuçlarını iyileştirmek için hayati olacaktır.

Yöntemimiz, OCT'ye gömülü sabit dokular üzerinde uygulanmakta olup, standart IBEX iş akışını değişiklik yapmadan takip etmektedir; ardından biraz değiştirilmiş bir RNAscope HiPlex protokolü uygulanmaktadır. Önemli bir fark, RNA hibridizasyon iş akışının başındaki hedef-alım adımıdır: üreticinin 5 dakika 99°C yerine 60°C'de 1 saat boyunca geri alma işlemi yapılır. Bu düzenleme, protein ve RNA döngüleri arasında doğru görüntü hizalanması için zorunlu olan nükleer mimariyi korur. Bu protokolün kritik adımları arasında tutarlı hedef alım sıcaklığını korumak, LiBH₄ kullanarak verimli florofor ağartma ve hızlı işleme ve RNase içermeyen reaktiflerin kullanımı yoluyla RNA bozulmasını en aza indirmek yer alır. En önemlisi, 60°C'de önceden ısıtılmış hedef geri alma reaktiflerinin kullanılmasını sağlamak; Bunu yapmamak, kuluçka aşaması değiştirilse bile nükleer şişmeye neden olabilir.

LiBH₄ ile 15 dakikalık kuluçkanın birçok yaygın kullanılan floroforu inaktive etmek için yeterli olduğu gösterilmiştir, ancak tüm Bex-Plex protokolünü çalıştırmadan önce her protein döngüsü için bu sürecin bireysel olarak doğrulanması önerilir. İlk IBEX yayınlarında, tüm IBEX uyumlu floroforların eşit derecede ağartılabilir olmadığı iyi^{tanımlanmıştır 12}. Ayrıca, laboratuvarımız vimentin gibi yüksek bolluklu yapısal belirteçlerin daha uzun ağartma süresi gerektirebileceğini gözlemlemiştir. Kullanılan florofor ve işaretleyici kombinasyonlarının yeterince ağartıcı olacağını doğrulamak, sonraki protein ve RNA döngülerine kalıntı sinyal dökülmesini önlemelidir. IBEX Topluluk sayfası, IBEX uyumlu panel tasarımı için mükemmel kaynaklara sahiptir ve özellikle yeni kullanıcıların üzerindeki yükü azaltmak için antikor etkinliği ve florofor ağartma^{zamanlarını 20} göstererek tasarlanmıştır. Ayrıca, yinelemeli boyama ve ağartma RNA transkript kalitesini etkilememelidir, ancak protein döngülerini mümkün olduğunca hızlı tamamlamak ve zamanla oluşabilecek RNA bozulmasını en aza indirmek için RNAse-free reagentler kullanmak önemlidir. Bunu yapmamak, prob hibritleşmesini etkiler ve özellikle düşük bolluk transkriptlerinde yapılan herhangi bir RNA döngüsünde sinyalin azalmasına yol açar. Protokol sırasında karşılaşılan yaygın sorunlar arasında zayıf RNA sinyali, eksik florofor ağartma ve görüntüleme döngüleri arasında uyumsuzluk bulunur; bunlar, boyama koşullarının ve görüntüleme parametrelerinin optimizasyonuyla azaltılabilir.

Protein boyama ile RNA prob hibridizasyonu arasındaki süreyi 5 günden kısa bir süre ile sınırlamak şarttır. Bex-Plex'i birden fazla slayt üzerinde uygularken, RNA bozulmasındaki değişkenliği azaltmak için her seferinde bir slayt işlenmesi şiddetle tavsiye edilir. Benzer şekilde, prob hibridizasyonu ile görüntüleme arasındaki zamanı sınırlayın. Güçlendirme sonrası 3 güne kadar başarılı bir şekilde görüntüleyebildik, ancak daha uzun depolama önerilmiyor. Birden fazla boyama veya hibritleşme döngüsünden sonra sinyal azalırsa, protokol boyunca hızın artırılması gerekebilir. İdeal olarak, gecikmeler RNA bütünlüğünü azaltabilir ve amplifikasyonu azaltabileceği için mümkün olduğunca hızlı çalışmanızı öneririz. Diğer yaklaşımlar arasında, protokolün zaman çizelgesine daha kolay uyum sağlamak için uygulanan protein döngülerinin sayısının azaltılması veya RNA prob paneli tasarımını daha yüksek bolluk hedefleri dahil etmek için değiştirilmek yer alır. IBEX ve RNAscope birleştirmeden önce, her döngü için antikor ve prob panellerini ayrı ayrı doğrulayarak her döngü için beklenen sinyal kalitesini belirleyin. Hedef geri alımından sonra nükleer şişlik durumunda, hedef geri alma reaktifinin doğru şekilde önceden ısıtılmış olmaması mümkündür. Geri alma reaktifinin seyreltilip önceden ısıtıldığında soğumasına izin verilmediğinden ve 1 saatlik kaydırma kuluçkasında sıcaklığın sabit kaldığından emin olun. Son olarak, nükleer şişlik olmadan görüntü kaydı ve hizalama başarısız olursa, bu bit derinliği, voxel boyutu veya döngüler arasında Z konumu gibi görüntü alım parametrelerinde uyumsuzluk olduğu anlamına gelir. Böyle hatalar durumunda, protokolün tutarlı olması için ayarlarda değişiklikler yapılması gerekebilir. Bu sorun giderme stratejileri, deneyler arasında tekrarlanabilirlik ve tutarlılığı sağlamak için gereklidir.

Bex-Plex tarafından oluşturulan veriler, dokuların mekansal peyzajının daha önce ulaşılamadığı bir düzeyde derinlemesine bir görünüm imkanı sunar. Ancak, bu protokolün büyük bir sınırlaması, zamanla RNA bozulması nedeniyle mümkün olan toplam yinelemeli protein döngülerinin sayısının yalnızca IBEX ile karşılaştırıldığından daha düşük olmasıdır. Standart IBEX'in 6 döngüsüne kadar yapılmasına rağmen, Bex-Plex için 3 döngüden fazla protein boyama önerilmez. Buna rağmen, protokol maksimum sayıda RNA kapsamı döngüsünü barındırır ve bu çoklu derinlik seviyesi çoğu uygulama için yeterlidir.

Ek sınırlamalar arasında doku tipleri arasında değişkenlik ve sinyal yorumunu etkileyebilecek potansiyel otofloresans veya boyama artefaktları yer alır. Daha hassas dokular daha az döngüye dayanabilir ve farklı doku tipleri boyamayı etkileyen benzersiz özelliklere sahip olabilir. Bu sınırlamalar, protein veya RNA'nın tek döngü boyamalarıyla değerlendirilebilir ve Bex-Plex çalıştırılmadan önce ele alınabilir. Krom alümün kaplamalı slaytlara kesitleme, doku yapışmasını ve yapısal bütünlüğü önemli ölçüde iyileştirir, ancak otofloresans tüm immünoflüoresans tabanlı teknikler için dikkate alınmalıdır. Ayrıca, şu anda protokol FFPE veya insan klinik örneklerinde doğrulanmamış ve bu tür uygulamalar için daha fazla optimizasyon gerektirecektir. Ancak, IBEX ve RNAscope'un ağırlıklı olarak formalin sabitli parafinli gömülü (FFPE) dokular üzerinde yapıldığı göz önüne alındığında, Bex-Plex'in bu örnek türlerine genişlenebilmesi mümkündür. Başarılı bir uygulama, antijen toplama için daha fazla optimizasyon ve potansiyel olarak RNA kalitesini korumak için hedef toplama adımlarını gerektirir.

Genel olarak, Bex-Plex yüksek plex mekânsal analizleri için basit, maliyet etkili ve geniş çapta erişilebilir bir yöntem sunar. Bu yöntem, özellikle tümör mikro ortam analizi, bağışıklık hücresi profili ve sinyal etkileşimlerinin mekansal haritalanması gibi uygulamalar için oldukça uygundur. Bu entegre görüş, bağışıklık düzenlemesi, tümör heterojenliği ve terapötik yanıt mekanizmalarını çok çeşitli deneysel modellerde sorgulama yeteneğini artırır. Bex-Plex, iltihap ve homeostaz sırasında tümör mikro ortamında veya diğer dokularda hücreler arasında oluşan çapraz konuşmayı incelemek için gerekli olan bağlamlarda paha biçilmez olacaktır. Özellikle, sitokin sinyal mekansal dinamiklerini, kısa ömürlü moleküllerin transkripsiyonlarını fenotipik protein belirteçleriyle birlikte inceleyerek çözebilme yeteneği, hastalık durumları arasındaki hücresel etkileşimlerin daha derin bir anlaşılmasını sağlayacaktır. Gelecekteki iyileştirmeler arasında çoklu kapasitenin artırılması, otomatik görüntü analiz boru hatlarıyla entegrasyon ve klinik biyopsi örnekleri için FFPE dokularını da kapsayacak şekilde iş akışının genişletilmesi yer alabilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC tamponu	Invitrogen	AM9765
24 kuyu plakalar
Alexa Fluor 488 anti-fare CD11b Antikoru	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-fare CD3e Antikoru	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-fare Ly6G Antikoru	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-fare CD68 Antikoru	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fiksasyon ve geçirim çözeltisi	BD	554722
Krom alüminyum jelatin	Fisher	NC1692262
Konfokal mikroskop (örn. Leica Stellaris)
Krio kalıplar	VWR	25608-922
Kriostatik bıçaklar (örn. Leica Low Profile Tek Kullanımlık Bıçaklar DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Diseksiyon mikroskobu (örn. Zeiss SteREO Discovery.V8)
Diseksiyon aletleri
Kuru buz
Kaydırma boyama için batırma tankı (örn. Simport Scientific EasyDip Slayt Boyama Kavanozları)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Isıtmalı su banyosu
Histoloji fırçaları (örn. Ted Pella Değişken Kıl Fırçalar)	Fisher Scientific	NC2023341
Hibridizasyon fırını (örn. HybEZ II Hibridizasyon Sistemi)	ACD	321710
Görüntü analiz yazılımı (tercihe bağlı)
ImmEdge Hidrofobik Bariyer PAP Kalem	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lityum borohidür	STREM Chemicals	93-0397
Mikropipetler (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Mikrosantrifüj (örn. Corning LSE Mini Mikrosantrifüj)	Corning