Araştırma makalesi

Fare Adrenal Korteksinden Bölge Zenginleştirilmiş Birincil Kültürlerin Oluşumu

DOI:

10.3791/70403

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare adrenal korteks için zona glomerulosa ve zona fasciculata ile zenginleştirilmiş hücrelerin 2D birincil kültürlerini oluşturmak amacıyla sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım geliştirildi. Bu sistem, her bölgenin temel moleküler ve fonksiyonel özelliklerini koruyarak sinyal yolları, hormon üretimi ve adrenal kortikal hücre davranışının odaklanmış şekilde incelenmesini mümkün kılar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare adrenal bezi mezenkimal hücre tabakası (kapsül) tarafından kapsüllenmiştir ve altta belirli konsantrik bölgelere ayrılmış, özel endokrin işlevlere sahip bir korteks içerir: aldosteron üreten zona glomerulosa (zG) ve kortikosteron üreten zona fasciculata (zF). Bezin ortasında bulunan adrenal medulla, katekolaminler üretir. Her adrenokortikal bölgeden hücrelerin mekanik çalışmaları, bölgeye özgü moleküler, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini koruyan in vitro modellerin olmaması nedeniyle sınırlı olmuştur. Bu sınırlamayı aşmak için, yetişkin fare adrenal bezlerinin mikrodiseksiyonu kullanılarak bir fraksiyonlaştırma yaklaşımı geliştirilmiştir. Bu yöntem, erkek farelerden adrenal hücreleri kapsül ve zG hücrelerini içeren zG zenginleştirilmiş dış fraksiyona (OF) ayırır ve zF ile meduller hücreleri içeren zF ile zenginleştirilmiş iç fraksiyonu (IF) içerir. Bu fraksiyonlar, zG veya zF hücreleri için zenginleştirilmiş iki boyutlu (2D) birincil kültürler üretmek için kullanıldı. Gen ekspresyonu analizi, zG ile zenginleştirilmiş kültürlerin yüksek seviyelerde zG belirteçleri (Cyp11b2, Dab2 ve Shh) ve artan Wnt/β-katenin yol belirteçleri (Wnt4, Lef1) olduğunu doğruladı. Buna karşılık, zF ile zenginleştirilmiş kültürler zF belirteçlerinin (Cyp11b1 ve Akr1b7) daha yüksek ekspresyonu ve Wnt/β-katenin yol belirteçlerinin daha düşük seviyeleri gösterdi; bu da zF transkripsiyonel imzası ile tutarlıdır. Steroidojenik belirteçlerin (Nr5a1, Star) ekspresyonu her iki hücre fraksiyonunun adrenokortikal kökenini doğruladı. Tirozin hidroksilaza, zF ile zenginleştirilmiş kültürlerde adrenal meduller hücrelerin varlığını gösterir. Fonksiyonel olarak, zG ile zenginleştirilmiş kültürler bazal koşullarda aldosteron üretmiş ve anjiyotensin II, potasyum ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) ile yanıt olarak artan üretim göstermiştir. Buna karşılık, zF ile zenginleştirilmiş kültürler başlangıçta kortikosteron üretmiş ve ACTH uyarısına yanıt olarak artan üretim göstermiştir. Genel olarak, bu protokol adrenal korteks biyolojisini incelemek için sağlam, tekrarlanabilir ve biyolojik olarak ilgili bir in vitro modeli temsil etmektedir. Bu sistem, sinyal yolları, moleküler mekanizmalar ve fizyolojik yanıtların bölgeye özgü incelenmesini mümkün kılar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnce bir mezenkimal kapsül, fare böbreküstü bezini kapsüller; bu bez iki ana bölmeden oluşur: dış korteks ve iç medulla. Yetişkin erkek farenin adrenal korteksi ayrıca ayrı bölgelere ayrılmıştır: zona glomerulosa (zG) ve zona fasciculata (zF), her biri benzersiz morfolojik ve fonksiyonelözelliklere sahiptir 1,2,3,4. Adrenal korteksin birincil işlevi, mineralokortikoidler (aldosteron) ve glukokortikoidler (farelerde kortikosteron) dahil steroid hormonlarının üretimidir.5. zG, en dıştaki ve en kompakt bölgedir ve rozet yapılarında organize edilmiş oval hücrelerden oluşur; bu hücreler aldosteron sitsezini (CYP11B2) ifade eder; bu hücreler aldosteron 2,3,5,6,7 üretimini sağlar. Aldosteron salgısı öncelikle renin-anjiyotensin-aldosteron sistemi (RAAS), potasyum ve daha az ölçüde ACTH 5,8 tarafından düzenlenir. zF, radyal kordlar/fasiküller halinde düzenlenmiş daha büyük hücrelerden oluşur, korteksin çoğunluğunu (~%85) oluşturur ve esas olarak ACTH 2,3,5,9 ile düzenlenir. Birden fazla sinyal yolu, progenitor hücre dinamiklerini, zonasyonunu ve steroidojenik aktivitesini düzenleyerek adrenal bez gelişimini, bakımını ve işlevini organize eder. Bunlar arasında SF-1 (Steroidojenik Faktör-1, Nr5a1), adrenokortikal spesifikasyon, proliferasyon ve hormon üretimi için gerekli bir ana düzenleyicidir. zG'de aktif olan sonik kirpi (Shh) sinyalizasyonu, öncül hücrelerin genişlemesini teşvik eder ve zG 11,12,13'te kortikal yenilenmeyi destekler.

Wnt sinyalizasyonu, özellikle kanonik β-katenin yolu üzerinden, adrenal zonasyon ve kortikal bütünlük için kritik öneme sahiptir. Farende, normal adrenokortikal boyut ve zonasyon, kapsülden zF'ye uzanan WNT sinyal aktivitesinin gradyanı ile düzenlenir. Bu gradyan, WNT ligandlarının ve güçlendiricilerin, özellikle zG'deki WNT4 vekapsüldeki WNT2B ve R-spondinlerin (RSPO1 ve/veya RSPO3) lokal ifadesiyle desteklenir 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Adrenal korteks, subkapsüler/dış zG bölgesinde bulunan proliferatif aprogenitör hücrelerden gelen hücrelerin merkez yaprak akışıyla korunur; bu hücreler, zF'ye doğru içe doğru göç eden farklılaşmış zG hücrelerine yol açar. Hücreler zG'den zF'ye geçiş yaparken, gen ifadesi ve fonksiyonunda trans-farklılaşma olarak adlandırılan değişiklikler geçirirler. Bu model, özellikle zG23,24,25'teki aldosteron üreten hücreleri hedef alan AS Cre/+ transgenik fare hattı kullanılarak uygulanan soy izleme çalışmalarıyla güçlü şekilde desteklenmiştir.

Tüm adrenal bezin ayrılmasına dayalı adrenal biyolojiyi incelemek için birkaç in vitro yaklaşımkullanılmıştır 26,27,28. Örneğin, bir çalışmada elektrofizyolojik ve yama-kelepçe analizleri için adrenal korteksin dissosiyasyonutanımlanmıştır 27, başka bir çalışmada ise adrenal kortikal hücrelerin adrenal fizyolojisi ve kan basıncı düzenlemesiyle ilgili sinyal mekanizmalarını incelemek için dissosiyasyon yapmıştır26. Bu metodolojiler önemli fonksiyonel içgörüler sağlamış olsa da, hücre kültüründen önce kortikal bölgelerin ayrılmasına değil, tüm adrenal preparatlardan alınan hücrelere dayanır.

Adrenal bezin karmaşıklığı ve histolojik çeşitliliği göz önüne alındığında, hücresel bölümlerinin farklı rollerini anlamak, adrenal fonksiyonun altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için gereklidir. Bu çalışmada, zG veya zF hücreleri için zenginleştirilmiş birincil fare adrenokortikal hücre kültürleri belirlendi. Bu yöntemin önemli avantajlarından biri, zG ile zenginleştirilmiş hücre kültürlerinin üretilmesidir; bu da sinyal yolları ve çevresel faktörlerin deneysel modülasyonunu mümkün kılarak adrenal korteks biyolojisindeki özgün rolünü daha iyi araştırır. Bu, öncü hücre bakımının incelenmesini, zonal plastisitenin ve zF'ye doğru trans-farklılaşmanın altında yatan mekanizmaları ve ekstrahücre matriks bileşiminin modellemesini içerir. Paralel olarak, bu yöntem yüksek zenginleştirilmiş zF hücre kültürleri üretir ve bölgeye özgü fonksiyonel ve sinyal çalışmaları için tamamlayıcı bir platform sağlar. Bu özellikler birlikte, adrenal biyolojinin anlaşılmasını ilerletmek için sağlam, deneysel olarak kontrol edilen bir sistem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokollere uygun olarak 00002611 onay numarasıyla gerçekleştirildi. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin tam listesi, reaktifler, sarf malzemeleri ve ekipman dahil olmak üzere, Malzeme Tablosu'nda sunulmuştur; ayrıca tekrarlanabilirliği sağlamak için ilgili üreticiler ve katalog numaraları da yer alır.

Fare adrenal zona glomerulosa ve zona fasciculata hücrelerinin birincil kültürleri
Bu çalışmada yetişkin erkek fare vahşi tip (Mus musculus, C57BL/6) adrenokortikal hücrelerinin birincil kültürlerinin oluşturulmasında kullanılan yöntemler, orijinal olarak Sprague-Dawley fareleri için geliştirilen birprosedürden uyarlanmıştır 28. Zona glomerulosa ve zona fasciculata hücre popülasyonlarının ayrımı ve kimliğini doğrulamak için, Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (diğer adıyla Cre)fareleri 1,2,3,4 ve Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (ROSAmT/mG olarak da bilinir)fareleri 29 kullanılarak bir soy izleme modeli kullanılmıştır.

İşlemden önce hazırlık
Malzemeler
Yüzeysel kesiler için iki set forseps ve makas ile karın boşluğunun kesisi için bir set daha (Ek Şekil 1A). Kültür ortamı ve PBS (37 °C) ısıtıldı. DMEM/F-12 ile 2 yemek (P60) hazırladım. Bezleri sırayla yıkamak için ısıtılmış PBS ile 3 tabakta (P60) hazırlandı (banyo 1, 2 ve 3) (Ek Şekiller 1B, 1–3) ve adrenal kulümü çözeltide tutmak için 1 tabak (Ek Şekiller 1B, 4). Yüzeyine steril filtre kağıdı ile 2 tabak (P60) hazırlandı (Ek Şekiller 1C, 1–2). 500 μL sindirim çözeltisi ile 2 P60 tabağı hazırladım ve glomerulosa (zG) veya fasciculata (zF) için etiketledim (Ek Şekiller 1D, zG, zF). 2 tüp hazırladım, zG ve zF etiketi verildi ve 4,5 mL sindirim çözeltisi eklendi.

Çözümler
Sindirim çözeltisi yapmak için, kollagenaz tip I (nihai konsantrasyon 4 mg/mL) ve DNaz I (nihai konsantrasyon 0,04 mg/mL) 5 mL saf DMEM/F-12 ortamında çözüldü. Çözeltiyi bir şırınga ve 0.22 μM filtre kullanarak 50 mL'lik bir tüpe filtre geçirdim. Sindirim çözeltisi her seferinde taze hazırlanmalıdır.

Hayvanlar
Fare adrenal zona glomerulosa ve zona fasciculata hücreleri için zenginleştirilmiş birincil kültürler elde etmek için, yaklaşık 6–7 haftalık 10–15 genç yetişkin erkek fare kullanın. Dişilerin adrenal bezleri erkeklere göre biraz daha büyüktür ve bu protokolle her iki cins de kullanılabilir. Ancak bu çalışmada, genç dişilerde bulunan X bölgesinin potansiyel müdahalesini önlemek için sadece erkekler kullanıldı ve böylece doğru bölgesel ayrım sağlandı. Fareler, kurumsal hayvan bakım yönergelerine uygun olarak CO₂ solumasıyla ötenazi edildi. Ölüm, solunumun olmaması ve refleks tepkisinin olmaması nedeniyle doğrulandı. Adrenal bezler, ölümün doğrulanmasından hemen sonra, 3–5 dakika içinde diseksiyon yapıldı, böylece doku canlılığı korundu.

Karın bölgesinin konumu ve açıklığı
Fare steril düz bir yüzeyde dorsal dekübütüs pozisyonuna yerleştirildi (Şekil 1A). Hayvanın kürkü %70 alkolle dezenfekte edildi. Deri kesileri için forseps ve makas kullanıldı, ikinci set ise karın boşluğu kesisi için kullanıldı. Karın inguinal bölgesinde ilk kesi yapıldı ve her iki tarafta toraks yönünde lateral olarak uzanarak peritoneumu ortaya çıkardı (Şekil 1B). Deri dikkatlice geri çekilmiş, ardından karın kasları tarafından karın boşluğu ortaya çıkarılmıştır (Şekil 1C). İlk kesi, iç organlara zarar vermemek için yüzeysel olmalıdır. Dikkatli bir kesi ile kas tabakasına ilerleyin, ardından karın boşluğunu açığa çıkarın. Kan damarlarının yırtılmasından kaçının, çünkü kanama böbreküstü bezlerinin yerini zorlaştırabilir ve toplanmayı geciktirebilir. Mikrobiyal kontaminasyonu en aza indirmek için cerrahi aletleri değiştirin.

Sol adrenal bezin tanımlanması ve toplanması
Sol adrenal bez, retroperitoneumda sol böbreğe karşı medial ve üstünde yer alır; oval şekilli ve pembe renktedir ve beyaz yağ dokusu ile çevrilidir (Şekil 1D–G). Görselleştirmeyi iyileştirmek için bitişik organları dikkatlice künt forsepsle yerinden ederken, kısa ve kontrollü kesiklerle yağ dokusunun çoğunu makasla çıkararak adrenal bezi izole edin. Kapsülün zarar görmesini önlemek için böbreküstü bezini doğrudan tutmaktan kaçının. Bez, izolasyondan hemen sonra 10 mL önceden ısıtılmış DMEM/F-12 ile 37 °C'de bir P60 kültür kabına yerleştirildi (Şekil 1F).

Sağ adrenal bezin tanımlanması ve toplanması
Sağ adrenal bez, retroperitoneumda sağ böbreğin üstünde ve lateral olarak yer alır, oval şekilli ve pembe renkte (Şekil 1E–H). Bu adrenal bezin tanımlanması, karaciğer ve yükselen kolon gibi diğer organlara ve yakındaki kan damarlarına yakın olması nedeniyle daha zor olabilir. Görselleştirmeyi iyileştirmek için bitişik organları dikkatlice künt penslerle yerinden ederken, kısa ve kontrollü kesiklerle yağ dokusunun çoğunu makasla çıkarın; adrenal bezi izole edin ve kapsüle zarar vermemeye özen gösterin. Bez, izolasyondan hemen sonra 10 mL önceden ısıtılmış DMEM/F-12 ile 37 °C'de bir P60 kültür kabına yerleştirildi. Adrenal bakteriler aynı tabakta birleştirilir (Şekil 1F). İşlem sırasında, bölgedeki ana kan damarlarını dikkatlice ele almak önemlidir; böylece kazara kesikler oluşmamalıdır; bu kesikler kanamaya yol açabilir ve toplama sürecini zorlaştırabilir. Dikkat edilmesi gereken başlıca damarlar böbrek damarları ve böbrek arterleridir. Adrenal bezi biraz yapışmış yağ dokusu ile topladı. Bu, bezin işlenmesini kolaylaştırır ve kapsül hasarı ile kontaminasyonuna karşı koruma sağlar (Şekil 1I).

Steril laminar akış başlıkta çalışma
Bezler laminar akış başlığına aktarılmadan önce, kab %70 alkolle temizlendi. Adrenal böbrükler oda sıcaklığında (25 °C) üç kez PBS ile yıkanmış (1, 2 ve 3 tabaklarda ve 4. tabakta toplanmıştır) (Ek Şekil 1B). Filtre kağıdı yağ yapışmasını sağlar ve daha iyi sonuçlar sağlar. Birden fazla bezin hazırlanması sırasında, ayrılmış dokular canlı kalma için önceden ısıtılmış DMEM'de tutulmalıdır. Adrenal bez, yapışan yağ dokusu tarafından tutuldu (Şekil 1I–J) ve yağ dikkatlice filtre kağıdına ayrıldı (Ek Şekil 1C, tabak 1), kapsüle zarar vermemek için ince forseps ve kontrollü hareketlerle yapıldı. Beklenen sonuç, Şekil 1K'da gösterildiği gibi, fazla yağ ve bağ dokusundan arınmış pürüzsüz, sağlam bir bezdir. Adrenal bezler, hassas mikrodiseksiyon için dikkatlice taze filtre kağıdına (Ek Şekil 1C, tabak 2) aktarıldı. Kapsül ince forsepsle nazikçe sıkıştı ve bistüm bıçağı kullanılarak, dokuyu tamamen kesmeden bezde radyal bir kesi yapıldı.

Korteksin iç içeriği, forsepsle hafif mekanik baskı uygulanarak kesi yoluyla dışa doğru nazikçe dışarı çıkarıldı. Kapsül ve zG, forsepsin ucuna bağlı kalırken, iç dışarı atılan bez maddesi zF ve medulla'ya karşılık gelirdi. Enzimatik sindirim, dış ve iç bölgelerin mekanik ayrılması nedeniyle tüm bezler işlendikten sonra başlatılmalıdır (Şekil 1L).

Sindirim
İki tüp OF (Dış Fraksiyon: kapsül ve zG) veya IF (İç Fraksiyon: zF ve medulla) olarak etiketlendi (Şekil 1M). Toplam 4,5 mL önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi (37 °C) eklendi ve OF ile IF uygun tüplere aktarıldı. Örnekler, %5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka altına alındı ve tüpler her 10 dakikada bir nazikçe dönerek 2–3 kez manuel olarak ters çevrilerek enzim çözeltisine eşit maruziyet sağlandı. Sindirim süresi, kollajenazın kalitesi, aktivitesi ve depolama koşullarına bağlı olarak değişebilir. 30 dakika sonra, doku 40 kez pipetle yavaş ve kontrollü darbelerle yukarı ve aşağı pipetle ayrıldı; 5 mL'lik serolojik pipet kullanılarak tek hücreli bir bulamaç oluşturuldu. Dokunun ayrılmasından sonra, ideal olarak, görünür bir parça kalmamalı ve ortam bulutlu görünmelidir. Eğer parçalar hâlâ mevcutsa, ek 15 dakikalık bir sindirim düşünülebilir.

Yıkama ve kaplama
Sindirimin ardından, hücreler 45 mL DMEM/F-12 ekleyerek kalıntı enzimi gidermek için yıkanmıştır (Şekil 1 M). Örnekler 150 × g sıcaklıkta, oda sıcaklığında (25 °C) 12 dakika boyunca santrifüjlendi. Santrifüjlemeden sonra, hafif pembemsi veya soluk sarı görünüme sahip küçük ve kompakt bir pelet beklenirken, üst yüzey şeffaf ve görünür partiküllerden arındırılmalıdır. Üst madde dikkatlice çıkarıldı ve atıldı, peletin rahatsız edilmemesine dikkat edildi. Pellet, kaplama için gereken son hacme göre önceden ısıtılmış (37 °C) kültür ortamında yeniden askıya alındı (aşağıya bakınız). Kültürün canlılığı ve canlılığını sağlamak için yaklaşık %70 optimal kaplama yoğunluğu korundu. Hücre sayısı, kaplamadan önce Neubauer sayım odası kullanılarak tahmin edildi ve tohumlanan hücre sayısı, kültür tabağı alanına göre istenen birleşim noktasına göre ayarlandı. zG ile zenginleştirilmiş dış fraksiyon (OF) hücrelerini yaklaşık bir hayvan yoğunluğunda (genellikle ~1,5–2,5 × 104 hücre elde eder) ve zF ile zenginleştirilmiş iç fraksiyon (IF) hücrelerini kuyu başına ~0,63 hayvanla (genellikle ~2,5–4,0 × 104 hücre) 48 kuyruklu bir plakaya yerleştirin.

Hücre kültürü bakımı
Hücreler, yukarıda tanımlanan Kültür Ortamında kültürlendi ve standart koşullarda, %5 CO₂ ile 37 °C nemli kuluçka ayakta tutuldu. 24 saat kültür sonrası, kalıntı ve kalıntı kan hücreleri gidermek için ortam değiştirildi. Bu adım, optimal büyümeyi destekler. Tabak dikkatlice aspirasyon yapıldı ve taze önceden ısıtılmış (37 °C) ortam eklendi. Fonksiyonel deneylerde hücreleri değerlendirmeden önce en az 48 saat bekleyin. Kültürlerin iyi yerleştiğinden emin olmak için fonksiyonel deneyler yapmadan önce üç gün beklemeniz önerilir. Bu dönemin ötesindeki genişletilmiş kültür, tripsisasyon ve geçiş gerektirebilir; bu da hücre seçimine ve birincil kültür özelliklerinin kaybına yol açabilir.

Veri analizi ve destekleyici prosedürler
Birincil adrenal hücre kültürlerinin hazırlanması
Tüm adrenal bezlerin birincil kültürleri, doku toplama, sindirim, yıkama ve kaplama işlemleriyle oluşturuldu ve moleküler ve fonksiyonel testler için standart kontrol olarak kullanıldı.

Gen ifade analizi
OF ve IF hücrelerinden toplam RNA'yı arıtmak için, üreticinin protokolüne göre kültürlenen hücreler RNA kiti kullanılarak TRIReagent'te homojenleştirildi. RNA bütünlüğü ve konsantrasyonu spektrometri kullanılarak değerlendirildi. Toplam RNA'nın daha fazla işlenmesi, yüksek kapasiteli cDNA ters transkripsiyon kiti kullanılarak cDNA'ya ters transkripsiyonu içeriyordu. Gen ifade analizi, termosikler kullanılarak gerçek zamanlı nicel PCR (qPCR) ile gerçekleştirilmiştir. Değişkenliği kontrol etmek için teknik kopyalar kullanıldı. TaqMan Universal PCR Master Mix ve fare TaqMan primerleri kullanıldı (Tablo 1). Her örnek tekrarı için doğrusal amplifikasyon aralığında bir döngü eşiği (CT) değeri seçildi. Endojenöz kontrol genleri β-aktin ve ribozomal protein 18S (Rps18) tarafından normalleştirildi. İlişkili ifade seviyeleri 2–ΔΔCt yöntemi 30 kullanılarak hesaplandı. Üç farklı deneyden elde edilen veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Üç bağımsız deney yaptık.

Primer ZG ve ZF kültürlerinde aldosteron ve kortikosteron salgısının uyarılması
Zona glomerulosa (ZG) ve zona fasciculata (ZF) hücrelerinin birincil kültürleri kuruldu ve %5 CO₂ içeren nemli bir atmosferde 37 °C sıcaklıkta tutuldu. Yaklaşık 5 × 104 hücre, tam büyüme ortamı kullanılarak 48 kuyruklu bir plakada kaplandı. Dört gün boyunca sürekli kültür yaptıktan sonra, bazal salgı ölçümleri bu zaman dilimindeki kümülatif hormon üretimini yansıttı. Uyarı testleri için ortam aspire edildi ve hücreler bir kez fosfatla tamponlu tuzlu (PBS) yıkanarak kalıntı faktörleri çıkardı. Daha sonra, her kuyuya 200 μL taze ortam eklendi ve aşağıdaki testler, belirli bir zaman aralığı içinde akut uyarılı salgıyı temsil etmektedir. Aldosteron stimülasyon testleri için, kültür ortamı anjiyotensin II (Ang II, 10 nM), potasyum (K+), potasyum klorür olarak (KCl, 10 mM) ve ACTH (10 nM) ile takviye edildi. Araç kontrolü olarak sodyum klorür (NaCl, 10 mM) kullanıldı. Kortikosteron stimülasyon testleri için aynı prosedürler uygulandı, ancak ortam araç kontrolü olarak ACTH (10 nM), forskolin (10 μM) veya NaCl (10 mM) ile takviye edildi. 37 °C ve %5 CO₂ sıcaklıkta 6 saat kuluçka sonrası, kültür süperatantları toplanıp −80 °C'de depolanarak daha önce tanımlandığı gibi hormon miktarı belirlenmiştir. Kalan yapışkan hücreler protein ekstraksiyonu için lizize edildi ve hormon seviyeleri, ilgili lizatın toplam protein içeriğine normalleştirildi.

Aldosteron ve kortikosteron ölçümlerinin protein ekstraksiyonu ve normalizasyonu
Protein ekstraksiyonu, RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponu kullanılarak gerçekleştirildi; 1x halt proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklendi. Hücreler, P200 pipet ucu kullanılarak 15 kez yukarı ve aşağı pipetlenerek yeniden süspansiyona alındı ve ardından bir prob sonikatörü ile soniklendi. Protein konsantrasyonu, üreticinin talimatlarına göre BCA protein test kiti ile belirlendi.

Radyoimmünoassay (RIA) ile aldosteron ölçümü
Hücre kültürü süpernatantlarındaki aldosteron konsantrasyonu, üreticinin protokolüne uyarak belirlendi. Kısaca, PBS'de 50 μL süpernatan ve %150 μL BSA ile birlikte 500 μL aldosteron radyoaktif izleyici, aldosteron antikor kaplı tüplere eklendi. Karıştırdıktan sonra, tüpler oda sıcaklığında (25 °C) 18 saat kuluçka altına alındı. Daha sonra kuluçka karışımı dekantasyon yapıldı ve tüplerdeki radyoaktivite Cobra II oto-gammasayacı 31 kullanılarak sayıldı. Aldosteron seviyeleri, daha önce tanımlandığı gibi, toplam proteine normalize edildi.

Kortikosteron ölçümü
Hücre kültürü süpernatantlarındaki kortikosteron konsantrasyonları, üreticinin protokolüne uygun olarak fare ve sıçan kortikosteronuna özel rekabetçi enzim bağlantılı immünosor testi (ELISA) kiti kullanılarak ölçüldü. Kortikosteron seviyeleri, daha önce tanımlandığı gibi toplam proteine normalizeedildi 32.

İmmünboyama
İmmünofluoresans hem parafinle gömülü adrenal kesitlerde hem de Poli-L-lizin ile kaplanmış önceden işlenmiş cam kapak kapaklarında yetiştirilen kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirildi. Tüm örneklerde, PBS'de %5 normal keçi serumu (NGS) ile bloklama yapıldı ve çekirdekler DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol, 1:1000) ile karşı boyama yapıldı. Slaytlar ve örtü kağıtları, kuluçka aşamaları arasında %0,1 Tween-20 ile PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkandı. Boyamadan sonra örnekler Antifade montajı ile monte edilip görüntülenene kadar karanlıkta saklandı. Doku kesitleri: Adrenal parafin bölümleri ksilende deparafinize edildi, ardından dereceli etanol serisi (%100, %95, %70) ile durulandı ve son olarak PBS ile durulandı. Antijen toplama, Tris-EDTA tamponunda (10 mM Tris bazı, 1 mM EDTA, %0,05 Tween-20, pH 9,0) 95 °C'de 20 dakika boyunca ısıtıldı. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, bölümler PBS'de yıkanıp %5 NGS ile 1 saat boyunca bloklandı. Bölümler, PBS'de %5 NGS'de 1:100 oranında seyreltilmiş birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kuluçka altına alındı: fare anti-Dab2, tavuk anti-GFP ve tavşan anti-RFP. Aşağıdaki ikincil antikorlar kullanıldı (1:300): Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG, Alexa Fluor 594 keçi anti-tavuk IgY ve Alexa Fluor 647 keçi anti-tavşan IgG.

Kültürlenmiş hücreler: Kaplama örtüsünde immünoflüoresans işlemi kaplamadan dört gün sonra yapıldı. Hücreler, önceden ısıtılmış %4 paraformaldehit (PFA) ile 37 °C'de 15 dakika boyunca sabitlendi ve PBS ile üç kez yıkandı. Bloklama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de %5 NGS kullanılarak gerçekleştirildi. Coverslipler, fare anti-Dab2 ile gece boyunca 4 °C'de inkubasyon edildi (%5 NGS/PBS'de 1:100), ardından Alexa Fluor 488 keçi anti-fare (1:500) ile inkubasyon edildi.

Görüntü alımı: Kültürlenmiş hücrelerin parlak alan ve floresan görüntüleri (mGFP ve mTomato) mikroskop sistemi kullanılarak alındı. mGFP floresansı yeşil floresans için bir filtre seti kullanılarak yakalandı (uyarılma: 470 nM, emisyon: 525 nM), mTomato floresansı ise kırmızı floresans için bir filtre setiyle yakalandı (uyarılma: 585 nM, emisyon: 624 nM).

Yazılım ve istatistiksel analiz
Görsel özetler, şematik diyagramlar ve şekiller, Mayıs 2025'te erişilen Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) ve BioRender (https://www.biorender.com) kullanılarak oluşturuldu. Veriler GraphPad Prism sürüm 10.0 kullanılarak analiz edildi. Mevcut adres: https://www.graphpad.com. Tüm deneyler en az üçlü olarak yapıldı ve sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için bağımsız olarak tekrarlandı. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için Öğrenci'nin t-testi (uygun şekilde eşleşmiş veya eşleşmemiş) kullanıldı. Üç veya daha fazla grubu içeren karşılaştırmalar için, gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları belirlemek amacıyla varyans analizi (ANOVA) ve ardından uygun post hoc testi yapıldı. Sonuçlar ortalama ± SD olarak sunulur. 0,05'in altında olan p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bölge zenginleştirilmiş primer adrenal hücre kültürlerinin oluşturulması ve karakterizasyonu
Primer adrenal hücre kültürleri, zG hücreleri için zenginleştirilmiş OF ve zF hücreleri için zenginleştirilmiş IF ile başarıyla belirlendi. Kültürlenen hücrelerin temsilci görüntüleri Şekil 2A (OF–zG) ve Şekil 2B (IF–zF)'de gösterilmiştir. Bu kültürlerde zG hücrelerinin ve zG olmayan hücrelerin zenginleşmesini değerle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, zG (OF) ve zF (IF) hücreleri için zenginleştirilmiş birincil fare adrenal hücre kültürleri üreten ve her bölgenin zonal kimliğini ve steroidojenik fonksiyonunu sadık bir şekilde özetleyen geliştirilmiş bir protokol sunuldu. Bu protokol, adrenal korteksin hücresel ve moleküler biyolojinin bölgeye özgü bir bağlamda ayrıntılı incelenmesini mümkün kılmalı, proteinlerin, sinyal yollarının ve adrenal korteks gelişimi, farklılaşma, fonksiyon ve yenilenme mekanizmalarının incelenme...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili rekabet eden finansal çıkarları olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, FAPESP (São Paulo Araştırma Vakfı, Brezilya) tarafından desteklendi; proje numarası 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), 2R01DK123694 (DTB'ye) tarafından desteklendi ve Boston Çocuk Hastanesi (DTB) Endokrinoloji Bölümü'nden fon alındı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Konik Tüp (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Steril
0.22 µm Şırınga FiltresiMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSSindirim çözeltisi filtrasyonu
10 mL Tek Kullanımlık ŞırıngaBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Steril
5 mL Serolojik PipetCorning (Corning, NY, USA)4487Steril
10 mL Serolojik PipetCorning (Corning, NY, USA)4488Steril
Filtreli Pipet Uçları (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SSteril
Filtreli Pipet Uçları (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SSteril
P60 Kültür KabıCorning (Corning, NY, USA)430166Doku kültürü işlemi
48 kuyuluk PlakaCorning (Corning, NY, USA)3527Doku kültürü işlemi
Steril Filtre KağıdıYokYokYağ çıkarma ve diseksiyon desteği
DMEM/F-12 OrtamıGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)113200331:1 formülasyon
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Isı ile inaktive edilmiş
ITS TakviyesiGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX TakviyesiGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penisilin-Streptomisin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiyotik
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7.4
Kollajenaz Tip IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Dokunun sindirimi
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Dokunun sindirimi
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Hormon stimülasyonu
Adrenokortikotropik Hormon (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Hormon stimülasyonu
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886cAMP stimülasyonu
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Aldosteron stimülasyonu
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Araç kontrolü
Küçük Cerrahi MakasFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Diseksiyon
Tek Kullanımlık Bıçaklı SkalpelFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Mikrodiseksiyon
İnce ForsepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Diseksiyon
Eğri ForsepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Diseksiyon
Laminer Akış DavlumbazıThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)YokSteril doku işleme
İnkübasyonThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)YokHücre kültürü
SantrifüjEppendorf (Hamburg, Germany)YokHücre peletleme
Neubauer Sayım OdasıHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Hücre sayımı
RIPA Lizi ve Ekstraksiyon TamponuThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Protein ekstraksiyonu
Halt Proteas İnhibitör KokteyliThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Protein ekstraksiyonu
Fisherbrand Model 120 Sonik DismembrantörThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonikasyon
RIA SistemiTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Hormon kantifikasyonu
Cobra II Otomatik Gamma SayacıBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)YokRadyoaktivite ölçümü
Kortikosteron ELISA Kiti (96 kuyu)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Hormon ölçümü
ProLong Gold Antifade Montaj MaddesiThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Montaj ortamı
Fare anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Birincil antikor
Tavuk anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Birincil antikor
Tavşan anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Birincil antikor
Alexa Fluor 594 Keçi anti-FareInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005İkincil antikor
Alexa Fluor 594 Keçi anti-TavukInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042İkincil antikor
Alexa Fluor 647 Keçi anti-TavşanInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244İkincil antikor
Alexa Fluor 488 Keçi anti-FareThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001İkincil antikor
EVOS Mikroskop SistemiThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)YokGörüntüleme
TRI ReaktifiSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424RNA ekstraksiyonu
Direct-zol RNA KitiZy

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).
  3. Freedman, B. D., et al. Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells. Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).
  4. Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function. Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).
  5. Gwynne, J. T., Strauss, J. F. The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).
  6. Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex. J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).
  7. Leng, S., et al. β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis. Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).
  8. Rainey, W. E. Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase. Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).
  9. Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).
  10. Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation. Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).
  11. Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Ching, S., Vilain, E. Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia. Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).
  14. Kim, A. C., et al. Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex. Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).
  15. Berthon, A., et al. Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).
  16. Basham, K. J., et al. A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis. Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).
  17. Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice. Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).
  18. Heikkilä, M., et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).
  19. Drelon, C., et al. PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development. Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).
  20. Heaton, J. H., et al. Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin. Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).
  21. Borges, K. S., et al. Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice. Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).
  22. Borges, K. S., et al. Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production. bioRxiv. , (2024).
  23. Sasano, H. Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal. Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).
  24. Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex. PLoS One. 8 (12), e81865(2013).
  25. Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).
  26. Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa. Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).
  27. Penton, D., et al. Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension. Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).
  28. Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line. Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  30. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  31. Berber, M., et al. Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions. J. Clin. Invest. , (2026).
  32. Smith, T. T. G., et al. Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders. BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).
  33. Kremer, J. L., et al. Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex. J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).
  34. Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).
  35. Pignatti, E., et al. Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation. Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).
  36. Romero, D. G., et al. Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion. Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).
  37. Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice. Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).
  38. Vidal, V., et al. The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3. Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).
  39. Dörner, J., et al. GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).
  40. Guo, Y., et al. 3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development. Clin. Lab. 70 (12), (2024).
  41. Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice. STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).
  42. Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures. Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).
  43. Gazdar, A. F., et al. Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).
  44. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

B lge Zenginle tirmeFare Adrenal BeziMikrodissectionGen EkspresyonuZona GlomerulosaZona FasciculataSteroidojenik Mark rlerWnt Beta Katenin

İlgili makaleler