Gen Taşımayı Artırmak İçin Mezenkimal Kök Hücre Zarı Zarflı Nanoveziküllerin Geliştirilmesi

Özet

Bu protokol, gen tedavisi için mezenkimal kök hücre (MSC) türevli ekstraselülük vezikül biyomimetiklerinin üretilmesi ve saflaştırılması için bir yöntem tanıtmayı amaçlamaktadır. Nanovezikül, MSC'den türetilen lipid çift katmanlarla sınırlıdır ve lümende ilgi çekici geni taşıyan rekombinant AAV'leri kapsüller. Bu nanovezikül, in vivo gen taşıması için gelişmiş bir vektör sunar.

Özet

Mezenkimal kök hücre (MSC) türevi ekstrasellüler vezikülleri (EV), tedavi uygulamaları ve rejeneratif tıp için büyük umut vaat ediyor. EV'ler, bilinen tüm hücre tipleri tarafından salgılanan nano ölçekli veziküllerdir ve membran sabitli proteinler, çözünür faktörler, çoklu RNA türleri ve alıcı hücrelerin fizyolojisini ve davranışını düzenleyen metabolitler gibi çeşitli yükleri taşırlar. MSC kaynaklı veya mühendislik yoluyla üretilen EV'ler terapötik protein ve RNA'lar taşıyabilse de, EV aracılı DNA teslimatı, DNA dizilerini veziküllere ayırmak için verimli mekanizmaların eksikliği nedeniyle hâlâ zordur. Grubumuz ve diğerlerinin önceki çalışmaları, adeno-ilişkili virüs (AAV) içeren EV'lerin hem vitro hem de in vivo hedefli nükleer teslimatı ve sürdürülebilir gen ifadesini mümkün kıldığını göstermiştir. Ancak, üretimleri ve izolasyonu düşük verim ve zaman alıcı prosedürler nedeniyle sınırlı olmuştur. Burada, verimli gen taşıması için boyut tanımlı ekstrüzyon yöntemiyle üretilen MSC membran kaplamalı nanoveziküllerin gelişimini raporluyoruz. Yaklaşık 200 nm çapında olan bu veziküller, terapötik gen dizilerini taşıyan rekombinant AAV vektörlerini kapsüllerken doğal EV'lerin özelliklerini taklit eder. Geleneksel AAV'lerle karşılaştırıldığında, mühendislik ürünü MSC vezikülleri gen dağıtım verimliliğini artırdı ve doğal olarak salgılanan EV-AAV'lere kıyasla daha düşük zaman ve maliyetle önemli ölçüde daha yüksek verimler elde etti. Özetle, EV-taklit yapılarının avantajlarını AAV aracılı gen transferiyle birleştiren yeni bir MSC tabanlı membran nanovezikül platformu sunuyoruz. Bu yaklaşım, teslimat verimliliğini ve üretim ölçeklenebilirliğini artırır ve gen tedavisini klinik çeviriye ilerletmek için umut verici bir strateji sunar.

Giriş

Gen terapisi, genetik ve edinilmiş hastalıkların tedavisinde belirli genleri tanıtmak, değiştirmek veya susturarak normal hücresel fonksiyonu geri kazandırmak için dönüştürücü bir yaklaşım sunar. Son yirmi yılda, vektör mühendisliği ve sunum stratejilerindeki ilerlemeler, gen tedavisinin terapötik ortamını önemli ölçüde genişletmiştir. Geliştirilen çeşitli vektör sistemleri arasında, adeno-ilişkili virüs (AAV), hem bölünen hem de bölünmeyen hücrelerde avantajlı güvenlik profili, verimli transdüksiyonu ve uzun vadeli gen ekspresyonu sayesinde en başarılı ve yaygın olarak benimsenen platformlardan biri olarak ortaya^{çıkmıştır 1,2}. Bugüne kadar, omurga kas atrofisi, retina distrofisi ve hemofili tedavileri dahil olmak üzere birçok AAV tabanlı tedavi düzenleyici onay almış ve bu da translasyonel tıpta önemli dönüm noktalarını işaret^{etmiştir 3}. AAV vektörlerinin geniş tropizmi ve düşük immünojenliği, karaciğer, kas, merkezi sinir sistemi ve göz gibi çeşitli dokularda da^{uygulanmasını sağlamıştır.} Sonuç olarak, AAV, metabolik, nörolojik ve kardiyovasküler bozuklukları hedefleyen devam eden preklinik ve klinik çalışmaları destekleyen in vivo gen sunumu için önde gelen bir platform haline gelmiştir.

Olağanüstü klinik başarısına rağmen, AAV tabanlı gen tedavisi, daha geniş uygulamasını sınırlamaya devam eden birkaç içsel zorlukla karşı karşıyadır. Büyük bir kısıtlama, AAV kapsidinin sınırlı genom paketleme kapasitesidir (~4,7 kb), bu da büyük veya çoklu terapötik genlerin taşınmasında kullanımını kısıtlar^. Ayrıca, AAV vektörlerinin biyodağılımı ve hücresel tropizması büyük ölçüde serotipleriyle belirlenir ve her biri belirli dokulara özgü eğilimler gösterir. Doku hedefleme ve transdüksiyon verimliliğini artırmak için kapsamlı kapsid mühendisliği ve peptid görüntüleme stratejileri uygulanmış olsa da, çeşitli biyolojik bağlamlarda hassas ve öngörülebilir tropizm elde etmek önemli bir engel olarak kalmaktadır⁷. Bir diğer kritik sınırlama ise, insan popülasyonunda doğal AAV serotiplerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorların (NAb) yaygınlığıdır. NAb'lerin düşük titrleri bile vektör transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde azaltabilir, hasta uygunluğunu sınırlayabilir ve tekrar edilen dozu^{zorlaştırabilir 8,9}. Akılcı kapsid yeniden tasarımı, immünosupresif rejimler ve geçici plazma değişimi gibi çeşitli stratejiler antikor aracılı nötralizasyonu^{azaltmak için incelenmiştir 10,11}, ancak bu yaklaşımlar yalnızca kısmi veya geçici rahatlama sağlar. Bu sınırlamalar birlikte, klinik ortamlarda AAV aracılı gen teslimatının genel terapötik etkinliğini ve tekrarlanabilirliğini azaltır.

Son yıllarda, ekstraselüler vezikül kaplamalı AAV (EV-AAV), geleneksel^AAV'lerin 12,13,14,15 birkaç temel sınırlamasını aşma potansiyeline sahip alternatif bir vektör olarak araştırılmıştır. Vektör paketleme sırasında, AAV parçacıklarının bir kısmı veziküler trafik yolları aracılığıyla salgılanabilir ve hücre dışı veziküller içinde kaplanabilir. Bu sürecin, viral çıkışı kolaylaştıran ve membran ilişkisini teşvik eden AAV kodlu membranla ilişkili yardımcı protein (MAAP) içerdiği^{düşünülmektedir 16,17}. Ortaya çıkan EV-AAV parçacıkları, geleneksel AAV'ye kıyasla daha iyi transdüksiyon etkinliği ve nötralize edici antikorlara karşı direnç gösterir; bunun esas olarak hücre alımını teşvik eden veziküler membran ve antikor tanımasından kısmi koruma sağlayan^{bu direnç 18}. Ancak bu avantajlara rağmen, EV-AAV üretimi verimsiz hale gelmektedir. Genellikle, vektör genomlarının sadece küçük bir kısmı (yaklaşık %0,5-%12) kültür ortamına EV-ilişkili AAV'ler olarak salgılanırken, çoğu hücre içi kalır veya serbest AAV'ler^{olarak var olur 12,13}. Sonuç olarak, yeterli vektör verimi elde etmek için büyük ölçekli üretim gereklidir. Ayrıca, EV-AAV üretimi esas olarak hızlı hepatik boşalma, kısa dolaşım yarı ömrü ve potansiyel biyogüvenlik endişeleri gösterebilen HEK293T üretici hücreler kullanılarak gösterilmiştir. Bu sınırlamalar, daha verimli ve özelleştirilebilir bir zar kaplama stratejisine olan ihtiyacı vurgulamakta olup, bu çalışmada sunulan hücre zarı kaplamalı AAV (CME-AAV) platformunun geliştirilmesini teşvik etmektedir.

Mezenkimal kök hücreler (MSC) ve EV'leri, yenileyici potansiyelleri ve bağışıklık kaçınma özellikleri açısından kapsamlı şekilde incelenmiştir. Hücrelere veya doğal olarak salgılanan EV'lere dayalı tedavilerin ötesinde, son çalışmalar, MSC membranlarıyla örtülü nanopartiküller kullanılarak geliştirilmiş ilaç dağıtımı için alternatif bir yaklaşım^{göstermiştir 19,20,21}. MSC membran kaplaması aktif hedefleme yeteneği sağlar, bağışıklık klirensini azaltır ve dolaşım süresini uzatır; bu etkilerin etkileri muhtemelen MSC kaynaklı membranların içsel moleküler^{bileşimine atfedilir 22,23}. Bu konsept üzerine inşa ederek, MSC kaynaklı membran materyali kullanarak gen taşıma için hücre zarı kaplamalı AAV (CME-AAV) nanovezikülü inşa ettik. Bunu başarmak için, saflaştırılmış MSC membran parçaları rekombinant AAV parçacıklarıyla karıştırılmış ve kontrollü ekstrüzyon sürecine tabi tutulmuştur; bu teknik, ilk olarak lipozom^{üretimi için 24,25} olarak oluşturulmuştur. Boyut olarak tanımlanan ekstrüzyon yoluyla, membran bileşenleri kendiliğinden AAV parçacıklarını kapsayan nano ölçekli veziküllere birleşir. Ortaya çıkan CME-AAV'ler, yoğunluk gradyanı tabanlı santrifüjleme kullanılarak serbest ve kapsüllenmemiş AAV'lerden daha da arındırıldı. Bu strateji, geleneksel AAV'lere kıyasla belirgin şekilde gelişmiş transdüksiyon verimliliği gösteren ve EV-AAV'lar gibi nötralize edici antikorlara karşı karşılaştırılabilir direnç gösteren membran kaplamalı AAV vektörlerinin verimli ve tekrarlanabilir hazırlanmasını sağlar. Farklı transgenlerin yerine koyularak CME-AAV platformu çeşitli genetik ve edinilmiş hastalıkların tedavisinde geniş potansiyele sahiptir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Çin'in Zhuhai kentindeki Pekin Normal Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. CME-AAV'nin gözenek boyutuna bağlı ekstrüzyon yoluyla hazırlanması ve oluşumu

1. Rekombinant AAV vektörlerinin üretimi
   NOT: AAV üretim protokolü daha önce yayımlanmış ve yaygın olarak kullanılan prosedürleri takip eder. Detaylı optimizasyon adımları ve varyasyonları önceki çalışmalarda^{tanımlanmıştır 12,26}.
   1. Hücreleri tam büyüme ortamında kültüre HEK293T ve transfeksiyon gününde %70-80 birleşme oranında tutulur.
   2. (i) ilgi duyulan transgeni taşıyan AAV transfer vektörünü, (ii) istenen serotipe karşılık gelen AAV rep/cap genlerini ve (iii) adenoviral yardımcı fonksiyonları kodlayan üç plazmid hazırlanır.
   3. Standart laboratuvar uygulamalarını takip ederek üç plazmidle birlikte hücreleri HEK293T transfeksiyon yöntemi (örneğin, kalsiyum fosfat veya polimer bazlı transfeksiyon) uygulanır.
   4. Transfekte edilen hücreleri 48-72 saat kuluçka altına alın, böylece AAV montajı ve birikmesi mümkün olur.
   5. Hücreleri ve kültür ortamını toplayın ve AAV parçacıklarını tekrar eden donma-eritme döngüleriyle veya eşdeğer bir hücre lizisi yöntemiyle serbest bırakın.
   6. Lizat düşük hızda santrifüjlenerek hücre kalıntılarını çıkarır ve AAV parçacıklarını içeren süpernatantı toplar.
   7. AAV parçacıklarını yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme veya başka bir yerleşik arıtma yöntemiyle arındırın.
   8. Arıtılmış AAV vektörlerini steril fosfat-tamponlu tuzlu suynuya (PBS) dönüştürün ve aliquotları −80 °C'de depolayın, ta ki kullanılana kadar.
2. MSC membran fraksiyonunun hazırlanması
   NOT: İnsan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler), kurumsal yönergelere uygun olarak izole edilmiştir. Hücreler, belirlenmiş koşullar veya laboratuvarda modifiye edilmiş protokoller altında kültürlenip genişletildi. MSC kimliği, akış sitometrisi kullanılarak CD73, CD90 ve CD105 gibi fenotipik belirteçlerin ifadesi değerlendirilerek doğrulanabilir. MSC'lerin çoklu potensiyesi, in vitro osteoblastlara, kondrositlere ve adipositlere ayrılabilme yetenekleriyle doğrulanır. Hücreler %70-90 birleşimine ulaştıklarında toplanmaya hazır olur. Aşağıdaki prosedürlerin steril koşullarda yapılması zorunlu değildir.
   1. Kültür ortamını çıkarın ve MSC'leri kültür kabından hücre kazıyıcı ile ayırın.
   2. Ayrılmış hücreleri, PBS içeren konik bir tüpe toplayın ve hücreleri pelletlemek için 300 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
   3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her seferinde 300 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
   4. Son hücre pelletini PBS'de bir proteaz inhibitörü kokteyli ile takviye edilmiş şekilde yeniden süzülür.
   5. Hücre süspansiyonunu plazma zarını bozmak ve ham bir hücre lizatı oluşturmak için üç donma-çözülme döngüsüne tabi tutun.
   6. Lizat iyice pipetlenerek homojenleşmeye başlayın, ardından 1.000 × g sıcaklığında 20 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve hücresel kalıntıları giderin.
   7. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve 18.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj yapın, böylece membran fraksiyonu pellet edilir.
   8. Süpernatantı atın ve ortaya çıkan membran pelletini PBS ile yeniden askıya alın. Bu süspansiyon, kaba MSC membran fraksiyonunu temsil eder ve AAV kapsülasyonu için kullanılacaktır.
   9. Membran süspansiyonunu, 20 G ila 27 G iğnelerle donatılmış şırıngalardan sıralı geçirerek homojenleştirin.
   10. Homojenleştirilmiş membran süspansiyonunun protein konsantrasyonunu bir BCA testi kullanarak belirleyin. Aliquot ve süspansiyonu −80 °C'de saklayabilir veya doğrudan aşağıdaki adımlara geçebilirsiniz. Her erime döngüsünden sonra 27 G'lik bir şırınga kullanarak membran süspansiyonunu yeniden homojenleştirin.
3. Ekstrüzyon yoluyla CME-AAV'nin oluşumu
   1. Hazırlanan membran süspansiyonu, AAV'nin 1 ×^10-10 genom kopyasına (g.c.) göre tanımlanmış bir oranda AAV'lerle karıştırın. Karışımı 37 °C'de 30 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe yapın.
   2. Membran-AAV karışımını, 400 nm polikarbonat (PC) membranla donatılmış bir mini ekstrudere yükleyin. Örneği ekstruderden 20 kez geçirerek membran-AAV kapsüllenmesini teşvik edin.
   3. 400 nm PC membranını 200 nm bir zarla değiştirin ve vezikül boyutu heterojenliğini daha da azaltmak için ekstrüzyon sürecini 20 kez tekrarlayın.
   4. İşlenmiş karışımı toplayın. Daha büyük bir miktar gerekirse, birden fazla ekstrüzyon partisini bir kenara toplayın. Ortaya çıkan süspansiyon, CME-AAV'lar, kapsüllenmemiş AAV'ler ve boş zar vezikülleri içerir. Hemen CME-AAV arıtmasına geçin.

2. CME-AAV'nin yoğunluk gradyanı santrifüjle arındırılması

NOT: Bu adım, saf CME-AAV'nin kapsüllenmemiş AAV'lerden, protein agregalarından ve kalıntı nükleik asitlerden iyodikanol bazlı yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu kullanılarak ayrılmasını açıklar. Bu adımdan elde edilen saflaştırılmış CME-AAV, hem in vitro hem de in vivo çalışmalar için uygundur. Tüm işlemlerin steril doku kültürü kapüşonunun altında yapılması önerilir.

1. İyodiksanol gradyanının hazırlanması
   1. %40 ve %25 iyodiksanol çözeltilerini 10× PBS ve steril deyonize su ile seyreltirerek nihai konsantrasyon 1× PBS elde edin.
   2. 13,2 mL açık üstlü, ince duvarlı ultra şeffaf bir tüpte, tabandan 1 mL %40 iyodiksanol ve %25 iyodiksanol 3 mL ile döşenerek süreksiz bir yoğunluk gradyanı dikkatlice oluşturulur.
   3. 1.14. adımdan elde edilen CME-AAV içeren süspansiyondan 7 mL nazikçe gradyanın üstüne serin. Tüpleri dengeleyin ve onları salıncak kovalı ultrasantrifüj rotoruna yükleyin.
2. Ultrasantrifüjleme ve CME-AAV fraksiyonlarının toplanması
   1. 150.000 × g gradyanı 3 saat boyunca 4 °C'de hızlı ivme ve yavaş yavaşlama kullanarak santrifüjle yapın (sırasıyla seviye 9 ve seviye 1).
   2. Tırtıkları rotordan dikkatlice çıkarın, gradyanı bozmadan. Tüpün üst kısmından altına doğru 1 mL fraksiyonları etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (F1-F11) toplayın. Tüm kesirleri buzda tutun.
   3. Saflaştırılmış CME-AAV'leri içeren F7 ve F8 fraksiyonlarını tanımlayıp yeni bir açık üstlü ultrasantrifüj tüpüne biriktirin. PBS ekleyerek toplam 11 mL hacme ekleyin ve 1 mL pipetle nazikçe karıştırın.
3. CME-AAV'nin yıkanması ve geri kazanımı
   1. Biriktirilen fraksiyonları tekrar 150.000 × g ile 3 saat boyunca 4 °C'de hızlı ivme ve hızlı yavaşlama kullanarak santrifüjle yapın (her iki ayar için de seviye 9).
   2. Süpernatantı dikkatlice atın ve CME-AAV pelletini istenen konsantrasyona bağlı olarak 50-200 μL steril PBS içinde yeniden askıya alın.
   3. Gerekirse Aliquot ile −80 °C'de saklanır ve daha fazla kullanıma kadar saklanır.

3. CME-AAV'nin transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak karakterizasyonu

NOT: Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM), CME-AAV parçacıklarının morfolojisi, boyutu ve zar yapısını görselleştirmek için kullanılır. Bu işlem, ekstrasellüler vezikülleri için kullanılan standart negatif boyama protokolüne benzer şekilde uygulanır. Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılır, aksi belirtilmedikçe.

1. Numune hazırlama ve fiksasyon
   1. Adım 2'den elde edilen saflaştırılmış CME-AAV süspansiyonunu PBS'de yaklaşık 1 ×^{10 9-1} × 10¹⁰ parçacık/mL konsantrasyona seyreltin.
   2. Numuneyi, taze hazırlanmış %4 paraformaldehit (nihai konsantrasyon %2) ekleyerek ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka geçirerek sabitleyin.
   3. Formvar/karbon kaplamalı bakır ızgara (200 ağ) parafin filmi tabakasına karbon yüzü yukarı doğru yerleştiril.
   4. Sabit CME-AAV süspansiyonundan 10 μL pipetleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca adsorpsiyona izin verin. Adsorpsiyon sırasında kurutmaktan kaçının.
   5. Filtre kağıdıyla ızgara kenarındaki fazla sıvıyı merkeze dokunmadan nazikçe çıkarın.
2. Yıkama ve sonra-fiksasyon
   1. Izgarayı, örnek yüzü aşağı olarak, 50 μL PBS damlasında 2 dakika boyunca suyun altında bırakın. İki kez tekrarlayın.
   2. Zar yapısını stabilize etmek için ızgarayı %1 glutaraldehit içeren 50 μL damlasına aktarın.
   3. Tampon tuzlarını çıkarmak için ızgarayı ardışık olarak 5 kez damlalarla (her biri 30 saniye) deiyonize su damlalarıyla yıkayın. Son yıkamadan sonra nazikçe lekeleyin.
3. Negatif boyama
   1. Negatif boyama elde etmek için ızgarayı %2 sulu uranil asetat içeren 50 μL damlasına 1 dakika boyunca yerleştirin.
   2. Fazla lekeyi filtre kağıdıyla ızgara kenarına hafifçe dokunarak temizleyin ve oda sıcaklığında tamamen hava kurumasına izin verin.
4. Görüntüleme
   1. 200 kV'da çalışan bir geçirim elektron mikroskobu ile boyalı ızgaraları inceleyin.
   2. CME-AAV morfolojisini ve membran bütünlüğünü değerlendirmek için 30.000× ile 120.000 arasında büyütmelerle temsil edici görüntüler ×alın.
   3. Isteğe bağlı olarak, vezikül boyutunun NTA sonuçlarıyla tutarlılığını doğrulamak için parçacık çaplarını TEM görüntü analiz yazılımı ile ölçebilirsiniz.
      NOT: Örnek konsantrasyonu - CME-AAV konsantrasyonu ayarlanarak orta parçacık yoğunluğu elde edilir; aşırı yoğunlaştırılmış örnekler parçacıkların üst üste bulaşmasına yol açarken, aşırı seyreltilmiş örnekler çok az tespit edilebilir vezikül elde eder. Eser Parçalarından Kaçınmak - Eksik yıkama, parçacık görselleştirmesini engelleyen tuz kristalleri bırakabilir. Membran çökmesini önlemek için boyama boyunca ızgaraların nemli kalmasını sağla. Alternatif boyamalar - Radyoaktif taşıma kısıtlamaları uygulandığında uranyl asetata alternatif olarak fosfortungstik asit (PTA, %1-2 pH 7.0) kullanılabilir. Depolama - Hazırlanmış ızgaralar, görüntülemeden önce birkaç gün boyunca tozsuz bir kapta oda sıcaklığında saklanabilir, ancak en iyi kontrast için hemen gözlem önerilir.

4. CME-AAV'nin qPCR kullanılarak nicelleştirilmesi

NOT: Bu adım, CME-AAV genom kopyalarının (g.c./μL) nicelendirilmesi için qPCR tabanlı bir yöntemi tanımlar. Protokol, CME-AAV'ye özgü örnek hazırlama ve veri raporlamasını vurgular. qPCR kurulumu ve döngüsündeki diğer tüm yönler, standart laboratuvar uygulamasına ve seçilen qPCR kiti için üreticinin talimatlarına uymalıdır.

1. Örnek ve standart hazırlık
   1. Saflaştırılmış CME-AAV alikotlarını buz üzerinde eritin ve pipetle nazikçe karıştırın. Girdabdan kaçının.
   2. AAV standart seyreltmelerini, 1 × 10⁶'den 1 × 10³ g.c./μL'ye kadar sıralı 10 kat seyreltmelerle nükleazsız deionize su veya TE tamponu kullanılarak hazırlayın. Standartları taze veya aliquot olarak hazırlayın ve kısa süreli kullanım için −20 °C'de saklayın.
   3. Aşağıdaki kontrolleri hazırlayın: şablonsuz bir kontrol (NTC; su), negatif kontrol (PBS veya boş matris) ve varsa pozitif kontrol (bilinen konsantrasyona sahip AAV örneği).
   4. Seçilen kimya için üreticinin talimatlarına göre (boya veya prob bazlı) buzun üzerinde qPCR master karışımı hazırlanır.
2. qPCR döngüsü ve veri analizi
   1. qPCR master mix üreticisinin önerdiği döngü parametrelerini kullanarak qPCR'yi çalıştırın.
   2. C_t (y ekseni) ile log₁₀ (g.c./μL cinsinden standart konsantrasyon) (x ekseni) arasında çizerek standart bir eğri oluşturun. Doğrusal bir regresyon yerleştirerek eğim (m) ve y-kesişme (b) elde edilir.
   3. Her örnek için CME-AAV genom konsantrasyonu hesaplanarak regresyon denklemi kullanılır:
      veya
      
      burada C, μL başına genom kopyasıdır.
   4. Ortalama teknik olarak tekrarlanır ve nihai CME-AAV konsantrasyonunu g.c./μL olarak bildirir.
      NOT: qPCR hazırlığı sırasında ısı denatürasyonu hem zarı hem de AAV kapsidlerini bozduğundan, ayrı bir DNA çıkarımı gerekmez. Isı lizisinden önce örneklerde DNAZ tedavisi yapılmamalıdır; DNaz, kapsidler/zarlar bozulduktan sonra AAV genomlarına erişebilir ve bozabilir, ancak örnek DNazı inaktive eden sıcaklıklara ulaşmadan önce. Standartlar mümkün olduğunca eşleştirilmelidir: iyi tanımlanmış bir AAV standardından standart bir eğri hazırlanmalıdır. Eğer örnekleriniz veya standartlarınız genom konfigürasyonunda farklıysa, (tek zincirli AAV vs kendini tamamlayıcı/çift zincirli AAV), bildirilen değerleri buna göre ayarlayın. Astar/prob tasarımı: primerler herhangi bir korunan AAV dizisini hedefleyebilir; örneğin, CMV promotorunu (transgenin yukarısında) hedefleyen primerler yaygın olarak kullanılır.

5. CME-AAV parçacık profillerinin nicelendirilmesi

1. CME-AAV preparatlarının boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu belirlemek için Nanopartikül takip analizi (NTA), ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) veya benzer parçacık analiz teknikleri kullanın.
2. Temizlenmiş CME-AAV örneklerini buz üzerinde eritin ve analizden önce pipetleme ile nazikçe homojenleştirin. Daha önce yayımlanmış^protokoller 12,27,28,29'da tanımlandığı standart laboratuvar uygulamaları ve seçilen cihaz için üretici talimatlarına uygun olarak ölçümler yapılabilir.

6. CME-AAV aracılı gen transferinin in vitro analizi

NOT: Bu adım, kültürlenmiş hücrelerde CME-AAV aracılı gen teslimatı ve transgen ifadesinin değerlendirilmesi prosedürünü tanımlar. Test, HEK293T hücreleri ve CME-AAV9 kullanılarak gösterilmiştir. EGFP olabilir, ancak diğer hücre tiplerine veya raporlayıcı yapılara uyarlanabilir. Geleneksel (zar kaplamasız) AAV9. EGFP pozitif kontrol olarak kullanılırken, PBS veya boş AAV parçacıkları negatif kontrol olarak kullanılır.

1. Hücre hazırlığı
   1. Hücreler standart koşullarda (DMEM, %10 FBS, %1 penisillin-streptomisin) 37 °C'de, %5 CO₂'de HEK293T kültürlenir.
   2. Tohum hücrelerini 48 veya 96 kuyuyla plakalara yerleştirerek transdüksiyon anında yaklaşık %70 birleşime ulaşılır (genellikle tohumlamadan 24 saat sonra). Kuyu büyüklüğüne göre tohumlama yoğunluğunu ayarlayın (örneğin, 48 kuyu plakası için ~5 × 10⁴ hücre/kuyu veya ~1 × 10⁴ hücre/kuyu için 96 kuyu plakası için).
   3. Hücrelerin 24 saat boyunca tutunmasına ve dengelenmesine izin verin, ardından vektörler ekleyin.
2. Vektör uygulaması
   1. CME-AAV9'u hazırlayın. EGFP ve AAV9. Steril PBS'de çalışan EGFP çözümleri. Tipik viral doz: 48-kuyu başına 5 × 10⁸ g.c. (promotor gücü, hedef gen ve deneysel hedeflere göre ayarlanır).
   2. Her kuyu için, CME-AAV9'un eşit genom kopyalarını (g.c.) ekleyin. EGFP veya AAV9. EGFP doğrudan kültür ortamına ulaşır.
   3. PBS veya boş AAV parçacıklarının eşdeğer hacmi olan negatif kontrol kuyularını ekleyin.
   4. Plakayı nazikçe döndürerek eşit dağılımı sağlayıp kuluçka ünitesine geri döndürün.
   5. Promoter aktivitesi ve transgen ifade kinetiklerine bağlı olarak 24-72 saat kuluçkaya devam edin. HEK293T hücrelerde CMV kaynaklı EGFP için, güçlü floresans genellikle 48 saat içinde gözlemlenir.
3. Görüntüleme ve canlı hücre analizi
   1. Görüntülemeye hazır olunca, kültür ortamını nazikçe aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayarak bağlanmamış parçacıkları çıkarın. Hücreleri yerinden çıkarmaktan kaçının.
   2. Üretici talimatlarına uygun olarak Hoechst 33342 (canlı hücre uyumlu) ile boyama hücre çekirdekleri. Canlı hücreler için DAPI kullanmayın.
   3. Uygun filtrelerle donatılmış ters floresans mikroskobu kullanarak canlı hücre floresans görüntülemesi yapılabilir (örneğin, EGFP için uyarılma 488 nm/emisyon 513 nm; Hoechst için uyarılma 350 nm/emisyon 460 nm).
   4. Transdüksiyon verimliliğinin nicel olarak belirlenmesi için 10× veya 20× hedef, gerekirse yüksek çözünürlüklü hücrealtı lokalizasyon için ise 63× hedef kullanın.
   5. Aynı görüntüleme parametrelerini (pozlama süresi, kazanç, diyafram vb.) kullanarak her kuyu başına en az beş görüş alanı (örneğin, dört köşe ve bir merkez) alın.
   6. Tüm görüntüleri nicel analiz için ham ve gri tonlu formatlarda kaydedin.
4. Nicel görüntü analizi
   1. ImageJ (FIJI) veya eşdeğer yazılımda görüntüleri açın.
   2. Her alan için hem EGFP hem de Hoechst kanallarının ortalama floresans yoğunluğunu ölçün.
   3. Floresan sinyali olmayan bir bölgeyi seçip piksel değerlerinin ortalamasını alarak arka plan yoğunluğunu belirleyin.
   4. Her kanal için düzeltilmiş yoğunluğu hesaplayın:
      _Düzelttim =_Yani -_{Arka plan}
   5. Her alan için normalize yoğunluğu şu şekilde hesaplayın:
      
   6. Kuyu başına en az beş alandan ortalama normalize yoğunluklar ve üç bağımsız biyolojik kopyada ortalama ± SD rapor edilir.
      NOT: CME-AAV genellikle eşit genom kopyaları uygulandığında geleneksel AAV'ye göre artmış floresans yoğunluğu gösterir; bu da hücresel alımın iyileşmesini ve/veya nötralize edici antikorlardan korumayı yansıtır. Optimal transdüksiyon verimliliği, CME-AAV hazırlanma kalitesine, hücre tipine, promotor gücüne ve viral titreme bağlıdır. Zayıf sinyaller gözlemlenirse, genom kopya girişini artırın, vektörün bütünlüğünü qPCR ile doğrulayın ve mikroskop kalibrasyonunu doğrulayın. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak diğer floresan raporlayıcılar (örneğin, mCherry, mNeonGreen, tdTomate) veya lusiferaz yapıları kullanılabilir. Birincil veya yapışmayan hücrelerle çalışırken, tohumlama ve görüntüleme koşullarını buna göre ayarlayın (örneğin, plakaları poli-L-lizin ile kaplamak veya oda slaytları kullanmak).

7. CME-AAV - fare modelinde aracılı gen dağıtımının değerlendirilmesi

NOT: Bu adım, CME-AAV aracılı gen teslimatının in vivo olarak bir fare modeli kullanılarak değerlendirilmesini tanımlar.

1. Hayvan hazırlığı
   1. C57BL/6 gibi vahşi tip fareler kullanın. Tüm hayvan prosedürlerinin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandığından ve ilgili düzenlemelere uygun şekilde uygulandığından emin olun.
   2. Deneyler arasında optimal tutarlılık için 4-6 haftalık fareleri seçin.
   3. Hayvanları standart barınma koşullarında beslenerek enjeksiyondan önce yiyecek ve suya ima kadar imkansız erişimle beslemek.
2. Vektör hazırlığı ve uygulaması
   1. Çalışma amacına ve hedef dokuya göre bir AAV serotipi seçin. Bu çalışmada AAV9 ve CME-AAV9 kullanılmıştır.
   2. İnvaziv olmayan görüntüleme için luciferaz raporlayıcı genini (örneğin, CME-AAV9.luciferase) kodlayan viral vektörler hazırlayın.
   3. Steril tuzlu sunda viral vektörleri her fare için 50 μL başına 1 × 10¹° genom kopyası (g.c.) nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
   4. Kuyruğu enjeksiyondan önce damarı genişletmek için ısıtma pedi veya sıcak su ile nazikçe ısıtın.
   5. 50 μL viral süspansiyonu 31-G insülin şırıngasına yükleyin ve sızıntıyı ve damar yırtılmasını en aza indirmek için lateral kuyruk venine yavaşça enjekte edin.
   6. Enjeksiyondan sonra fareleri kafeslerine geri götürün ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
3. In vivo biyolüminesans görüntüleme
   1. Uygulamadan iki hafta sonra, fareleri izofluran ile anestezi edin (kurumsal onaylı protokollere göre) ve D-luciferin (150 μg/g vücut ağırlığı; PBS'de intraperitoneal olarak Sigma) ile birlikte kullanılır.
   2. Anestezi altındaki fareleri biyolüminesans görüntüleme sistemine yerleştirin.
   3. Sinyal bir platoya ulaşana kadar enjeksiyondan sonraki 2 dakikada bir lüminesans görüntüleri alın.
   4. Uygun yazılım kullanarak biyolüminesansı nicelikle ölçebilirsiniz. Luminesan alanlar çevresindeki ilgi çekici bölgeleri (ROI'leri) tanımlayın ve her hayvan için toplam foton akışını (foton/s) hesaplayın.
   5. Karşılaştırma için AAV9.luc ile tedavi edilmiş ve PBS enjekte edilmiş grupları sırasıyla pozitif ve negatif kontrol grupları olarak dahil edin.
4. Ex vivo görüntüleme
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır.
   1. In vivo görüntülemeden hemen sonra, fareler ötenazi edilir ve büyük organlar (karaciğer, kalp, dalak, böbrek ve beyin) toplanır.
   2. İzole organları, dokuya özgü lusiferaz ekspresyonunu belirlemek için aynı IVIS sistemiyle aynı görüntüleme parametreleri altında görüntüleyin.
      NOT: Alternatif uygulama yolları (örneğin, kas iğnesi, beyin içi veya intraperitoneal enjeksiyon) deneysel hedeflere bağlı olarak benimsenebilir. Biyolüminesans yoğunluğu hem gen teslimat verimliliğini hem de doku biyodağılımını yansıtır. CME-AAV aracılı lusiferaz ekspresyonu, membran aracılı hücrelerle endositoz nedeniyle serbest AAV'ye kıyasla genellikle daha erken başlangıç ve gelişmiş zirve ekspresyonunu gösterir. Doğru karşılaştırma için örnekler arasında tutarlı lusiferin dozu, zamanlama ve görüntüleme ayarlarını sağlayın. Tarif edilen viral doz (fare başına 1 × 10¹¹° g.c.) genellikle enjeksiyondan 2-4 hafta sonra tespit edilebilir bir sinyal sağlar, ancak farklı vektörler veya hayvan modelleri için optimizasyon gerekebilir.

Sonuçlar

Bu çalışmada kullanılan yüksek lisans programları, ilgili etik kurallara uygun protokoller kapsamında insan göbek kordonu dokusundan izole edilmiştir. MSC membran fraksiyonları tarif edilen protokole göre hazırlanmıştır. AAV9. EGFP, daha önce bildirildiği gibi HEK293T hücrede geçici çift plazmid transfeksiyon sistemi kullanılarak kurum içinde^{üretilmiştir 12,26}. CME-AAV üretimi, zar hazırlıkları ve AAV9 için. EGFP, protokolde beli...

Tartışma

CME-AAV protokolünün kritik adımları

Bu protokol, MSC membran kaplamalı AAV'ler üretme yöntemini tanımlar ve başarılı CME-AAV oluşumu için birkaç adım kritik öneme sahiptir. Öncelikle, hücre zarının dikkatli ön işlemesi gereklidir. Bu adımın amacı, çekirdek DNA, sitozolik proteinler ve subhücre organellerinden kontaminasyonu en aza indirirken ekstrüzyona uygun membran parçaları elde etmektir. Ayrıca, membran parçalarının boyutu ekstrüzyon veri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyoluminesan görüntüleme sistemi	PerkinElmer	IVIS Spectrum optik görüntüleme sistemi (Lumina III)
D-Luciferin potasyum tuzu	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Fetal sığır serumu	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Floresan mikroskop	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/karbon kaplı bakır ızgara 200 mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehit	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
Yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı	Hyclone	SH30243
Yüksek hızlı santrifüj	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA aracı	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Ultrasantrifüj için açık üst ince duvar ultra berrak tüp	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehit 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penisilin-streptomisin	Millipore-Sigma	V900929
qPCR aracı	Applied Biosystems	QS6 gerçek zamanlı PCR sistemi
Yüksek hızlı santrifüj için rotor	Beckman Coulter	JA-25.50
Ultrasantrifüj için SW 41 Ti Salıncak kova rotoru	Beckman Coulter	331362
Transmisyon elektron mikroskobu	JEOL	JEM-2100F
Ultrasantrifüj	Beckman Coulter	Optima XE-100
Uranil asetat	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore polikarbonat membran filtreleri (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore polikarbonat membran filtreleri (400 nm)	Cytiva	10417104