Yöntem makalesi

Modifiye Hulth Prosedürü Kullanarak Diz Osteoartritinde Bir Sare Modeli Oluşturmak İçin Cerrahi Bir Yöntem

143 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, modifiye Hulth modelinin geliştirilmiş cerrahi adımlarını özetleyerek deneysel osteoartritin indüklenmesi için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.

Özet

Diz osteoartriti (KOA), eklem kıkırdak dejenerasyonu, subkondral kemik yenilenmesi, osteofit oluşumu ve en yaygın osteoartrit türü olan sinovit ile karakterize edilen kronik dejeneratif bir eklem hastalığıdır.

Bu protokol, modifiye edilmiş bir Hulth prosedürü kullanarak diz osteoartritinde bir fare modeli oluşturmak için cerrahi bir yöntem sunar. Enjeksiyonla indüklenen veya medial menisküsün destabilizasyonu (DMM) ve ön çapraz bağ kesimi (ACLT) gibi geleneksel cerrahi modellerle karşılaştırıldığında, modifiye Hulth modeli hastalığın daha erken başlamasını ve daha şiddetli eklem iltihabını tetikler. Medial kollateral bağ, medial menisküs ve ön çapraz bağın kesilmesi sayesinde, bu yöntem diz ekleminin mekanik hizalanmasını bozur ve böylece OA ilerlemesini teşvik eder. Bu model, akut OA patolojisini incelemek ve potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için özellikle uygundur. Artritin şiddetini değerlendirmek için, eklem boşluğunun üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu ile küçük hayvan ultrasonu kullanılarak hacmini nicelikle ölçtük ve sinovial sıvı birikimini değerlendirdik. Ayrıca, Osteoartrit Araştırma Derneği International (OARSI) puanlamasında kıkırdak yok oluşunu değerlendirmek için histolojik kesitlerin safranin-O/hızlı yeşil boyama yapıldı.

Giriş

Diz osteoartriti (OA), klinik olarak ağrı, sertlik, sınırlı hareket aralığı ve diz çevresindeki kas zayıflığı ile karakterize edilen yaygın, kronik, dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Kadınlarda yaygınlığı erkeklere göre daha yüksektir. Yeterince kontrol edilmezse, OA ilerleyici olarak fiziksel kapasite kaybı, uyku bozukluğu, kronik yorgunluk ve nihayetinde engelliliğe yol açabilir. Küresel nüfus yaşlandıkça, diz OA sıklığı artmaya devam etmekte olup, dünya genelinde sağlık sistemleri ve ekonomiler için önemli bir zorlukoluşturmaktadır 1,2.

Patofizyolojik olarak, kıkırdak kaybı OA'nın merkezi özelliğini oluşturur ve tüm eklem ile peri-artiküler dokuların yapısal ve fonksiyonel bozulmalarıyla birlikte görülür. Hastalık mekanizmalarını aydınlatmak ve terapötik müdahaleleri değerlendirmek için, insan OA'sının temel yönlerini yeniden anlatan çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, cerrahi olarak indüklenen modeller en sık kullanılır. Medial menisküs (DMM)3 ve ön çapraz bağ kesiminin (ACLT)4 destabilizasyonu gibi normal, eklem yapısını bozarak kıkırdak dejenerasyonu ve OA benzeri değişikliklere yol açar. Alternatif olarak, kimyasal modeller, ekstrasellüler matriksi bozan ajanların (örneğin, kollajenaz veya monosodyum iyodoasetat) intra-artiküler enjeksiyonuna dayanır; bu da hızlı kondrosit ölümüne ve kıkırdak erozyonayol açar 5,6. Enjeksiyon modelleri genellikle haftalar içinde son nokta patolojisine ulaşırken, cerrahi modeller genellikle daha uzun süreli bir süreç gerektirir.

Mevcut cerrahi teknikler arasında, OA7'nin hızlı başlangıcına sahip Hulth modelini seçtik ve daha da geliştirdik. Ön çapraz ve arka çapraz bağların kesimini medial kollateral bağ rezeksiyonu ve total medial menissektomi ile birleştirerek, bu model güvenilir şekilde şiddetli, hızlı ilerleyen kıkırdak hasarı ve subkondral kemik değişiklikleri indükte eder. Yapısal eklem arızasına kısa bir zaman aralığı, modifiye edilmiş Hulth modelini akut veya subakut OA çalışmaları için özellikle uygun kılmakta ve optimize edilmiş protokolümüzün gelecekteki preklinik araştırmalar için pratik ve tekrarlanabilir bir platform sunmasını öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı. 6-8 haftalık ve yaklaşık 20 g ağırlığındaki erkek C57BL/6 fareleri ticari satıcılardan satın alındı ( bkz. Malzeme Tablosu) (Etik onay numarası: PZSHUTCM2312210005).

1. Ameliyat öncesi bakım

  1. Ameliyattan önce farelerin en az 1 hafta alışmasına izin verin.
  2. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve cerrahi çalışma alanını dezenfekte edin.
  3. Gazlı anestezi makinesini açın ve fareyi %2-3 izofluran kullanarak 5 dakika boyunca bir indüksiyon odasına yerleştirerek genel anestezi başlatın.
    NOT: Oksijen akışının 0.5 NL/dakika ile 1 NL/dakika arasında tutulduğundan emin olun.
  4. Anestezi edildikten sonra, fareyi cerrahi platforma aktarın ve ameliyat tamamlanana kadar (%1-1,5 izofluran) anestezi maskesi ile %1-1,5 izofluran kullanılarak anestezi uygulanmasını sürdürebilirsiniz.
  5. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, diz eklemleri yukarıya bakacak şekilde konumlandırın; böylece cerrahi alana stabilite ve doğru erişim sağlansın.
  6. Reflekslerin yokluğunu kontrol ederek anestezi derinliğini doğrulayın, ardından diz eklemindeki tüyleri tamamen temizlemek için depilyatör krem uygulayın.
  7. Kalan kremi gazlı bez veya pamuklu çubuklarla dikkatlice çıkarın, ardından açıkta kalan cildi önce %75 etanol ile dezenfekte edin, ardından aseptik koşulları sağlamak için iyot tentürü kullanın.

2. Cerrahi İşlem (Şekil 1)

  1. Farenin arka ayağını uzatın ve cildi sıkılaştırmak için tutuş uygulayın. Sağ diz ekleminin medial kısmında steril cerrahi bıçak kullanarak 0,5-1 cm boyuna bir kesi yapın.
    NOT: Aşağıda açıklanan tüm cerrahi işlemler cerrahi mikroskop altında gerçekleştirilmiştir.
  2. Deriyi geri çekin ve alttaki fasya'yı küt bir şekilde diseksiyonla inceleyerek eklem kapsülü tamamen ortaya çıkarın ve patellar ligamenti görselleştirin.
  3. Medial kollateral ligamentin (MCL) üzerindeki fasyayı ince enjeksiyon iğnesi kullanarak inceleyin ve kesin.
  4. MCL'yi büyütme altında mikromakasla kesin.
  5. Bir iğne ile patellar bağı yerinden çıkararak eklem içi boşluğu açığa çıkarın ve medial meniskusu tespit edin.
  6. Kesimden sonra medial meniskosibiyal bağı (MMTL) mikromakasla kesin ve meniskusun tam ayrılmasını ve hareketliliğini doğrulamak için dokunun iğneyle nazikçe incelen.
  7. Ön çapar bağı (ACL) tespit edin ve kesin, arka çapraz bağ (PCL) veya lateral menisküs hasarını önlemeye özen gösterin. Bu genellikle ameliyat sonrası pozitif ön çekmece işaretine yol açar ve eklem dengesizliğini doğrular.
    NOT: Çekmece testi: Yara kapanmadan önce, bir elle uyluk kemiği stabilize edilirken, diğer eliyle bilek tutulurken, tibia ve femur dik konumda tutulurdu. Tiba ile femur arasındaki göreceli anteroposterior yer değiştirme manuel olarak uygulandı; Gözlemlenebilir translasyon hareketi pozitif bir çekmece işareti gösterdi ve çapraz bağ bozulmasını doğruladı.
  8. Daha şiddetli osteoartrit indüksiyonu yapmak için, alternatif olarak, hem ön çapraz bağın (ACL) hem de arka çapraz bağın (PCL) eşzamanlı transeksiyonu ve medial menisektomi (MMT) ile birlikte (klasik Hulth modelinde olduğu gibi) gerçekleştirilin.
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve gerektiğinde yapılabilir; seçilirse, bu klasik Hulth modelinin modelleme yaklaşımını oluşturur.

3. Ameliyat sonrası bakım

  1. Kesiyi 4-0 naylon dikişlerle kapatın ve cerrahi bölgeyi iyot tentürüyle dezenfekte edin.
  2. Fareyi bilincini geri kazanana ve normal nefes ve motor aktivite gösterene kadar sıcaklık kontrollü bir ısıtma pedinin üzerine koyun. Tamamen iyileştikten ve hiç sıkıntı belirtisi göstermediğinde, onu yuvasına geri gönderin.
  3. Ameliyattan sonra 3-5 gün boyunca dikiş bütünlüğünü sürekli izleyin. Dikiş kırılması tespit edilirse, fareyi yeniden anestezi yapın ve yeniden dikme işlemi yapın
  4. Ameliyat sonrası enfeksiyonu önlemek için ameliyattan sonra 3 güne kadar intrakas antibiyotik uygulanır.
    NOT: Antibiyotik uygulaması ameliyat sonrası enfeksiyona karşı profilaksi amacıyla kullanılır. Ameliyat sonrası analjezi deneysel hedeflerle belirlenir; Osteoartrit araştırmalarında, ağrı aljezikleri genellikle akut aşamada terapötik etkinlik değerlendirmesini karıştırmamak için saklanır.
  5. Ameliyat alanını şişlik, akıntı veya lokal iltihap belirtileri için günlük olarak izleyin.
  6. Fareyi çalışma noktasında ötenazi yapın, onaylanmış protokollere uygun şekilde ve diz eklemini histolojik veya görüntüleme analizi için disekiye edin.
    NOT: Bu adımda, deneysel hayvanların aşırı doz anestezi yoluyla ötenazi edilmesi protokolünü benimsedik. Bu, farelerde >100 mg/kg dozda pentobarbital sodyum çözeltisi intraperitoneal enjeksiyonla sağlandı.

4. OA gelişiminin değerlendirilmesi

  1. Ötenazi öncesi, eklem şişliğini değerlendirin ve diz eklemindeki yapısal değişiklikleri değerlendirmek için ultrasonografi yapın. Rotarod testi yaparak farenin motor performansını değerlendirin.
    NOT: Farelerde ultrason muayenesi için izofluran anestezisi gereklidir.
  2. Ötenazi sonrası, diz eklemini disseksiye edin ve çevresindeki kas ile fasyayı dikkatlice çıkarın, böylece tibia, fibula ve femur korun.
    Eklemleri sabitleyin ve en az 30 gün boyunca %10 etilenediamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisinde kireçten arsifinize edin; böylece tam kalsifikasyon sağlanması için çözeltiyi haftada iki kez değiştirin.
  3. Kireçsiz diz eklemlerini parafine gömüp 4μm 8 kalınlıkta sagital kesitler hazırlayın.
  4. Menisküs net göründüğünde kesitleri toplamaya başlayın. Kesitleri safranin O ve hızlı yeşil ile boyanarak kıkırdak ve subkondral kemik morfolojisini görselleştirin. OARSI9 puanlama sistemi kullanarak kıkırdak bozulmasını değerlendirin.
  5. Safranin O-Fast Green boyama prosedürü (Kullanılan ticari kit, bkz. Malzemeler Tablosu)
    1. Deparafinizasyon ve rehidrasyon
      1. Ksilen ile bölümleri 3 dakika boyunca deparaffize edin, 3 kez tekrarlayın.
      2. Kalıntı ksilen çıkarmak için derecelendirilmiş etanol serisi (%100, %90%, %80) ile yeniden hidre, her biri 2 dakika süreyle.
        NOT: Etanol serisi konsantrasyon sırasına göre azalan şekilde kullanılmalıdır.
      3. 1 dakika damıtılmış suyla durulayın ve kısa bir süre süzürün.
    2. Weigert'in Demir Hematoksilin boyama
      1. Weigert'in çalışma çözümünü kesitlere uygulayın, 5 dakika boya.
      2. 1 dakika damıtılmış suyla durulayın ve kısa bir süre süzürün.
    3. Asit farklılaşması
      1. Asit ayırıcı çözeltiyi kesitlere 15 saniye uygulayın.
      2. 10 dakika suyla yıkayın ve fazla suyu boşaltın.
        NOT: Farklılaşma süresi kritik -- uzun süreli farklılaşma hızlı yeşil boyamanı engellerken, yetersiz farklılaşma derin ve hızlı yeşil boyama ile zayıf safranin alımına yol açar
    4. Hızlı Yeşil boyama
      1. Hızlı yeşil çözeltiyi bölümlere 5 dakika süre, kısa bir süre süz.
      2. Zayıf bir asit çözeltisi uygulayarak kalan hızlı yeşil lekeyi 15 saniye boyunca temizleyin ve kısa bir süre süzürün.
    5. Safranin O boyama
      1. Safranin O çözeltisini bölümlere 4,5 dakika süre.
      2. Fazla safranin O 2-3 saniye çıkarmak için bölümleri hızlıca %90 etanole aktarın.
        NOT: Bu adım, safranin boyamanın yoğunluğuna bağlı olarak uygun şekilde uzatılabilir.
    6. Susuz kalma ve temizlik
      1. Bölümleri %100 etanolde 1 dakika kurut.
      2. Tam susuzluk için ksilen ile kesitleri temizleyin, 2 dakika, 3 kez tekrarlayın.
        NOT: Bu adımda kullanılan ksilen, Bölüm 4.5.1'de kullanılanla karıştırılmamalıdır; çapraz kontaminasyon, kesit kalitesini tehlikeye atabilir.
    7. Nötr Balsam ile montaj
      1. Fazla ksilen buharlaşması için bölümleri bir duman davlumbazına yerleştirin.
      2. Bölümleri çıkarın, numuneye uygun miktarda nötr balsam uygulayın ve dikkatlice örtü örtüsünü kullanın.
      3. Hava kabarcıkları için bölgeleri ışık mikroskobu altında inceleyin ve oradaki kabarcıkları dikkatlice çıkarın.
      4. Bölümleri bir sürgü kutusunda saklayıp 60 °C fırında 24 saat boyunca koyun, böylece nötr balsam tamamen sertleşiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Diz ekleminin boylamasına taramaları, 4 mm tarama adımı ve 0,04 mm eksenel çözünürlüğü olan mikro-ultrason8 sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Ameliyat sonrası 7. günde, 3D rekonstrüksiyon, model grubunda sahte grupla karşılaştırıldığında eklem boşluğu hacminde belirgin bir artış gösterdi (Şekil 2A,B). Rotarod yorgunluk testi 10,11 bu bulguyu doğruladı ve ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Medial meniskusun destabilizasyonu (DMM) ve ön çapraz bağ transeksiyonu (ACLT) modelleri gibi diğer cerrahi modelleme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, modifiye edilmiş Hulth modeli, birleşik bağ ve meniskal yaralanma yoluyla osteoartriti indükler. Belirli yapısal bozulma, farklı düzlemler arasında eklem biyomekaniğindeki değişiklikleri belirler. ACLT4 , dönme stabilitesini (iç ve dış dönüş) zayıflatır ve anteroposterior stabiliteyi azaltır, bu da pozitif çekmec...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Şanghay'daki Bilim ve Teknoloji İnovasyon Eylem Planı (23YF1447900 to CJM), Şanghay Eğitim Geliştirme Vakfı ve Şanghay Belediye Eğitim Komisyonu (23CGA53 to CJM) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U24A6013-XH) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL enjeksiyon şırıngası//Özellikler: 30 G ve Times; 0,13 mm
3D Ultrason Vevo 3100 Görüntüleme SistemiOptikVevo 2100Veri analizi için Vevo LAB yazılımıyla entegre edilmiş yüksek frekanslı ultrason görüntüleme sistemi.
4-0 naylon dikiş//
%75 etanolŞanghay Titan Bilimsel Şirketi, Ltd.G73537O
C57BL/6J erkek fareler (6-8 haftalık)Şanghay Jiesijie Laboratuvarı Hayvan Şirketi, Ltd./
Yıkıcı kremVeetLot: C021123001
İyot tentürü//
İzofluranRWD R650-IE
Mikro forsepsRWD F12013-10
Mikro makasRWD S11035-08
Modifiye Safranin O ve Hızlı Yeşil Leke KitiSolarbioG1371
İğne tutacağıRWD F21001-12
Cerrahi bıçaklar (10#)RWD S31010-01
Cerrahi mikroskopOlympusSZ61

Kaynaklar

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Eklem DejenerasyonuK k rdak Y k mMedial Menisk s Transeksiyonun apraz BaK k Hayvan UltrasonuSinovyal S vSafranin O Boyama
Video yakında

İlgili makaleler