Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare gözyaşı bezi epitel hücrelerinin kültürlenmesi için iki küçük molekülden oluşan yeni serumsuz 2B ve 3D kültür sistemi

257 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

10 Şubat 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

Bu makalede

Özet

Küçük molekül kombinasyonu 2C (Y27632 ve SB431542) kullanılarak yeni bir serumsuz kültür sistemi tanıtılır; bu sistem, hem 2D hem de 3D kültürlerde lakrimal bez epitel hücrelerini (LGEC) verimli bir şekilde genişleterek çoğalma ve farklılaşmalarının hassas kontrolünü sağlar.

Özet

Lakrimal bez (LG) işlev bozuklukları, sulu yetersiz kuru göz hastalığının başlıca nedenlerinden biridir ve hücre bazlı ile doku mühendisliği tedavileri bu durum için önemli potansiyel göstermektedir. Ancak, serumsuz koşullarda yetiştirilen yeterli tohum hücrelerinin sınırlı bulunması, yaygın uygulamalarını engellemiştir. Bu çalışmada, LG epitel hücrelerini (LGEC) verimli bir şekilde genişletmek için iki küçük molekül olan Y27632 ve SB431542 (2C) kullanılarak yeni bir serumsuz kültür sistemi geliştirdik. LGEC'lerin 2D birincil kültürü için, LG'ler 6-8 haftalık farelerden izole edildi ve Dispase II ile Collagenase A kullanılarak enzimatik olarak sindirildi. Ortaya çıkan hücre süspansiyonu, 7.500 hücre/cm2 yoğunlukta kültür kablarına tohumlanarak 12-14 gün boyunca 2C ile kültürlendi. Hücre birleşimi %80-90'a ulaştığında, 1:2 oranında alt kültür başlatıldı. 3D kültür için, 10.000 P1 LGEC 10 μL 2C ve 10 μL matriks jel içinde yeniden süspansiye alınmış, ardından 24 kuyruklu bir plakanın merkezine tohumlanmıştır. 37 °C'de 30 dakikalık bir katılaşma döneminden sonra, kültürün devam etmesi için 600 μL 2C eklendi. Farklılaştırma için, 3D sferoidler 7 gün boyunca 2C ile kültürlendi, ardından 2C çıkarıldı ve ek 7 gün kültüre devam edildi. 2C ile kültürlenen LGEC'ler, yüksek proliferasyon, kök ve proliferasyon belirteçlerinin (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0.0011, 0.0002, 0.0012, 0.0003, 0.0014]) yüksek proliferasyon gösterdiği görülmüş ve on geçişten sonra bile morfoloji ve proliferatif kapasiteyi korudu. Ayrıca, 3D koşullarda LGEC'ler kök/öncül özelliklere sahip sferoidler oluşturmuş, bu sferoidler daha da farklılaşarak çoklu LG hücre tipi (AQP5, K19, α-SMA-pozitif) ve olgun sekretor fonksiyonlara sahip mikroglandüler yapılara ayrılmıştır. Bu yaklaşımın, doku mühendisliği için stabil bir tohum hücresi kaynağı sağlaması beklenmektedir ve LG fizyolojisini incelemek için yeni bir in vitro model sunar.

Giriş

Göz yaşı bezi (LG), gözyaşı filminin sulu tabakasının üretimi için gereklidir; bu tabaka, göz yüzeyininhomeostazını korumak için çok önemlidir 1. LG'nin işlev bozukluğu, yaralanma veya iltihap nedeniyle oluşur ve sulu yetersiz kuru göz hastalığına (ADDE) yol açar. Bu durum, ciddi göz yüzeyi iltihabı, kronik kornea hastalığı ve ağır durumlarda kalıcı görme kaybına yolaçabilir 2. ADDE için mevcut tedaviler, temel bez disfonksiyonunu ele almadan semptomları yönetir; bu da uzun vadeli etkilerinisınırlar. LG disfonksiyonu için hedefli tedavilerin geliştirilmesi, LG patofizyolojisinin anlaşılmasını kısıtlayan ve etkili tedavilerin geliştirilmesini engelleyen uzun vadeli, basit in vitro modellerin eksikliği gibi çeşitli zorluklar da içermektedir. Hücre nakli LG yenilenmesini teşvik etme potansiyeli gösterse de, in vitro hücrelerin sınırlı genişleme kapasitesi ve mevcut kültür sistemlerinin karmaşıklığı klinik uygulama için önemli engelleroluşturmaktadır 1,3. Bu nedenle, yetişkin fare LG'leri için basit ve uzun vadeli bir kültür sistemi oluşturmak, LG fizyolojisi ve patolojisinin anlaşılmasını ilerletmek ve LG hasarının onarımı ve yenilenmesi için güvenilir bir LG kök/progenitör hücre kaynağı sağlamak için gereklidir.

LG için mevcut in vitro kültür sistemleri önemli ilerlemeler kaydetmiş, ancak hâlâ belirgin sınırlamalarla karşı karşıya. Bu yöntemlerin çoğu, partiden partiye değişkenlik, tanımlanamayan bileşenler ve fibroblast veya mezenkimal hücre kontaminasyonuriski 4,5,6,7,8 gibi serum takviyeli ortamlara dayanır. Ayrıca, serum bazlı sistemler LG hastalıklarının patojenik mekanizmalarını incelemek için uygun değildir ve potansiyel bağışıklık reddetme riskleri nedeniyle hücre nakli tedavilerinde zorluklar oluşturur9. Bu sınırlamalara yanıt olarak, hem farelerden hem de insanlardan LG epitel hücrelerinin (LGEC) kültürlenmesi için birkaç serumsuz yöntem geliştirilmiştir. Örneğin, Ueda ve ark. yeni doğmuş farelerden LGEC'leri serumsuz bir yöntemlekültüre etmeyi başarıyla 10 kullanmıştır. Ancak bu yöntem, hücrelerin alt kültürlerden geçirilememesi ve yeterli LGEC elde etmek için çok sayıda yenidoğan bezine ihtiyaç duyulması nedeniyle sınırlıydı. Benzer şekilde, Kobayashi ve arkadaşları kolera toksini içeren serumsuz bir kültür sistemi geliştirmiş, ancak11. geçişte hücresel morfolojiyi korumakta zorluklarla karşılaşmışlardır. Son gelişmeler arasında Zhang ve ark.'ın fare LG kök hücreleri için 3D kültür sistemi geliştirmesi ve Bannier-Hélaouët ve ark.'ın hem fareler hem de insanlar için LG organoid kültürsistemi 12,13,14,15 yer almaktadır. Ancak bu sistemler, çok sayıda küçük molekül, büyüme faktörü ve katkı maddeleri içeren karmaşık ortam formülasyonlarına dayanır; bu da kültür sürecini karmaşıklaştırır ve ölçeklenebilirliği sınırlar. Bu zorluklar, LGEC'lerin verimli yayılmasını kolaylaştırabilecek ve aynı zamanda proliferatif ve kök/progenitör özelliklerini koruyabilecek, basitleştirilmiş ve etkili serumsuz bir kültür sistemi gerekliliğini vurgulamaktadır; böylece daha ileri terapötik uygulamalar ve araştırmalar için bu özellikler korunur.

Son yıllarda, küçük molekül aracılı kimyasal yeniden programlamanın hızlı gelişimi, in vitro16 birincil yetişkin hücrelerin korunması ve genişletilmesi için yeni stratejiler ortaya koymuştur. Hücre içi sinyal yollarını, hücre-matris etkileşimlerini ve hücre yapışmasını düzenleyerek küçük moleküller hücre çoğalmasını ve plastisitesini önemli ölçüde artırır, böylece hücre genişleme verimliliği ve kader kontrolünü artırır17. Kontrol edilebilir üretimleri, düşük immünojenliği ve genomik olmayan entegrasyonları nedeniyle, küçük moleküller in vitro yetişkin epitel hücrelerinin genişlemesi için sistemler inşa etmek içinidealdir. Farklı küçük moleküllerin kombinasyonlarının, deri, kornea ve konjonktival epitel kök hücreleri dahil olmak üzere çeşitli birincil hücre tiplerinin in vitro genişlemesini etkili şekilde sürdürdüğügösterilmiştir 18,19,20. Bu nedenle, LGEC'leri genişletmek için küçük molekül tabanlı bir strateji geliştirmek, hem araştırma hem de tedavi ortamlarında gelecekteki uygulamalar için potansiyel göstermektedir.

Bu protokolde, LGEC'lerin genişlemesini desteklemek için iki küçük molekül olan Y27632 ve SB431542 (2C) kullanılarak basit ve verimli serumsuz bir kültür sistemi geliştirildi. Bu iki molekülün avantajlarının birleştirilmesiyle hem 2B hem de 3B kültürler için serumsuz bir sistem oluşturuldu. 2C ile kültürlenen LGEC'ler, en az 10 in vitro geçişten sonra tipik epitel hücre morfolojisini koruyarak yüksek proliferatif kapasite ve kök/progenitör hücre özellikleri sergilemiştir. 3D kültürde, LGEC'ler sadece kök/progenitor hücre özelliklerini korumakla kalmadı, aynı zamanda 2C çıkarıldıktan sonra sekretör yapılara daha da farklılaşma yeteneği göstererek sekretör fonksiyonlu mikroglandular yapılar oluşturdu. Bu serumsuz sistem, LG fizyolojisi ve patolojisinin in vitro modelleri için uygundur ve aynı zamanda LG doku mühendisliği ve rejeneratif uygulamalar için önemli bir hücre kaynağı sağlar. Ancak mevcut protokol sadece 3D kültürün ön bir incelemesini sunmaktadır. Uzun vadeli 3B kültür, bu aşamada bu araştırmanın kapsamının dışında. Bu yöntemin özellikle yetişkin fare LGEC'leri için tasarlandığını ve daha fazla optimizasyon olmadan diğer türlere uygulanmayabileceğini belirtmek önemlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneyler, Jilin Üniversitesi ve Xiamen Üniversitesi Deneysel Hayvan Etik Komitesi ve Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirildi.

NOT: Tüm hücre kültürü işlemleri, hücre ameliyathanesindeki UV sterilize edilmiş bir biyogüvenlik dolabında gerçekleştirilmiştir.

1. LGEC'lerin birincil kültürü

  1. LG dokusunun izolasyonu
    1. Anestezi edilmiş C57BL/6J farelerini (6-8 haftalık) servikal dislokasyon ile ötenazi edin ve kulak bölgesini (LG çevresi) %75 etanol ile dezenfekte ederek kontaminasyonu önleyin.
    2. LG'yi açığa çıkarmak için dış kantustan kulağın altındaki deriye bir kesi yapın. Steril, pürüzsüz forseps ve makas kullanarak, LG'yi çevredeki dokudan (parotis bezleri ve bağ dokusu) dikkatlice bir diseksiyon mikroskopu altında ayırarak LG'yi elde edin.
    3. LG'yi, önceden soğutulmuş doku toplama ortamına (%10 Penisillin-Streptomisin-Amfoterisin içeren DMEM) yerleştirilin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde doku buz üzerinde tutularak bozulmayı en aza indirin.
  2. Doku hazırlığı
    1. LG'leri 3,5 cm içinde yeni bir soğuk doku toplama ortamına aktarın.
    2. Kalan fare tüylerini çıkarın, ardından LG'lerin etrafındaki bağ dokusu kapsülünü soyun. Bez dokusunu lobullar arasındaki bağ dokusunu çıkarmak için pürüzsüz forseps kullanarak izole edin.
      NOT: LG yüzeyindeki kapsül ve lobullar arasındaki bağ dokusunun dikkatlice çıkarıldığından emin olun; böylece lobullar arasındaki kanallar açığa çıkarılır; bu, sonraki sindirim sürecinde sindirim çözeltinin nüfuzunu kolaylaştırır.
    3. Mendi yeni bir toplama ortamına aktarın ve kontaminasyonu önlemek için 5-10 dakika yıkayın.
  3. Enzimatik sindirim
    1. LG'leri, sindirim çözeltisi içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (serumsuz ortam, 2 mg/mL Dispase II ve 2 mg/mL Collagenase A takviyesi). (Ek Tablo 1).
      NOT: 4 LG için 1 mL sindirim çözeltisi gereklidir.
    2. LG dokusunu mikromakasla tüp içinde küçük parçalara (yaklaşık 0,5-1 mm³) ince parçalayın.
    3. Mikrosantrifüj tüpünü %5CO2 ile 37 °C'de 2,5-3 saat kuluçka yapın. Her 30-60 dakikada bir, dokuyu sindirim çözeltisine nazikçe karıştırarak kapsamlı enzimatik sindirim sağlanır.
  4. LGEC'lerin izolasyonu ve hasadı
    1. Sindirim süresi tamamlandıktan sonra mikrosantrifüj borusunu birkaç kez sallayın. Sindirim çözeltisini birkaç kez pipetleyerek dokuyu tek hücrelere veya küçük hücre kümelerine ayırın. Sindirim ilerlemesini doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin.
      NOT: Sindirim çözeltisinde görünür parçacık kalmadığında ve mikroskop altında çok sayıda tek hücre ile kanal benzeri hücre agregaları gözlemlendiğinde, sindirim süreci durdurulur.
    2. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g ile santrifüj yapın, ardından sindirim ortamını atın.
    3. Hücre pelletini 1 mL steril DPBS ile tekrar askıya alın ve kalan sindirim enzimlerini çıkarmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1000 x g ile tekrar santrifüj yapın.
    4. 1.4.3 adımını tekrarlayın, süpernatantı çıkarın ve hücre pelletini 500 μL serumsuz ortamda yeniden süspansiyona bırakın.
  5. LGEC'lerin tohumlanması ve birincil kültürü
    1. LGECs kültür ortamını, serumsuz ortamı %1 penisillin-streptomisin ve 2C (10 μM Y27632 ve 10 μM SB431542) takviye ederek hazırlayın. (Ek Tablo 1)
    2. Hücreleri, serumsuz 2C ortamı kullanılarak 7,5 x 10³ hücre/cm² yoğunlukta standart, işlememiş 24 delikli kültür plakalarına tohumlayın.
    3. Tohumlamadan sonra, hücre dağılımı eşit şekilde sağlanmak için kültür plakasının kenarlarına hafifçe dokunun. Plakayı %5CO2 içeren 37 °C'lik kuluçka makinesine yerleştirin.
    4. Tohumlamadan 72 saat sonra ilk kez kültür ortamını değiştirin. Sonrasında her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
      NOT: İlk 72 saat boyunca kültürü rahatsız etmekten kaçının. İlk ortam değişiminde hücreleri DPBS ile yıkamayın. Eski ortamı çıkarıp taze orta madde ekleyin.

2. LGEC'lerin alt kültürleşmesi

NOT: Hücre birleşimi %80-90'a ulaştığında alt kültür, bu genellikle birincil kültürden yaklaşık 14 gün sonra gerçekleşir.

  1. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri steril DPBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
  2. 250 μL %0,25 Tripsin-EDTA ekleyin ve %5CO2 ile 37 °C'de 10-15 dakika boyunca kuluçka yapın. Sıkı bağlantılar ayrıldıktan ve hücreler yukarı yuvarlandığında, sindirimi sonlandırmak için eşit miktarda tanımlanmış Tripsin İnhibitörü Çözeltisi ekleyin.
    NOT: Primer kültür sırasında düz ve büyük yapışkan hücreler gözlemlenirse, kültürü %0,25 Tripsin-EDTA ile 5 dakika boyunca tedavi ederek bu heterojen hücreleri çıkarabilirsiniz. Daha sonra, kültürü %0,25 Tripsin-EDTA ile tekrar 5 dakika daha işleyin ve daha saf bir LGEC popülasyonu elde etmek için daha fazla 5 dakika kullanın.
  3. Hücre süspansiyonunu pipetle 1 mL pipetle karıştırın, ardından 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 1000 x g ile santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
  4. Hücreleri steril DPBS ile yıkayın ve LGEC'leri toplamak için tekrar santrifüj yapın.
  5. LGEC'leri 2C kültür ortamında tekrar askıya alın ve alt kültür için 1:2 oranında tohumlayın. Kültür plakasını sallayarak hücreleri nazikçe karıştırın ve %5CO2 ile 37 °C'de kuluçka yapın.
    NOT: 1:2 oranında alt kültürleme, hücre birleşimi %80-90'a ulaştığında LGEC'lerin bir kuyu plakasından sindirilip iki yeni kuyu plakasına eşit şekilde dağıtılması anlamına gelir.
  6. Tohumlamadan sonra 3. gün ortamı değiştirin, ardından hücre durumuna göre her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
  7. Hücre morfolojisini her gün ters faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve fotoğraflarla belgeleyin.

3. LGEC'lerin üç boyutlu (3D) kültürü

NOT: 3D kültür deneyi P1 LGEC'ler kullanıyor. P1 LGEC'ler 7 gün kültür sonrası %80-90 birleşime ulaştığında, 3D kültür için kullanılırlar.

  1. Hazırlık adımları
    1. Matriks jelini (Ek Tablo 1) -20 °C dondurucudan 4 °C'lik bir buzdolabına aktarın ve gece boyunca eritin.
    2. Gerekli pipet uçlarını -20 °C dondurucuya yerleştirerek doğru ön soğutmayı garanti edin.
    3. 24 delikli kültür plakasını 37 °C, %5CO2 kuluçka makinesine yerleştirerek 2 saat önceden ısıtarak 3D kültüre başlamadan önce.
    4. Bir buz kutusu hazırlayın ve içine önceden soğutma için birkaç 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Buz kutusunu kullanmadan önce bir biyogüvenlik dolabında sterilize edin.
  2. LGEC'lerin 3D kültürü
    1. 2.1 ile 2.4 adımlarında açıklandığı gibi P1 LGEC'leri alın.
    2. Hücre pelletini 2C kültür ortamında yeniden süzülür ve hücre yoğunluğunu 10 μL başına 1 × 10⁴ hücreye ayarlayın.
    3. 4 °C buzdolabından erimiş matris jelini ve -20 °C dondurucudan önceden soğutulan pipet uçlarını alıp biyogüvenlik dolabının içindeki buz kutusuna koyun.
    4. Önceden ısıtılmış 24 kuyu kültür plakasını kuluçka makinesinden çıkarın ve biyogüvenlik dolabına yerleştirin.
    5. Uygun bir hücre süspansiyon hacmı, matris jeliyle 1:1 oranında karıştırın; önceden soğutulmuş pipet uçları kullanılarak. Dengeli dağılımı sağlamak için nazikçe karıştırın.
    6. 3.2.5. adımdan 20 μL karışımı önceden ısıtılmış 24 kuyu plakanın her kuyuğunun ortasına dikkatlice pipetleyin.
    7. Plakayı ters çevirin ve 37 °C, %5CO2 inkübatörde 30 dakika kuluçka yapın, böylece matris jeli katılaşsın.
    8. Matris jeli katılaştıktan sonra, her kuyuya 600 μL 2C kültür ortamı ekleyin.
    9. Kültür plakasını 37 °C, %5CO2 inkübatörde 14 gün boyunca kuluçka yapın. Tohumlamadan sonraki 3. gün ve hücre durumuna göre her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
    10. Her gün ters faz kontrast mikroskobu altında 3D küre oluşumunu gözlemleyin ve belgeleme için görüntüler yakalayın.
  3. 3D LGEC sferoidlerinin farklılaşması
    1. Kültür 3D LGEC sferoidleri adımda 3.2'de açıklandığı gibi.
    2. 7 gün kültür yaptıktan sonra, 2C kültür ortamını çıkarın ve hücreleri kalan 2C temizlemek için DPBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Matris jelini rahatsız etmemeye dikkat edin.
    3. 2C (Null) içermeyen serumsuz ortam ekleyin ve farklılaşmayı sağlamak için kültüre ek 7 gün devam edin.
    4. Kültür dönemi boyunca her 2-3 günde bir ortamı değiştirin.
    5. İndüklenen 3D sferoidlerin morfolojik değişimlerini tersleşmiş faz kontrast mikroskobu altında günlük olarak gözlemleyin ve belgeleme için görüntüler alın.

4. Farklılaşmış 3B LGEC sferoidlerinin gömülüp dondurulması

NOT: 3D sferoidlerin farklılaşması, bölüm 3.3'te açıklandığı gibi indüklenir. 7 günlük farklılaşmadan sonra, aşağıdaki adımları takip edin; ayırt edilmiş 3D sferoidlerin optimal kesme sıcaklığı (OCT) gömülüyoru ve donmuş kesitleri için yapılır.

  1. Kuyunun kenarları boyunca kültür ortamını aspire edin. Farklılaşmış sferoidleri steril DPBS ile üç kez nazikçe yıkayın.
  2. 1 ml %4 paraformaldehit (PFA) kuyuya biyogüvenlik dolabında veya duman davlumbazında ekleyip sferoidleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
  3. Sferoidleri steril DPBS ile üç kez nazikçe yıkarın, her yıkama 10 dakika sürer, böylece fiksator çıkarılır.
  4. 3D sferoid-matriks jel kubbe benzeri yapıyı dikkatlice kazımak için spatula kullanın ve %20 sukroz çözeltisi içeren 5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Tüpü gece boyunca 4 °C'de kuluçka altına alın, kubbe yapısı tüpün altına yerleşene kadar.
  6. Kubbe yapısını sukroz çözeltisinden çıkarın, kalıntı sakrozu dikkatlice çıkarın ve OCT bileşiğine gömülün. Sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.
  7. Boyamadan önce, dondurucu mikrotom kullanarak 10 μm kalınlığında bölümler hazırlayın.

5. Farklılaşmış 3D LGEC sferoidlerinin salgı fonksiyonu tespiti

  1. Örnek koleksiyonu
    1. 3.3. bölümde tanımlandığı şekilde 3B sferoidlerin farklılaşmasını tetikle.
    2. 7 gün türden çıkardıktan sonra, kültür ortamını çıkarın ve 3D küreleri DPBS ile üç kez yıkayın.
    3. 500 μL serumsuz ortam 2C olmadan ekleyin ve %5CO2 ile 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
    4. Kültür ortamını toplayıp 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak pilokarpin uyarısından önce laktoferrin (LTF) konsantrasyonunu ölçmek için temel örnek olarak alın.
    5. 3D sferoidleri steril DPBS ile nazikçe üç kez yıkayın.
    6. 500 μL serumsuz ortam eklenince 1 μg/mL pilokarpin içerir ve 3D sferoidleri %5CO2 ile 37 °C'de 24 saat kuluçka edin.
    7. İnkubasyondan sonra, kültür ortamı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne toplanır (pilokarpin uyarısı sonrası LTF konsantrasyonu ölçümü için).
    8. Toplanan kültür ortamı örneklerini 4 °C'de, 1000 × g sıcaklıkta 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı topla ve ileride kullanmak üzere -80 °C'de sakla.
  2. Örnek seyreltme
    1. Numuneleri -80 °C dondurucudan alın ve oda sıcaklığında tamamen çözülmelerine izin verin.
    2. Örnekten 5 μL alın ve enzimle bağlantılı immünosor testi (ELISA) setinden 495 μL numune seyreltme tamponu ile seyreltilerek 100 kat seyreltme hazırlanır.
  3. Reaktif hazırlama
    1. ELISA kitinin tüm reaktiflerini kullanmadan 20 dakika önce oda sıcaklığına getirin.
    2. Yıkama tamponunu hazırlayın: Örnek sayısına göre gerekli miktarı hesaplayın ve konsantre yıkama tamponunu damıtılmış suyla seyreldin (1:24).
    3. Standart çalışma çözümünü hazırlayın:
      1. Liyofilize standardı 10.000 × g 1 dakika boyunca santrifüjlendirin. 1 mL Referans Standardı ve Numune Sulaştırıcı ekleyin, 10 dakika bekletin ve birkaç kez nazikçe çevirin.
      2. Tamamen çözüldükten sonra pipetle iyice karıştırın. Bu yeniden yapılandırma, 2000 pg/mL çalışma bir çözelti üretir.
    4. Standart konsantrasyon gradyanı için kit talimatlarına göre seri seyreltmeler yapın: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 0 pg/mL.
    5. Biotinylated tespit antikor çalışma çözümünü hazırlayın:
      1. Test için gerekli hacmi hesaplayın (50 μL/kuyruk). Konsantre biyotinillenmiş tespit antikorunu 800 × g ile 1 dakika boyunca santrifüjlen, ardından 50× yoğunlaştırılmış biyotinillenmiş tespit antikoru biyotinillenmiş antikor sulandırıcı kullanılarak 1× çalışma çözeltisine seyreltirin.
      2. Çözeltiyi kullanımdan hemen önce hazırlayın, hesaplanan miktardan biraz fazla üretin, genellikle gerekenden 100-200 μL daha fazla ekleyin.
    6. Adar turpu peroksidaz (HRP) konjugat çalışma çözeltisi hazırlanın:
      1. Deney için gerekli hacmi hesaplayın (50 μL/kuyruk). Konsantre HRP konjugasyonunu 800 × g ile 1 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından HRP konjuj sulandırıcı ile 1x çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
      2. Çözeltiyi kullanımdan hemen önce hazırlayın, hesaplanan miktardan biraz fazla üretin, genellikle gerekenden 100-200 μL daha fazla ekleyin.
  4. ELISA testi prosedürü
    1. Sulandırılmış standart, blank ve örnekler için kuyular belirlenir, her biri için 3 kopya bulunur. Standart çalışma çözeltisi, boş veya seyreltilmiş numune çözeltisi 25 μL ilgili kuyruklara ekleyin. Plakayı kitte verilen mühürleyiciyle kaplayın ve 37 °C'de 90 dakika kuluçka yapın.
      NOT: Mikro ELISA plaka yuvasının altına çözeltiler eklenmelidir. İç duvara dokunmaktan ve mümkün olduğunca köpüklenmeye neden olmaktan kaçının.
    2. Yıkamadan sıvıyı kuyulardan boşaltın. Her kuyuya hemen 50 μL biyotinillenmiş tespit antikor çalışan çözeltisi ekleyin. Plakayı yeni bir sızdırmazlık ile kaplayın ve 37 °C'de 60 dakika kuluçka yapın.
    3. Kuyulardan sıvıyı boşaltın ve her kuyuya 350 μL hazırlanmış yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika bekletin, ardından her kuyidan sıvıyı aspire edin veya boşaltın ve temiz, emici kağıtla kurutulun. Bu yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Yıkama sürecinde kuyuların kurumasına izin vermeyin.
    4. Her kuyuya hazırlanmış HRP konjugat çalışma çözeltisinden 50 μL ekleyin. Plakayı yeni bir sızdırmazlıkla kapatın ve 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
    5. Kuyulardan sıvıyı boşaltın ve yıkama işlemini 5.4.3'te tanımlandığı gibi yıkama tamponu ile beş kez tekrarlayın.
    6. Her kuyuya 50 μL substrat reaktifi ekleyin. Plakayı yeni bir sızdırmazlayıcı ile kapatın ve 37 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
    7. Her kuyuya 25 μL stop çözeltisi ekleyerek reaksiyonu sonlandırır. Stop çözeltin, substrat çözeltisiyle aynı sırayla eklendiğinden emin olun.
    8. Her kuyunun optik yoğunluğunu (OD değerini) hemen 450 nm ile mikroplaka okuyucu kullanarak belirleyin.

6. RNA izolasyonu

  1. Örnek koleksiyonu
    1. LG dokusu için
      1. Yetişkin farelerden ekstraorbital LG dokusunu 1.1.2-1.1.2 bölümlerinde tanımlandığı gibi izole edin.
      2. Taze izole edilmiş LG dokusunu PBS'ye daldırarak kanı yıkayabilirsiniz.
      3. LG'nin yüzey nemini filtre kağıdıyla lekeleyip dokuyu 1 mL RNA Ekstraksiyon Reaktifi içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Ek Tablo 1), böylece tüp buz üzerinde tutulur.
        NOT: RNA çıkarımından önce öğütme adımlarını uygulayarak dokunun tam olarak parçalanmasını sağlayın.
      4. Mikrosantrifüj tüpüne iki temiz çelik öğütme boncukları ekleyin, ardından tüpü önceden soğutulan, yüksek hızlı düşük sıcaklık öğütücüye yerleştirin.
      5. Öğütücünün parametrelerini ayarlayın: frekans 70 Hz, öğütme süresi 45 s, duraklama süresi 15 saniye ve 10 döngü tekrarlayın. Öğütücünün kapağı kolunu sıkın ve öğütmeye başlayın.
      6. Tüpü buzun üzerine koyun veya öğütme işlemi tamamlandıktan sonra RNA ekstraksiyonu için -80 °C'de sakla.
    2. LGEC'ler için
      1. Kültür ortamını çıkarın ve LGEC'ler %80-90 birleşime ulaştığında hücreleri steril DPBS ile üç kez yıkayın.
      2. Her kuyuya 600 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin (24 kuyu bir plaka için) ve oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçka yapın.
      3. Her kuyida RNA ekstraksiyon reaktifi çözeltisini defalarca pipetlemek için 1 mL pipet kullanın, böylece tam hücre lizisi sağlanır.
      4. Çözeltiyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      5. Tüpü buzun üzerine koyun veya -80 °C'de tutarak sonraki RNA çıkarımı için.
    3. 3D LGEC sferoidleri için
      1. 3.2-3.3. adımlarda açıklandığı gibi 14 gün boyunca kültürlenerek farklılaşmamış ve farklılaşmış 3D LGEC sferoidleri toplayın. Her kuyuya 1 mL sindirim çözeltisi (serumsuz ortam, içinde 1 mg/mL Dispase II içerir) ekleyin; böylece 3D sferoid-matriks jel kubbe benzeri yapının tamamen kaplı olduğundan emin olun. 37 °C'de %5CO2 ile 30 dakika kuluçka yapın.
      2. 3D sferoidleri içeren sindirim çözeltisini, 1 mL pipet kullanarak 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1000 × g seviyesinde 3 dakika boyunca santrifüj yapın, böylece küre peleti toplan.
      3. Pelleti 1 mL DPBS ile yıkayın ve 1000 × g sıcaklığında 3 dakika santrifüj yapın, böylece tekrar toplayın.
      4. 600 μL RNA ekstraksiyon reaktifi (20 μL matris jel başına) ekleyin ve oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçka yapın.
      5. 3D sferoidlerin tam olarak parçalanmasını sağlamak için 1 mL pipet ile iyice karıştırın.
      6. Tüpü buzun üzerine koyun veya -80 °C'de tutarak sonraki RNA çıkarımı için.
  2. RNA çıkarımı
    NOT: Uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven, maske) giyin ve kloroform ile izopropanol içeren tüm işlemleri duman davlumanında gerçekleştirin. Kimyasal atık akışlarını, kurumsal atık bertaraf protokollerine uygun olarak tehlikeli atık üretimi için etiketlenmiş tehlikeli atık konteynerlerine bertaraf etmelidir.
    1. RNA Ekstraksiyon Reaktifi'ndeki RNA örneğini içeren santrifüj tüpüne kloroform (1/5 hacim RNA ekstraksiyon reaktifi) ekleyin (adım 6.1'den).
      NOT: İşlemi bir duman davlumanında gerçekleştirin.
    2. Bir girdap kullanarak iyice karıştırın ve faz ayrılana kadar oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
    3. 14.000 x g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra sıvı üç katmana ayrılır ve RNA en üst şeffaf sulu fazda olur.
    4. Yeni 1,5 mL RNaz-serbest bir santrifüj tüpü hazırlayın ve buharlı bir kaplığa izopropanol (RNA ekstraksiyon reaktifinin 1/2 hacmi) ekleyin.
    5. En üst şeffaf sulu fazı (RNA ekstraksiyon reaktifinin 1/2 hacmini) dikkatlice yeni RNazsız tüpe pipetleyin.
      NOT: Pipet yaparken orta katmanı kirletmemeye dikkat edin.
    6. Tüpü birkaç kez ters çevirip oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karıştırıp kuluçka yapın. Sonra tekrar 14.000 x g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı atın ve tüpü ters çevirerek pelleti yıkamak için 500 μL %75 etanol ekleyin. Tekrar 14.000 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
    8. 6.2.7 adımını tekrarlayın. Süpernatantı atın ve kalan sıvıyı çıkarmak için hızlı bir santrifüj yapın.
    9. Tüpü buz üzerinde, duman davlumbonunda koyun, kapağı açın ve beyaz pelet yarı şeffaf olana kadar 10-20 dakika hava kurumasına izin verin.
    10. Pelleti çözmek için 20 μL RNase içermeyen su ekleyin. RNA konsantrasyonunu ve saflığını spektrofotometre kullanarak ölçün.
      NOT: Eğer RNA konsantrasyonu çok yüksekse, uygun miktarda RNase içermeyen su ile seyreltebilirsiniz.
    11. RNA çözeltisini buz üzerine koyabilir veya -80 °C'de depolayın, böylece sonraki ters transkripsiyon işlemi yapılır.

7. Nicel RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Ters transkripsiyon
    1. Üreticinin talimatlarına göre PCR reaksiyon tüpüne sıralı olarak şu bileşenleri ekleyin: 800 ng toplam RNA (konsantrasyonuna göre hacmi hesaplayın), q-PCR için 4 μL 5x All-in-One SuperMix, 1 μL gDNA çıkarıcı ve RNase içermeyen su ile toplam hacmi 20 μL'ye çıkarın.
    2. Bileşenleri nazikçe karıştırın. PCR makinesini şu koşullara ayarlayın: 6 dakika 55 °C, 1 dakika 80 °C ve ardından süresiz olarak 12 °C.
    3. Ters transkripsiyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra cDNA'yı -20 °C'de saklayabilir veya qRT-PCR işlemi için buzda kalın.
  2. qRT-PCR
    1. Farklı genleri hedeflemek için qRT-PCR ön karışım çözeltisi şu şekilde hazırlanır: 5 μL 2x Green qPCR SuperMix, 0.2 μL Forward Primer (10 μM), 0.2 μL Reverse Primer (10 μM) ve 3.6 μL nukleazsız su. Nazik karıştırın ve buz üzerine koyun.
    2. Deneysel tasarıma göre qRT-PCR tüplerine 9 μL qRT-PCR ön karışımı (7.2.1'de hazırlanmış) ve 1 μL cDNA (7.1. adımda hazırlanmış) eklenin.
    3. Tüpleri oda sıcaklığında 1000 × g sıcaklıkta 2 dakika santrifüjlen.
    4. Tüpleri tespit için floresans nicel PCR makinesine yerleştirin.
      NOT: Reaktif üreticisinin talimatlarına göre aşağıdaki programla üç aşamalı bir yöntem kullanın: 30 saniye için 94 °C, 5 saniye için 94 °C, 15 saniye için 60 °C ve 10 saniye için 72 °C. 2. adımdan 40-45 döngü sürmeye başlayın.
    5. Karşılaştırmalı BT yöntemiyle (2-ΔΔCt) nicel analiz yapın.
      NOT: Her veri seti sonuçların güvenilirliğini sağlamak için en az üç bağımsız kez tekrarlanmalıdır.

8. İmmünofluoresans boyama

NOT: İmmünoflüoresans boyama, %70-80 birleşme oranlarına sahip 24 delikli plakalarda kültürlenmiş LGEC'ler üzerinde veya farklılaşmış LGEC 3D yapılarının donmuş kesitlerinde yapılır.

  1. LGEC'ler için
    1. Kuyulardan kültür ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
    2. Her kuyuya biyogüvenlik dolabı veya duman davlumbazında 500 μL %4 PFA ekleyin ve hücreleri sabitlemek için oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın.
    3. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama 5 dakika sürer.
    4. Hücreleri kaplamak için %0,2 Triton X-100 500 μL ekleyin ve hücre zarını geçirimlileştirmek için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.
    5. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, her yıkama 10 dakika sürer.
    6. PBS'yi çıkarın ve 24 kuyruklu plakanın her kuyusunun etrafına bir daire çizmek için bir immünohistokimya işaretçisi kullanın. Her kuyuya 50 μL %2 BSA ekleyin, böylece hücreler kaplanır. Bloklama için oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
    7. BSA'yı çıkarın ve LGEC'leri kapatmak için seyreltilmiş birincil antikordan 50 μL ekleyin (Ek Tablo 1). 4 °C'de 16-18 saat kuluçka yapın.
    8. Birincil antikoru çıkarın ve 8.1.5 adımını tekrarlayın.
    9. LGEC'leri kapatmak için her kuyuya 50 μL floresan ikincil antikor ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçka yapın.
    10. 8.1.5 numaralı adımı tekrarlayın, ışığa maruz kalmaktan kaçının.
    11. LGEC'leri kapatmak için 50 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi ekleyin ve boyama sürecini floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
  2. 3D LGEC sferoidleri için
    1. 3D LGEC küre donmuş kesitlerini 4. adımda tarif edildiği gibi hazırlayın. 8.1.2-8.1.11 adımlarında belirtildiği gibi immünofluoresans boyama işlemi yapılsın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

2C kullanarak serumsuz bir LGEC kültür sistemi kurmak
Bu protokolde amaç, birincil fare LGEC'lerini genişletmek için daha basit ve daha verimli bir kültür sistemi kurmaktı. Kapsamlı taramadan sonra, yalnızca Y27632 ve SB431542'den oluşan serumsuz bir 2C kombinasyonu başarıyla geliştirildi ve LGEC'lerin uzun vadeli in vitro gengenmesini mümkün kıldı. Karışık enzim sindiriminden sonra, birincil LGEC'ler 3 gün boyunca 2C ile kültür sonrası tutunmaya ve çoklu hüc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Girişte açıklandığı gibi, son yıllarda LG hücreleri için birkaç serumsuz kültür sistemigeliştirilmiştir 10,11,12,13. Ancak, bu yöntemlerin çoğunun sınırlamaları vardır; bunlar arasında hücre çoğalmasının zayıflığı ve in vitro10,11 büyük ölçekli genleşme sağlanamaması da vardır. Ayrıca, LG kök h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82471048, 82271045) tarafından desteklendi; Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı (JCYJ20240813145510014); Jilin Eyaleti Sağlık Araştırma Yetenekleri Özel Projesi (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); ve Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Kalkınma Planı Projesi (YDZJ202601ZYTS389).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
 -20&derece; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabıHaier
 -80&derece; C Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabıHaier
%0,25 Tripsin-EDTAGibco25200056
1.5 mL mikro santrifüj tüpü KirgenKG2211Rnase-free
35mm hücre kültürü çanakıLABSELECT12111
4 derece ve derece; C BuzdolabıHaier
%4 paraformaldehit (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Yeasen708939ES03-20 derece ve derecede depolayın; C, stok 1 mg/mL, 500x, 1x PBS ile 1x'e seyreltin
5 mL santrifüj tüpü ACMECAC17457
50mL santrifüj tüpü LABSELECTCT-002-50-SS
Anti-alfa yatış kaslı aktin tavşan antikoruAbcamAB5694Antikor seyreltme tamponu ile 1:100 ve nbsp aralığında seyreltirin;
Anti-AQP5 tavşan antikoru  ABklonalA9927Antikor seyreltme tamponu ile 1:100 ve nbsp aralığında seyreltirin;
Anti-Sitokeratin 14 tavşan antikoruAbcamAB181595Antikor seyreltme tamponu ile 1:200  ile seyreltirin;
Anti-Sitokeratin 19  tavşan antikoruAbcamAB52625Antikor seyreltme tamponu ile 1:400 
Anti-Ki67 tavşan antikoruAbcamAB16667Antikor seyreltme tamponu ile 1:200  ile seyreltirin;
Biyogüvenlik kabiniSterilGARD
Sığır serumu albümini (BSA) Yeasen36101ES604° derecesinde depo edin; C
C57BL/6J fareleriXiamen Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Merkezi
Hücre kültür plakasıLABSELECT1131224-well
Hücre kuluçka makinesiEppendorf
SantrifüjEppendorf
KloroformHUSHI10006818DİKMAT, Duman kapsülünde operasyon yapıyor
CO2  Sabit sıcaklık kuluçka makinesiEppendorf
Kollagenaz ARoche10103586001-20 derece ve derecede depolayın; C, stok 200 mg/mL, 100x
Tanımlanmış tripsin inhibitörü çözeltisi (DTI)GibcoR007100
DermaLife K Keratinocyte Medium Complete Kit (Serumsuz ortam) Yaşam HattıLL-0007Saat 4 ve derecede depolayın; C
D-HanksBiosharpBL559A Dispase II'nin seyreltilmesi için kullanılıyor
Dimetilsülfoksit (DMSO)SigmaD4540Y27632 ve SB431542 seyreltmek için kullanılır
Dispase IISigmaD4693-20 derece ve derecede depolayın; C, stok 200 mg/mL, 100x
DMEM temel (1X)GibcoC11995500BT
Eşek Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA-212061:300'de antikor seyreltme tamponu ile seyreldin
Dulbecco'nun Fosfatla tamponlanmış tuzlu Sözü (DPBS)ServicebioG4200
Etanol mutlakHUSHI10009218DİKKAT, Diğer Etanol seyrelticilerini hazırlamak için kullanın ve nbsp;
Mikrotomu dondurmakLeica
Yüksek hızlı düşük sıcaklık öğütücüsüServicebio
Ters floresans mikroskobuLeica
Ters mikroskopOlympus
İzopropanol HUSHI80109270
Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop FV3000OLYMPUS
Düşük sıcaklıklı yüksek hızlı santrifüjEppendorf
LTF enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kiti ElabscienceE-MSEL-M0047-20 derece ve derecede depolayın; C
Matris jeli (Matrigel)82703MogengelAliquot ve -20 derece derecede depolayın; C
MikropipettörEppendorf
Microplate okuyucuThermo Fisher Scientific
Nükleazsız suBiosharpBL510B
OCT bileşiğiScigen4586
PBS,1× (pH7.4)ServicebioG4202
PCR amplifikatörüBIO-RAD
Penisillin-StreptomisinBiosharpBL505A
Penisillin-Streptomisin-AmfoterisinBiosharpBL142A
PerfectStart Green qPCR SuperMix kitiTransGen BiotechAQ601-01-V2-20 derece ve derecede depolayın; C
PerfectStart Uni RT& qPCR KitiTransGen BiotechAUQ-01-20 derece ve derecede depolayın; C
Pilokarpine AladdinP424663-20 derece ve derecede depolayın; C, 2500x
Primer AQP5  sequence:
İleri:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Tersine:CTTCTGCTCCCAT
CC		Sangon Biyoteknoloji
Primer K14  sequence:
İleri:CCCACCTTCATCTTCC
CAATT
Tersi: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biyoteknoloji
Primer K15  sequence:
Forward:GAGGTGGCGTCTAACA
GA
Reverse:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biyoteknoloji
Primer K19  sequence:
Forward:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Reverse:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biyoteknoloji
Primer K5  sequence:
İleri:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Tersine:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biyoteknoloji
Primer Ki67  sequence:
İleri:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Tersine:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biyoteknoloji
Primer LTF  sequence:
İleriye:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Tersine:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biyoteknoloji
Astar P63  sequence:
İleri:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Tersine: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biyoteknoloji
Primer SOX10  sequence:
Forward:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Reverse:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biyoteknoloji
Primer α-SMA  sequence:
İleri:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Tersine:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biyoteknoloji
Gerçek Zamanlı floresans nicel PCR cihazıRoche
RNA izolatörü Toplam RNA Ekstraksiyon ReaktifiVazymeR401-01DİKMAT, Duman kapsülünde operasyon yapıyor
SB431542 ApexbioA8249-20 derece ve derecede depolayın; C, 20 mM'de dipçik, 2000x
Spektrofotometre NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificRNA konsantrasyonunu ölçmek
SucroseMacklinS818046Distile su ile çözün
Triton X-100SolarbioT8200
Ultra saf su arıtma sistemiMillipore
Evrensel antikor seyreltme tamponuEpizymePS119Saat 4 ve derecede depolayın; C
Y27632 ApexbioB1293-20 derece ve derecede depolayın; C, 20 mM'de dipçik, 2000x

Kaynaklar

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Lakrimal Bez H creleriSerumsuz K lt r2B H cre K lt r3B H cre K lt rK k Molek l K lt rEpitel H cre Geni letmeSferoid Olu umuK k H cre Belirte leriDoku M hendisli i
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.