Schmidtea Akdeniz'de Candida albicans enfeksiyonu için Mantar Patogenezi ve Konak Savunmasını Araştırmak İçin Optimize Edilmiş Bir Protokol

Özet

Bu protokol, mantar enfeksiyonu sırasında konak-patojen etkileşimlerini incelemek için planarial Schmidtea akdeniz deniz sistemini model sistem olarak kullanmak için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir rehber sunar. Yöntem, insan mantar patojeni Candida albicans ile planarian hayvanları enfekte etme prosedürünün üzerine inşa edilerek, tekrarlanabilirliği ve deneysel tutarlılığı artırmak için ayrıntılı rehberlik sağlar.

Özet

Candida albicans, çoğu insanı semptomatik olarak kolonileştiren yaygın bir fırsatçı mantar patojenidir. Genellikle iyi huylu bir kommensal olmasına rağmen, antibiyotik kullanımı, bağışıklık fonksiyonu veya epitel bariyer bozulması nedeniyle oluşan disbiyoz, yüzeysel mukoza hastalığından hayati tehlike oluşturan sistemik kandidiaza kadar mantar aşırı büyümesi ve enfeksiyonu tetikleyebilir. C. albicans patogenezini in vivo farklı enfeksiyon aşamalarında ve farklı ölçülebilir konak sonuçlarıyla disseksiye etmek için yeni preklinik enfeksiyon modelleri gereklidir. Planari Schmidtea mediterranea , daha önce C. albicans enfeksiyonu sırasında konak-patojenler etkileşimlerini incelemek için omurgasız bir konak olarak kurulmuştur. S. mediterranea tamamen bakteriler ve mantarlar dahil patojenik mikroorganizmalarla enfeksiyonu aşabilen korunmuş doğuştan bağışıklık mekanizmalarına dayanır. Planaryaların olağanüstü yenilenebilir kapasitesi ve erişilebilir kök hücre popülasyonları, bu organizmayı erken bağışıklık yanıtlarını, doku onarımını ve patojen temizlenmesini in vivo analiz etmek için uygulanabilir bir model haline getirir. Bu model, mantar virülansının eşzamanlı analizini ve konak transkripsiyon yanıtlarını destekleyerek enfeksiyon dinamikleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, S. mediterranea'yı C. albicans ile enfekte etmek için ayrıntılı değişiklikler, standart prosedürler ve optimize edilmiş adımlarla güncellenmiş bir protokol sunulmuştur; bu protokol, tekrarlanabilirliği artırmak ve mantar patogenezi ile konak savunmasının sistematik çalışmalarını mümkün kılmak için tasarlanmıştır.

Giriş

Candida albicans, insanların %50-70'ini semptomatik olarak kolonileştiren yaygın bir fırsatçı mantar^{patojenidir (1,2,3}). Genellikle, zararsız bir kommensal C. albicans, mikrobiyota dengesizliği, antibiyotik kullanımı, immünosupresion, epitel bariyerinin bozulması veya tıbbi cihazların varlığı gibi koşullarda aşırı büyüyebilir ve yüzeysel mukozal enfeksiyonlardan hayati tehlike oluşturan sistemik kandidiyaza kadar çeşitli hastalıklara yol^{açabilir 4,5}. HIV/AIDS olanlar, kemoterapi veya immünosupresif tedavi alanlar, kronik hastalığı olanlar veya yoğun bakım ünitelerinde olanlar dahil olmak üzere bağışıklık sistemi zayıf bireylerde ölüm oranları %70'i aşabilir ve bu da invaziv kandidiyazın önemli halk sağlığı yükünü ^{vurgular 6,7,8}. Dünya genelinde, istilacı mantar enfeksiyonları yılda 6,5 milyondan fazla insanı etkiler; yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde doğrudan sağlık hizmetleri maliyetleri Candida ile ilişkili enfeksiyonlar için yılda 8 milyar doları^{aşmaktadır 9,10}. Mevcut antifungal tedavilere rağmen, C. albicans enfeksiyonlarıyla ilişkili morbidite ve ölüm oranları onlarca yıldır büyük ölçüde değişmemiş kalmış, bu da mantar hastalıklarında konak-patojen etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasının acil bir gerekliliğini ortaya koymaktadır.

C. albicans, konakçı ortamlarda kolonizasyonu, kalıcılığı ve patogenezi destekleyen çeşitli virülans faktörleri repertuarını kullanır. Bunlar arasında konak dokularına yapışma, bağışıklık kaçınma, hücre duvarı yeniden şekillendirilmesi, hidrolitik enzimlerin salgılanması, morfolojik plastisite ve biyofilm^{oluşumu yer alır} 11,12,13,14,15,16. Bu özellikler toplamda, C. albicans'ın çeşitli konak nişlerine uyum sağlamasına, bağışıklık yanıtlarını modüle etmesine ve antifungal tedavilere^{direnç göstermesine olanak tanır (16,17,18,19,20,21}). Bu süreçlerin enfeksiyon sonuçlarını nasıl şekillendirdiğini – konak morbiditesi, ölüm oranı ve patojen temizlenmesi dahil – açıklamak, daha etkili önleyici ve tedavi stratejileri geliştirmek için gereklidir.

Bu konak-patojeni dinamiklerini araştırmak için, planarial Schmidtea mediterranea'yı konak^{olarak kullanan bir model sistemi oluşturduk} 22,23,24. Bu model, mantar enfeksiyonuna çoklu sistem konak yanıtını incelemek için çok yönlü bir platform olarak hizmet veriyor ve hayvanların C. albicans'a eşzamanlı maruziyetini sağlayan bir ıslatma tabanlı enfeksiyon yöntemini kullanıyor. Aşağıdaki bölüm, bu protokolü geliştiren, tekrarlanabilirliği artıran ve laboratuvarlar arasında tutarlı uygulamayı kolaylaştıran güncellenmiş adım adım prosedürleri sunmaktadır.

Planaryalar, olağanüstü rejeneratif kapasiteye sahip serbest yaşayan omurgasızlardır ve yaralanma veya enfeksiyon nedeniyle kaybedilen dokuları hızla yerine koyabilmektedir²⁵. Adaptif bir bağışıklık sistemi yoktur ve tamamen korunmuş doğuştan korumalara dayanırlar – desen tanıma reseptörleri, antimikrobiyal peptitler, mukus salgısı ve fagositik hücreler dahil – bakteriyel ve mantar patojenlerini^26,27,28,29 gün içinde temizlerler. Doğuştan gelen bağışıklık ökaryotlar arasında ilk savunma hattı olduğu ve memeli sistemleri dışında yeterince incelenmediği^{için planaristler} bu süreçleri hücresel ve moleküler çözünürlükle in vivo inceleme fırsatı sunar. Rejeneratif yetenekleri, yetişkin hücrelerin yaklaşık %30'unu oluşturan ve enfeksiyon sonrası iyileşmeye katkıda bulunan neoblastlar olarak bilinen yetişkin pluripotent kök hücreler^{tarafından yönlendirilir 23,30}. Bu özellikler, S. mediterranea'yı patojenlerin virülansını ve konak savunmasını genetik, hücresel, doku ve organizma ölçeklerinde disseksiye etmek için güçlü bir model haline getirir ve geleneksel memeli sistemleriyle incelenmesi genellikle zor olan soruları ele almamıza olanak tanır.

Ayrıca, planaryaların küçük boyutları (genellikle birkaç milimetre uzunluğunda), düşük maliyeti ve bakım^kolaylığı büyük ölçekli deneyleri desteklerken, omurgalı modellerinin doğasında bulunan finansal, etik ve düzenleyici kısıtlamalardan kaçınır. C. albicans gibi, S. mediterranea da genomik olarak yönetilebilir, tam dizilenmiş ve notlanmış genomla birlikte transkripsiyonel profilleme, yüksek çözünürlüklü immünohistokimya ve histoloji ile sağlam RNA girişimi (RNAi^{) dahil} olmak üzere gelişmiş moleküler ve hücresel teknikleri destekler. Bu araçlar, enfeksiyon sırasında konak ve patojen yanıtlarının paralel analizini mümkün kılar.

Mantar enfeksiyonlarını incelemek için birkaç alternatif preklinik model kullanılmıştır. Galleria mellonella (mum güvesi), Caenorhabditis elegans (yuvarlak solucan) ve Drosophila melanogaster (meyve sineği) gibi omurgasız konakçılar ile omurgalı Danio rerio (zebra balığı) her biri kendine özgü deneysel avantajlar sağlar ancak aynı zamanda belirgin sınırlamalara sahiptir. Bu sistemler genellikle hayatta kalmaya birincil son nokta olarak dayanır; çünkü enfeksiyonlar hızla konak ölümünü tetikler; bu da hastalık, iyileşme ve çoklu sistem yanıtlarının ayrıntılı değerlendirilmesini engeller – planari modelin kolayca yakaladığı özellikler.

Mus musculus (fare), Rattus norvegicus (sıçan), Oryctolagus cuniculus (tavşan) ve Cavia porcellus (kobay) gibi memeli modelleri insan fizyolojisini daha yakından yansıtır, ancak yüksek maliyetler, küçük grup büyüklükleri, etik ve düzenleyici gereksinimler ile doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını ayırt etme zorluğu nedeniyle sınırlıdır. Ayrıca, on yıllardır farelerde yapılan mantar patogenez araştırmaları, ağırlıklı olarak geç evre sistemik^{enfeksiyonlara odaklanmış (}39,40,41,41,42,43), genellikle epitel bariyer bozulması ve mukozal aşırı büyüme gibi erken olayları göz ardı etmiştir – insanlarda mantar hastalığının en yaygın başlangıcı ^yolları 44,45,46.

Bu nedenle, mantar virülansı, konak savunması ve hastalık ilerlemesini etkileyen biyolojik süreçleri anlamak için konak-patojen etkileşimlerini incelemek önemlidir. İstilacı mantar enfeksiyonları, artan küresel bir tehdidi temsil etmektedir; birçok tür artık tüm ana antifungal ilaç sınıflarına karşı direnç sergilemektedir. 1 milyardan fazla insanın mantar enfeksiyonlarından etkilendiği tahmin ediliyor ve iklim değişikliği, yaygın antimikrobiyal kullanım ve bağışıklık sistemi zayıf bireylerin artan sayısı gibi faktörler, antifungal dirençli patojenlerin ortaya çıkışını^{hızlandırıyor} 47,48,49,50. Patojenik mantarların konaklarıyla nasıl kolonileştirildiğini ve onlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamak, yeni önleyici ve tedavi stratejileri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Aşağıda, tekrarlanabilirliği teşvik etmek ve mantar patogenezi ile konak savunma mekanizmalarının sistematik olarak incelenmesini mümkün kılmak amacıyla S. mediterranea-C. albicans etkileşimleri için revizyon edilmiş ve standartlaştırılmış sistemik enfeksiyon protokolü açıklanmaktadır. Orijinal protokol, önceki^yayınlarda 22,23,24 olarak uygulanmıştır. Tablo 1, bu revize edilmiş versiyona dahil edilen ana güncellemeleri özetlemektedir; mantar aşılama prosedürlerindeki iyileştirmeler, azaltılmış kuyu hacmleri, tanımlanmış hayvan dahil etme kriterleri, enfeksiyon ve ölümcül dozların belirlenmesi ve güncellenmiş hayvancılık önerileri bulunmaktadır. Bu iş akışı, C. albicans'ın kültürlenmesi, planarianların sulandırılma yoluyla enfekte edilmesi ve semptomatik ve ölümcül doz koşullarında nitel ve nicel okumalarla mantar virülansı ile konak yanıtlarının değerlendirilmesi için ayrıntılı rehberlik sağlar (Şekil 1). Burada sunulan optimize edilmiş prosedürler, enfeksiyon dinamikleri ve konak sonuçlarının temel belirleyicileri olarak ampirik olarak tanımlanan değişkenleri içerir; böylece tekrarlanabilirliği artırır ve konakçı-patojen etkileşimlerinin sistematik olarak değerlendirilmesini mümkün kılar.

Protokol

Bu protokol, önceki^yöntemler 22,23,24 üzerine inşa eder ve tekrarlanabilirliği artırmak ve S. mediterranea'da mantar patogenezi ile konak yanıtlarının sistematik olarak incelenmesini mümkün kılmak için açık, standartlaştırılmış prosedürler oluşturur. Protokolün temel iyileştirmeleri arasında önceden belirlenmiş hayvan dahil etme ve dışlama kriterleri, standartlaştırılmış mikrobiyal hazırlık ve konak uç noktalarının kapsamlı değerlendirilmesi yer alır.

Tüm işlemler uygun steril ve aseptik biyogüvenlik seviye 2 teknikleriyle yapılmalıdır. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve kapalı burunlu ayakkabılar dahil olmak üzere standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipmanları (PPE) her zaman giyilmelidir. Planarial S. mediterranea ile ilgili işlemler, omurgasızların etik kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yürütüldü.

Tüm protokol iyileştirmeleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Tüm reaktifler, kritik ekipmanlar ve ortamlar, tamponlar ve immünboyama tarifleri Malzemeler Tablosu ve Tablo 2'de listelenmiştir.
NOT: Omurgasız hayvan modeli S. mediterranea ile ilgili tüm işlemler, hayvan refahının en yüksek standartlarını sağlamak için yapılmalıdır. Güney mediterranea , doğal habitatları simüle eden optimize edilmiş koşullarda barındırılmalıdır. Deneyler, çalışma boyunca etik tedaviyi sağlamak için potansiyel ağrı veya sıkıntıyı en aza indirecek şekilde tasarlanmalıdır.

1. Mantar kültürü

1. C. albicans suş bilgisi
   1. Standart C. albicans laboratuvar süzü SN250⁵¹ , tüm deneylerde vahşi tip suş olarak kullanıldı ve Fungal Genetics Stock Center'da (http://www.fgsc.net/) halka açık olarak mevcuttur. SN250, yayılmış^{kandidiyaz 52} hastanın kan kültüründen toplanan klinik izolat SC5314'ten türetilmiştir.
   2. C. albicans suşları %25 gliserol stokları olarak −80°C'de tutulur.
2. Enfeksiyon için C. albicans türlerinin kültürlenmesi
   1. Kriyojenik stoktan çizgi çizme
      1. Steril bir aplikatör kullanarak, istenen süzümü −80°C stoktan maya pepton ekstraktı (YPD) (%1 maya ekstraktı, %2 pepton, %2 glikoz; pH 6.8) agar plakalarına çizin.
      2. 30°C'de 72 saat statik olarak kuluçka yapın.
3. Gece kültürlerinin hazırlanması
   1. Tek bir koloniyi steril aplikatör çubuğu ile steril borosilikat cam kültür tüplerinde (18 mm × 150 mm) 4 mL sıvı YPD'ye aşılayın.
   2. Aynı koşullarda aşılanmamış YPD içeren negatif kontrol tüpü ekleyin.
   3. Tüpleri gevşekçe kapalı olarak havalandırmaya izin verin ve gece boyunca (16 saat) 30 °C'de 220 rpm'de (orbital) sallama ile sarsılan kuluçka içinde.
      NOT: Negatif kontrolde mikrobiyal büyüme gerçekleşirse, deneyi iptal edin ve yeni ortam ile steril teknikle yeniden başlayın.
4. Hasat ve yıkama hücreleri
   1. Aseptik teknikle, kültürler etiketlenmiş 15 mL santrifüj tüplerine aktarılır.
   2. Santrifüj kültürleri ~3.000 × g ile 5 dakika boyunca hücreleri pellet etmek için yapılır.
   3. YPD süpernatantını dikkatlice çıkarın, pelleti rahatsız etmeden.
   4. Pelleti planarial suya (bileşim için Tablo 2'ye bakınız) kullanılan YPD'nin hacmine eşit bir hacimde yeniden askıya alın.
   5. Vortex ile iyice karıştırın.
   6. Büyüme ortamını tamamen kaldırmak için 1.4.2-1.4.4 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
   7. Son yıkamadan sonra, hücre pelletini taze planari suya girdabla tekrar askıya alın.
5. C. albicans hücre konsantrasyonunun nicelendirilmesi
   1. OD ölçümü için seyreltme
      1. Üç steril 1,7 mL mikrosantrifüj tüpünü 1:20 seyreltme (50 μL kültür + 950 μL planar su) veya alternatif seçilmiş seyreltme faktörü ile hazırlayın. İyice karıştırın.
      2. 1000 μL planari su içeren boş bir tüp hazırlayın.
   2. Spektrofotometri
      1. Spektrofotometreyi optik yoğunluğu 600 nm (OD₆₀₀) olarak ölçecek şekilde ayarlayın.
      2. Spektrofotometreyi planarist suyla boşaltın.
      3. Her seyreltilmiş örnek için_{OD 600} ölçün ve değerleri kaydedin.
      4. Üç ölçümü ortalayın ve seyreltme faktörü ile çarparak stok kültürünün_{OD 600'ünü} belirleyin. OD_600'ü hücre konsantrasyonuna dönüştürün.
         NOT: Her spektrofotometre için optik yoğunluk dönüşüm faktörü ampirik olarak belirlenmelidir. Kullanılan özel enstrümantasyona göre, 1'in OD_600'ü yaklaşık 2 ×10⁷ C. albicans hücresi/mL^53'e karşılık gelir.
6. Deneysel inokulum konsantrasyonlarının belirlenmesi
   1. Her deneysel durum için istenen inokulum konsantrasyonunu hazırlayın.
      NOT: Planari koloni için etkin dozu belirlemek için, özellikle bulaşıcı veya ölümcül son noktalar için en az üç biyolojik kopyalama yapın. Enfeksîyon ve ölümcül aşı konsantrasyonlarının hazırlanması için temsil eden bir hesaplama, Ek Dosya 1'de sunulmaktadır.

2. Planari türler ve bakım

1. Planarian türler ve bakım
   1. Tüm deneyler için planarial S. mediterranea'nın CIW4 eşeysiz klonal hattını kullanın.
   2. Planari kolonileri, 1.500–2.000 mL 1× planari su içeren şeffaf gıda sınıfı plastik kaplarda muhafaza etmek.
   3. Kutuları 20 °C sıcaklıkta karanlıkta tutun ve gaz değişimi için kapakları gevşekçe kapalı tutun.
   4. Planari bakterileri antibiyotiklerle tedavi etmeyin.
2. Koloni bakımı ve beslenmesi
   1. Kolonilere haftada bir kez taze süzülmüş süzülmüş sığır karaciğeri püresi verin.
   2. Haftada iki kez kapları temizleyin.
   3. Planari yoğunluğunu konteyner başına 200–400 hayvan arasında koruyun. Önceki çalışmalar, koloni hazırlığı ve uzun vadeli bakım konusundaki ayrıntılı prosedürleri^{göstermektedir 31}.
3. Deney öncesi koşullandırma
   1. Deneysel enfeksiyondan önce, planariler metabolik ve boyut koşullarını standartlaştırmak için 7–12 gün aç bırakılır.
   2. Her deneysel durum için her kuyu başına 5–10 hayvan grupları kullanın. Pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere tüm koşullarda eşit sayıda hayvan olmasını sağlamak.
4. Hayvan boyutu seçimi
   1. Yaklaşık 5 mm uzunluğunda planaryaları seç, hayvan başına ~5 × 10⁵ konak^{hücresine karşılık gelir 54}.
   2. 5 mm'den küçük planaryalardan kaçının, çünkü bu büyüklükteki hayvanlarda blastemalı veya eksik gelişimi olan bireyler de olabilir ve bu tutarsız sonuçlar verebilir.
   3. 5 mm'den büyük planaryalardan kaçının, çünkü daha büyük hayvanlar floresans immünboyama için daha az uygundur.
   4. Enfeksîyon doz (_{ID 50}) ve ölümcül doz (LD₅₀) koşulları belirlenirken yaklaşık 5 mm uzunluğunda planariler kullanın.
      NOT: Tutarlı boyut seçimini kolaylaştırmak için, 5 mm × 5 mm referans ızgarası basın ve şeffaf planari kapın altındaki plastik bir klasör kılıfına yerleştirin. Uzunluk ölçmeden önce planaryaların tamamen açıldığından emin olun.
5. Sağlık ve dahil etme kriterleri
   1. KRITIK ADIM: Kullanmadan önce tüm planarileri stereomikroskop altında inceleyin.
   2. Görünür hasarı veya yaralanması olan hayvanları, aşağıdaki koşullar dahil olmak üzere hariç tutun:
      1. Blastemaların (pigmentasyon eksikliği olan doku) varlığı veya eksik pigmentasyon gelişimi.
      2. Anormal pigmentasyon, örneğin belirgin şekilde daha koyu bölgeler.
      3. Eksik veya hasarlı doku.
      4. Lezyonlar veya yara izleri.
      5. Açık yaralar.
      6. Morfolojik anormallikler veya deformasyonlar.
      7. Herhangi bir kronik veya iyileşmeyen durum.
   3. Gelişimsel anormallikleri olan hayvanları hariç tutun.
      1. Baş veya kuyruk bölgelerinin ikiye bölünmüş veya çoğaltılmış olması.
      2. Şekilsiz veya asimetrik vücut morfolojisi.
      3. Yanlış sayıda fotoreseptör (sadece bir çift kabul edilebilir).
      4. Anormal konumda boru.
      5. Kusurlu kirpik yapısı nedeniyle hareketliliğin bozulması veya düzensiz kayma davranışına yol açıyor.
   4. Yalnızca yaklaşık 5 mm uzunluğunda, tamamen gelişmiş ve görünür yaralanma veya anormallikten arınmış hayvanları dahil edin.
6. Tabak hazırlığı
   1. Tüm dahil etme kriterlerini karşılayan sağlıklı planaryaları doku kültürü olmayan 6 kuyu polistiren plakasında her kuyu başına 2 mL taze planari suya aktarın.
      NOT: Hayvanları enfeksiyondan bir gün önce transfer ederek yeni ortama ve popülasyon yoğunluğuna alışma sağlanır.
   2. Aşağıdaki deneysel koşullar için kuyular atayın:
      1. Negatif kontroller: enfekte olmamış veya sahte tedavi görülmüş hayvanlar.
      2. Pozitif kontroller: vahşi tip C. albicans ile enfekte olan hayvanlar.
   3. Tüm suyu çıkarın ve yerine 2 mL taze planari su verin, böylece kuyular arasında eşitlik sağlanır.

3. Enfeksiyon kurulumu

1. Aşılamayı hazırlayın (örnek hesaplama için Ek Dosya 1'e bakınız)
   1. Aseptik teknikle, plakayı kullanıcıya doğru eğileyerek 6 kuyu plakadan tüm suyu nazikçe çıkarın.
   2. Her kuyuya hesaplanan planarial su hacmini ekleyin.
      NOT: Hayvanların kurumasını önlemek için birer birer ilerleyin.
   3. Her kuyuya hesaplanan C. albicans kültürü hacmini ekleyin.
      NOT: Hayvanları uzun süre havaya maruz bırakmaktan kaçının, çünkü kurutma strese yol açabilir ve enfeksiyon sonuçlarını değiştirebilir.
2. Deneysel plaka kuluçka koşulları
   1. Aşılanmış 6 kuyu plakasını oda sıcaklığında karanlık, statik bir yere yerleştirin.
   2. Çapraz kontaminasyonu önlemek için deneysel plakaları enfekte olmamış planari kolonilerden ayrı bir alanda tutun.
   3. Aşı tarihi ve saatini kaydedin (saat 0 olarak belirtilmiştir).
      NOT: Yoğun trafik veya titreşim eğilimli alanlardan (örneğin, çekmeceler, alet yüzeyleri veya yoğun tezgahlar) kaçının, çünkü hareket hayvanları strese sokabilir ve sonuçları karıştırabilir.
   4. Planarianları C. albicans ile istenen uç noktaya bağlı olarak 72 saate kadar kuluçka edin.
3. Mantar hücrelerinin yeniden süspansiyonu
   1. Her zaman noktasında, yerleşmiş C. albicans hücrelerini planaryaları rahatsız etmeden nazikçe yeniden askıya alın.
      NOT: Enfeksiyon sonrası zaman (saat [h] veya günler [d]), ilk maruziyetten (zaman 0) geçen zamanı ifade eder.
   2. Enfeksiyon sonrası 24 saat (hpi)
      1. Steril 3 mL transfer pipeti kullanarak, plakayı kullanıcıya doğru hafifçe eğin.
      2. Planari suyu aspire edin ve hayvansız bir kuyu bölgesine nazikçe dağıtarak yerleşmiş mantar tabakasını karıştırın.
      3. Bu adımı her kuyu başına 5–10 kez tekrarlayın; yerleşmiş mantar tabakası parçalanarak planarilerle doğrudan temas kurulmadan.
      4. Yeniden asma adımlarından önce ve sonra en iyi görünürlük için mantar yerleşimini karanlık bir arka planda gözlemleyin.
      5. Enfekte olmamış kontrol kuyularını aynı koşullarda yeniden askıya alın.
   3. 48 hpi
      1. Yukarıda açıklanan yeniden askıya alma prosedürünü tekrarlayın.
      2. Tüm yeniden askıya alma adımlarını belirlenen zaman noktasından ± 1 saat içinde gerçekleştirin.
4. Pozlama sonu (72 hpi)
   1. 72 hpi'de, planarileri nazikçe her kuyu başına 2 mL taze planari su içeren yeni 6 kuyulu bir plakaya aktarın.
   2. Mantar kültürünün transferini en aza indirmek için mümkün olan en az sıvı hacmi kullanılır.
   3. Hayvanlar nakledildikten sonra tüm suyu çıkarın ve yerine taze planari su verin.
      NOT: Mekanik yaralanma veya ek stres önlemek için hayvanları ve doku parçalarını nazikçe ele alın.

4. Ev sahibi uç noktası değerlendirmesi

1. Ev sahibi sonuçlarının kaydedilmesi
   1. Enfeksiyon sonrası 1 gün (dpi) içinde konak sonuçlarını değerlendirmeye başlayın ve istenen deneysel son noktaya kadar günlük olarak devam edin.
   2. Standart 0–3 puanlama sistemiyle konak hasarını nicelikle ölçin (Şekil 2).
      Skor 0: Enfekte olmamış kontrollerden (sağlıklı, semptomat) değişiklik yok.
      Puan 1: Hafif semptomlar.
      Puan 2: Şiddetli semptomlar(lar).
      Puan 3: Ölüm.
2. Konak semptomu değerlendirmesi için kriterler
   1. Puan 0 (Semptomatik):
      1. Enfekte olmamış kontrollere kıyasla gözlemlenebilir değişiklik olmayan, normal morfoloji, pigmentasyon, davranış ve tepki gösteren hayvanları tespit edin.
   2. Puan 1 (Hafif):
      Aşağıdaki semptomlardan en az biri asemptomatik kontrollere göre gözlemlendiğinde hafif bir skor verin.
      1. Azalmış hareket hızı veya anormal kayma davranışı.
      2. Fototaktik yanıtın kısmi veya tamamen kaybı.
      3. Sürekli veya tekrarlayan vücut kasılmaları.
      4. Anormal veya düzensiz pigmentasyon (açık veya koyu bölgeler).
      5. Baş veya kuyruk dokusunun gerilenmesi.
   3. Puan 2 (Ciddi):
      Hayvanlar hayatta kalırken, aşağıdaki semptomlardan biri veya birkaçının mevcut olduğu durumlarda ciddi bir puan verin.
      1. Göz filmi veya bir ya da her iki gözün kaybı.
      2. Tam kafa kaybı veya belirgin ön doku hasarı.
      3. Pre-faringeal bölgede büyük doku kaybı.
      4. Birden fazla vücut bölgesine parçalanma (cephalic, faringeal veya arka segmentler).
      5. Mukus salgısı veya iç sızıntı olan ya da olmayan açık yaralar.
      6. Kısmi doku lizisi yapısal bütünlüğün kaybına yol açar.
      7. "C şeklinde" vücut duruşu, felç veya şiddetli hareketlilik bozuklukları.
   4. Puan 3 (Ölüm):
      Aşağıdaki kriterlerden biri veya birkaçına göre ölümleri belirleyin.
      1. Tam doku veya tüm hayvan lizisi.
      2. Uyarılara karşı tamamen yanıt kaybı.
      3. İyilaşamama veya yenilenmeme.
         NOT: Şekil 2, her skor için tutarlı konak fenotipi sınıflandırması için temsil eden görüntüler ve tanımlayıcı özellikler sunar.

5. Mantar maruziyetinden sonra konak hayatta kalma süresinin belirlenmesi

1. 3 dpi'da, planarileri nazikçe her kuyu başına 2 mL taze planari su içeren yeni 6 kuyu plakasına aktarın; böylece kalıntı mantar kültürünün transferini önleyin.
2. Hayvanları ışık mikroskobu ile gözlemleyin (≥ 10x nesnel).
3. Ek Dosya 2'de sağlanan standart puanlama tablosunu kullanarak ev sahibi sonuçlarını kaydedin.
4. Canlı hayvanların belirlenmesi
   1. Canlı hayvanları aşağıdaki kriterlerden biri veya birkaçına göre tanımlayın.
      1. Negatif fototaksi.
      2. Nazik transfer pipet bozulmasına tepki.
      3. Sağlam vücut yapısı.
      4. Plakaya sabit bir tutunma.
5. Ölü hayvanların belirlenmesi
   1. Ölü hayvanları aşağıdaki kriterlerden biri veya birkaçına göre tanımlayın.
      1. Tam lizis veya parçalanma (sadece kalıntı kalıntılar).
      2. Şeffaf veya içüstü çıkarılmış vücut.
      3. Hareket eksikliği veya uyaranlara yanıt vermemek.
      4. Yenilenme başarısızlığı (blastema oluşumunun olmaması).
6. Ölü hayvanların kaldırılması
   1. Ölü hayvanları ve döküntüleri ancak mikroskopi altında yaşatılabilir olmadığı doğrulandıktan sonra çıkarabilirsiniz.
   2. KRİTİK ADIM: Çapraz bulaşma veya değişen hayatta kalma ölçümlerini önlemek için ölü hayvanları derhal çıkarın.
   3. Eğer kalıntı veya mantar kalmışsa, hayatta kalan hayvanları tekrar temiz planari su içeren taze bir plakaya aktarın; böylece C. albicans'ın yeniden tohumlanmasını veya biyofilm oluşumunu önleyin.
      NOT: Görsel inceleme sırasında kontrastı artırmak ve fenotip değerlendirmesini kolaylaştırmak için 6-kuyu plakaları koyu bir zemin üzerine yerleştirin.

6. Mantar yükü değerlendirmesi

1. Koloni oluşturan birim (CFU) niceliklendirmesi
   1. İstenilen enfeksiyon zaman noktalarında planariler (her durumda günde 5–10 hayvan) toplayın. Eşleştirilmiş enfekte olmayan/sahte kontroller ve vahşi tip enfekte kontroller ekleyin.
   2. Kuyrukları 2 mL taze planar suyla iki kez nazikçe durulayarak arka plan C. albicans hücrelerini çıkarın.
   3. Planaryaları steril ve etiketlenmiş 1.7 mL veya 5.0 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve tüm kalan suyu çıkarın.
   4. Her tüpte 300 μL taze planari su ekleyin.
   5. Hayvanları steril bir tokmakla homojenleştirin, büyük parçalar kalmayınca (yaklaşık 30–45 saniye).
   6. Homojenatın seri seyreltmelerini gerçekleştirin (örneğin, 1:10, 1:100, 1:1000).
   7. Her seyreltmeden 100–200 μL levha YPD agar plakalarına yerleştirilir ve 50 μg/mL ampisilin, rifampisin, streptomisin ve neomisin ile takviye edilir. Steril cam boncuklar veya steril hücre yayıcı ile eşit şekilde yayın.
   8. Plakaların kaplamadan sonra 5–10 dakika boyunca masada dik kalmasına izin verin; böylece sıvının agar'a emilmesi sağlanır.
   9. Her seyreltme ve durum için üçlü plakalar hazırlayın.
   10. Plakaları 30 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
   11. CFU'ları sayın ve seyrelme faktörü ile çarpın.
   12. CFU değerlerini planari sayısına normalize ederek her koşul başına planari başına ortalama CFU hesaplanın. Örneğin, 5 hayvandan oluşan homojenattan 100 koloni 10× seyreltme ile gözlemlenirse, hesaplanan değer hayvan başına 200 CFU'dur.

7. İmmünofluoresans anti-kandida boyama

1. Genel boyama değerlendirmeleri
   1. Tüm adımları oda sıcaklığında hafif yörüngesel sallanma (100–140 rpm) ile yap, aksi belirtilmedikçe. Antikor detayları ve reaktif kaynakları için Ek Dosya 1'e bakınız.
      DIKKAT: Formaldehit, sodyum dodesil sülfat (SDS) ve hidrojen peroksit tehlikeli kimyasallardır ve kurumsal güvenlik düzenlemelerine uygun olarak ele alınmalıdır. Formaldehit zehirlidir ve kanserojen olarak sınıflandırılır; SDS bir tahriş edicidir; Ve hidrojen peroksit, yanıklara neden olabilecek güçlü bir oksitleyicidir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin (laboratuvar önlüğü, nitril eldivenler, kapalı burunlu ayakkabılar ve koruyucu gözlük). Sertifikalı kimyasal buhar kapasosunda uçucu reaktiflerle ilgili işlemler gerçekleştirmek ve atıkları kurumsal Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine uygun olarak bertaraf etmek.
2. Örnek koleksiyonu
   1. Her deneysel koşuldan ve zaman noktasından hayvanları toplayın.
   2. Hayvanları, 2 mL planari su içeren etiketlenmiş 20 mL scintillasyon şişelerine aktarın.
   3. Tüm sıvıyı çıkarın, bir kez 2 ml taze planari su ile durulayın, sonra tekrar tamamen sıvı.
3. Fiksasyon ve permeabilizasyon
   1. %7,5 N-asetilsistein (NAC) içinde 1× PBS'de 3 dakika boyunca hayvanları kurban edin.
   2. Çözeltiyi çıkarın ve hayvanları %4 formaldehit ile %0,3 PBSTx ile 15 dakika boyunca sabitleyin.
   3. Örnekleri 1× PBS ile iki kez durulayın.
   4. Örnekleri %1 SDS'de 15 dakika boyunca permeabilize edin.
   5. Örnekleri 1× PBS ile üç kez durulayın.
4. Ağartma
   1. Parlak LED ışığı altında 4–12 saat boyunca %6 hidrojen peroksitle 1× PBS içinde çamaşır suyu örnekleri alın.
      NOT: Ağartma işlemi hemen başlayamıyorsa, sabit örnekleri 1× PBS içinde 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayabilir veya örnekleri uzun süreli depolama için %100 metanolde kurutabilirsiniz.
5. Bloklama ve antikor kuluçka
   1. Hayvanları 1× PBS içeren 24 kuyu plakalarına aktarın.
   2. Oda sıcaklığında %2,5 PBS-TB (Triton X-100 ve sığır serum albümini içeren PBS) ile 4 saat veya 4 °C'de 8 saat boyunca spesifik olmayan bağlanmayı bloklayın.
   3. Birincil anti-Candida antikoru (1:500 PBS-TB) ile örnekleri oda sıcaklığında 4 saat veya 4 °C'de 8 saat kuluçka edin.
   4. Birincil antikoru çıkarın ve her 20 dakikada sekiz kez örnekleri %0,3 PBSTx ile (toplamda ~2,5 saat) yıkayın.
   5. Örnekleri Alexa-568 ile konjuge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru (PBS-TB'de 1:800) ile oda sıcaklığında 4 saat veya 4 °C'de 8 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Foto ağartmayı önlemek için örnekleri ışıktan koruyun. Antikor çözeltileri yeniden kullanılabilir.
   6. İkincil antikoru çıkarın ve örnekleri her 20 dakikada sekiz kez %0,3 PBSTx ile yıkayın.
6. Isteğe bağlı sürgü montajı
   1. Hayvanları mikroskop slaytına tüm hayvanların ön tarafı yukarı doğru konumlandırın.
   2. Fazla suyu transfer pipeti kullanarak çıkarın.
   3. Kağıt havlunun kenarıyla kenarlardan kalan sıvıyı dikkatlice emilin.
   4. Hayvanlar tamamen kapalana kadar 150–175 μL Gelvatol montaj ortamı (Bileşim için Tablo 2 ) damla olarak ekleyin.
   5. Numunenin üzerine dikkatlice bir örtü yerleştirin, hava kabarcıklarından kaçının.
   6. Gelvatol'ün görüntülemeden önce en az 2 saat katılaşmasına izin verin.
   7. Slaytları uzun vadeli koruma için serin ve karanlık bir yerde saklayın.
7. Görüntüleme
   1. Sarı-yeşil uyarıma (~578 nm) kullanılarak görüntü örnekleri alın ve turuncu-kırmızı yayılımı (~603 nm) gözlemleyin.
   2. Tüm hayvan boyama desenlerini görselleştirmek için 2x objektif lens kullanın.

8. Sorun Giderme

1. Enfeksiyon sonuçları tutarsızsa, vahşi tip SN250 veya başka bir baz suş kullanılarak 5–10 ×¹⁰ 7 hücre/mL artışlarla doz-titrasyon eğrisi uygulanır.
2. Her grup başına 5–10 hayvan içeren en az üç biyolojik çoğaltma gerçekleştirin.
3. Çapraz kontaminasyon, aseptik tekniğin başarısızlığı, suş yaşama sorunları veya kötü başlangıç hayvan sağlığı gibi potansiyel sorunları belirlemek için negatif ve pozitif kontrol gruplarını dahil edin.
4. Doz-titrasyon deneyi tamamlandıktan sonra, grup başına medyan hayatta kalma süresini belirlemek için havuz çoğaltmaları yapılır.
5. Mantel–Cox log-rank çiftli analiziyle hayatta kalma farklarını analiz edin.
6. Suşlar veya tedaviler arasındaki ölüm süresi farklarını değerlendirmek için Kaplan–Meier sağkım analizini kullanın.
7. Subletal veya enfeksiyon doz durumlarında, hayatta kalma yerine semptomatik konak sonuçlarını (örneğin, hafif veya şiddetli fenotipler veya mantar kolonizasyonu) analiz edin.
8. Sonraki deneyler için uygun enfeksiyon veya ölümcül doz aralığını belirlemek amacıyla doz grupları arasında konak yanıtlarını karşılaştırın.

Sonuçlar

Planarianların C. albicans ile enfekte edilmesi (Şekil 1) ve konak sonuçlarının sistematik olarak nicelendirilmesi (Şekil 2) güncellenmiş bir protokol sunulmaktadır. Bu geliştirilmiş iş akışı, morbidite (semptomatik hastalık şiddeti), hayatta kalma (ölümcüllük), mantar yükü (CFU'lar) ve patojen kolonizasyonunun mekansal-zaman dinamikleri (floresan immünboyama) dahil olmak üzere birden fazla enfeksiyon parametresinin sağ...

Tartışma

Vahşi tip C. albicans'ın bulaşıcı dozunun değiştirilmesi, S. mediterranea'da tekrarlanabilir, doza bağlı morbidite farklılıkları ortaya çıkarır ve modelin mantar virülansının nicel değerlendirmesine duyarlılığını vurgular. Bu protokol, laboratuvarda bakımı yapılan planari kolonilerde bulaşıcı ve ölümcül dozların temel olarak belirlenmesi için stratejileri ortaya koymakta ve başarılı sistemik enfeksiyonu bekletme yoluyla doğrulamak için kriterler sunar; konak sağlığı pua...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.7 mL mikrosantrifüj tüpleri	VWR/Genemate	490004-436-BOXOF500	Temiz, 500 parçalık kutu
20 mL scintillon şişeleri	Fisher Scientific	12-100-006	Bağışıklık boyama için şeffaf cam şişeler
24 kuyu işlememiş polistiren plakalar	Fisher Scientific	08-772-51	İmmünboyama
5.0 mL mikrosantrifüj tüpleri	Eppendorf/Sigma Aldrich	EP0030119487-200EA	Temiz, 200 parçalık kutu
6 kuyuyla işlenmeyen polistiren plakalar	Fisher Scientific	08-772-49	Enfeksiyon testleri
Agar	VWR	89405-066	YPD ortamı için bakteriyolojik derecesi
Applikatör çubukları	Termo Balıkçı/Püritan	22-029-491	C. albicans kültür
BioRender	BioRender Inc.	Yok	Şematik illüstrasyonlar oluşturmak için kullanılan şekil tasarım yazılımı
Kalsiyum klorür (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5080-500G	Planari su/1x Montjuï C tuzları
Candida albicans poliklonal antikor anti-tavşan, IgG	Thermo Fisher	PA1-27158	İmmünboyama
Santrifüj tüpleri	VWR	89039-664	C. albicans hasat
Kültür tüpleri borosilikat camı 18x150mm	VWR	47729-583	C. albicans kültür
Küvetler	Fisher Scientific	14-955-127	Kültürlerin optik yoğunluğunu ölçmek için
Dekstroz (D-glikoz)	Fisher Scientific	D16-3	YPD ortamı
Gliserol	Fisher Scientific	G33-4	Moleküler biyoloji derecesi, C. albicans 'nin kriyojenik depolanması için takviye olarak değerlendirilir;
Grafik ve veri görselleştirme aracı	GraphPad/Prism		İstatistiksel yazılım ve vizualizasyon aracı. Verison 10.6.1.
Grafik aracı	R		İstatistiksel yazılım. Verison 4.4.3.
Kuluçka Makinesi Shaker	Eppendorf	EPM1282-0004-1EA	New Brunswick Innova 44/44R for C. albicans kültür
Magnezyum klorür (MgCl2)	Sigma	M8266-100G	Planari sular için  (1 kez Montju ï c tuzları)
Magnezyum sülfat (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M7506-500G	Planari sular için  (1 kez Montju ï c tuzları)
Mikroskop Slaytları	VWR	16004-368
Çok zoomlu mikroskop	Nikon		Nikon AZ100
N-Asetil-L-sistein	Sigma Aldrich	A7250-50G	Mukolitik ve kurban reaktif  Takıntı
Paramaldehit, %16 çözelti yöntem, moleküler biyoloji derecesi	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710	Fiksatif reaktif
Pellet Pestle Kablosuz Motor	Fisher Scientific	12-141-361	Planarist homojenleşme
Pepton, bakteriyolojik derecesi	HIMEDIA/VWR	89129-480	YPD ortamı
Pestles	Fisher Scientific	12-141-368	Planarial homojenizasyon için RNase-free tek kullanımlık pelet
Petri Kabları, 100 x 15 mm	VWR	25384-342
Poli (vinil alkol)	Sigma-Aldrich	P-8136	Gelvatol için
Potasyum klorür (KCl)	Sigma Yaşam Bilimleri	P9541-500G	Planari ortam/su/nbsp; (1 kez Montju ï c tuzları)
İkincil Antikor Keçi Anti-Tavşanı, IgG, Alexa Fluor 568	Fisher Scientific	A-11011	İmmünboyama
SN250	Mantar Genetiği Stok Merkezi		Vahşi tip C. albicans suş (https://www.fgsc.net/)
Sodyum Azid	Fisher Scientific	S227-100	Gelvatol için
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG	Planari ortam/su/nbsp; (1 kez Montju ï c tuzları)
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma Yaşam Bilimleri	S3014-500G	Planari ortam/su/nbsp; (1 kez Montju ï c tuzları)
Spektrofotometre	Çevik	26354	Optik yoğunluğu ölçmek için BioTek Epoch 2 Mikroplaka
Statik Kuluçka Makinesi	Fisher Scientific	15-015-2634	C. albicans kültür
Transfer pipetleri	Fisher Scientific	13-711-9CM	Planaryaları transfer etmek için steril, tek kullanımlık kademeli pippetler
Tris Üssü	Sigma-Aldrich	252859	Gelvatol için
Maya ekstraktı	Thermo Fisher	212750	YPD ortamı