Yöntem makalesi

Eimeria Parazitlerinde Rastgele Transgen Entegrasyonu ve İfadesinin Doğrulanması

DOI:

10.3791/70509

⸱

5 Haziran 2026

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis of Ministry of Agriculture, National Animal Protozoa Laboratory & College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, 2College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, transgenik Eimeria parazitlerinde yabancı genlerin entegrasyonu ve ekspresyonunu doğrulamak için standartlaştırılmış bir yöntem sunuyoruz. Genomik ve protein düzeyindeki analizlerin entegre edilmesiyle, bu iş akışı kararlı gen eklenmesi ve ifadesini doğrular. Bu yaklaşım, araştırma ve aşı uygulamaları için transgenik Eimeria'nın geliştirilmesini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgenik Eimeria parazitlerinin doğrulanması, kararlı genomik entegrasyon ve dışdışı genlerin ifadesini doğrulamak için gereklidir. Bu protokol, Eimeria tenella'da transgen yerleştirme ve protein ekspresyonunun doğrulanması için kapsamlı bir iş akışını tanımlar. İşlem, sporülasyonlu oocystlerden genomik DNA çıkarımı ile başlar, ardından hedef parçanın varlığını önceden doğrulamak için PCR amplifikasyonu yapılır. Genomik entegrasyonu daha da doğrulamak için, yerleştirme noktalarını belirlemek ve parazit genomundaki entegre yapının kararlılığını değerlendirmek amacıyla tam genom yeniden dizileme yapılır. Protein ekspresyonu, daha sonra saflaştırılmış sporozoitlerden hazırlanan lizatların Western blottingi ile incelenir ve hedef rekombinant proteinin tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, enfekte konak hücreleri kullanılarak dolaylı immünoflüoresans testi (IFA) ile hücre içi lokalizasyon görselleştirilir. Bu testler birlikte, transgenik Eimeria hatlarının doğrulanması için sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar. Bu iş akışı, genomik entegrasyon ve protein ifadesinin güvenilir şekilde doğrulanmasını sağlar ve böylece genetik manipülasyon, fonksiyonel genomik ve Eimeria parazitlerini hedefleyen aşı geliştirme alanlarında sonraki uygulamaları destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eimeria türleri tarafından neden olan koksidiyoz, kümes hayvanlarında en ekonomik açıdan önemli parazitik hastalıklardan birini temsil eder; bu hastalık kilo alımının azalmasına, kötü yem dönüşümüne ve her yıl milyarlarca dolar tahmin edilen küresel finansal kayıplarayol açmaktadır 1,2,3. Eimeria parazitlerinin genetik manipülasyonu, hem temel araştırma hem de aşı geliştirme için güçlü bir araçhaline gelmiştir 4,5,6. Stabil transfeksiyon, floresan raporlayıcılar veya koruyucu antijenler gibi dıştan genlerin entegrasyonunu ve ekspresyonunu sağlar; böylece parazit gelişiminin gerçek zamanlı görselleştirilmesini ve aşıadayları 7,8,9'un hedefli değerlendirilmesini sağlar.

Duan ve ark. tarafından daha önce yapılan bir yayın, transgenik Eimeria'nın nükleofeksiyonu ve in vivo yayımı için standartlaştırılmış bir protokol sağlamış, rekombinant parazit hatlarının üretimi ve zenginleştirilmesi için verimli bir yöntemoluşturmuştur 10. Ancak, stabil genomik entegrasyon ve transgenlerin fonksiyonel ifadesini doğrulamak için şu anda birleşik bir iş akışı yoktur. Bu tür doğrulamalar, sonraki biyolojik çalışmalar veya aşı uygulamaları için kullanılan transgenik çizgilerin gerçekliğini, kararlılığını ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için kritiktir.

Bu makale, Eimeria tenella'da transgen entegrasyonu ve ekspresyonunun doğrulanması için eksik, adım adım bir protokolü sunmaktadır; bu, enfeksif bursal hastalık virüsü (IBDV) VP2 antijenini (Et-VP2) model11 olarak ifade eden transgenik E. tenella hattı kullanmaktadır. VP2 genini ve bir mCherry muhabirini taşıyan p5′AMic2linkerVP2m3′A ekspresyon plazmidi vahşi E. tenella sporozoitlerine (Et-WT) aktarıldı. Kırmızı floresan oosistler, floresansla aktiflenen hücre ayırma (FACS) ile izole edildi ve koksidyasız tavuklarda seri geçiş yaptı. Bu iş akışı, genomik DNA ekstraksiyonu, PCR tabanlı ön entegrasyon analizi, yerleştirme noktalarını belirlemek için tam genom dizileme, protein ifadesini doğrulamak için Western blotlama ve rekombinant proteinin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek için dolaylı immünoflüoresans testi (IFA) prosedürlerini gösterir. Bu yöntemler birlikte, transgenik Eimeria hatlarının orijinalliğini doğrulamak için tekrarlanabilir ve kapsamlı bir çerçeve sunar ve fonksiyonel genomik araştırmaları ile aşı geliştirmede güvenilir şekilde kullanılmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tavuklarla ilgili tüm hayvan deneyleri, Çin Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: CAU20160628-2). Tüm hayvancılık ve deneysel işlemler, Çin Tarım Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve Hayvanları İlgilendiren Biyomedikal Araştırmalar için Uluslararası Rehber İlkelere uygun oldu. Bu çalışmada yedi günlük erkek, patojensiz (SPF) White Leghorn tavukları kullanıldı. Kuşlar, deney dönemi boyunca serbest beslenme ve suya erişimle standart hayvancılık koşullarında beslendi. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Eimeria türlerinin sporülasyonlu oosistlerinden genomik DNA çıkarılması.

  1. 1 mL bir oocyst süspansiyonu (≥1 × 107/mL) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oosist peletine karşılık gelen 1 mm cam boncuklardan eşit hacim ekleyin. Oocystleri doku homojenizatörü ile 60 Hz'de 5 dakika boyunca şiddetli boncuk döyerek bozun, ta ki oosist duvarları tamamen kırıldı ve içeriği salınana kadar.
  2. Karışımı (cam boncuklar hariç) yeni bir tüpte toplayın ve 12.000 x g sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst maddeyi atıp 500 μL CTAB tamponu ve 40 μL proteinaz K ekleyin ve karışımı 60 °C'de 30 dakika kuluçka edin.
  3. 500 μL fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1), vortex 10 saniye ve 12.000 x g ile 5 dakika santrifüj ekleyin. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
    NOT: Organik tabakayı içeren tüpü sıkıca kapatıp atarak çevrenin kirlenmesini önleyin. (İsteğe bağlı) Protein kirliliği yüksek kalırsa, 1.3 1–2 kez daha tekrarlayın.
  4. 500 μL kloroform: isoamil alkol (24:1), vortex 10 saniye ve 12.000 x g ile 5 dakika santrifüj ekleyin. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin. DNA çökeltmeleri ortaya çıkana kadar ters çevirerek karıştırın.
    NOT: −20 °C sıcaklıkta ≥1 saat veya gece yağış, verimi artırır.
  5. 12.000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve pelet DNA'sı alın. Pelleti %70 etanol ile yıkayın, 12.000 x g sıcaklığında 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Kalan sıvıyı vakum pompasıyla dikkatlice çıkarın ve peleti oda sıcaklığında veya 37 °C'de hava kurutmasında kurutun.
  6. Kurutulmuş DNA pelletini RNaz içeren ddH2O veya TE tamponunda çözür. Kalıntı RNA'yı almak için 37 °C'de ≥1 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın. Saflaştırılmış DNA'yı −20 °C'de depolayın.
    NOT: Uzun vadeli koruma için, çözünmemiş DNA pelletleri doğrudan −20 °C veya −80 °C'de depolanabilir. Sonraki uygulamalardan önce agaroz jel elektroforezi ile DNA bütünlüğünü ve konsantrasyonunu değerlendirin.

2. Parazit genomunda Et-VP2 yapısının varlığının PCR doğrulaması

  1. Et-VP2 yapısının genomik entegrasyonunu doğrulamak için primer çiftleri tasarlayacak (Tablo 1).
    NOT: Astarlar Primer-BLAST kullanılarak tasarlanmış, tipik parametreler 18–24 bp primer uzunluğu, yaklaşık 55–60 °C erime sıcaklığı ve minimum ikincil yapı oluşumu olmuştur. Her primer çiftinin özgüllüğü, özgün olmayan amplifikasyonu önlemek için Eimeria tenella genomuna karşı ayrıca kontrol edildi.
  2. 25 μL 2× Taq Master Karışımı, 21 μL ddH₂O, 1 μL ileri ve geri primer ve 2 μL DNA şablonu içeren 50 μL reaksiyon karışımı hazırlayın.
  3. Aşağıdaki termal döngü koşullarıyla amplifikasyon yapılmalıdır: 95 °C'de 5 dakika boyunca başlangıç denatürasyonu; 30 saniye 95 °C, 30 saniye 55 °C ve 1 dakika 72 °C sıcaklık; ardından 72 °C'de 10 dakika boyunca son bir uzatma yapıldı.
    NOT: Tüm reaktiflerin termal döngüden önce iyice karıştığından emin olun. Optimum amplifikasyon verimliliği için yeni hazırlanmış DNA şablonları kullanın.

3. Transgenik parazit hattının yeniden dizilenmesi (Et-VP2)

  1. Örnek gönderimi ve kütüphane oluşturma
    1. Yeni nesil yeniden dizileme analizi için ticari bir dizim servis sağlayıcısına 1 mL oocyst süspansiyonu (≥1 × 107/mL) gönderin.
    2. Genomik DNA'nın kalite değerlendirmesinden sonra, ultrason kullanılarak mekanik bozulma ile DNA parçalanın. Parçalanmış DNA'yı arındırın, uç onarımı yapın, 3' uçlara adenin (A) tabanı ekleyin ve dizileme adaptörlerini birleştirin.
    3. İstenilen boyutta DNA parçalarını agaroz jel elektroforezi kullanarak seçin ve PCR amplifikasyonu uygulayarak dizileme kütüphanesini oluşturabilirsiniz.
    4. Inşa edilen kütüphaneyi kalite denetimine tabi tutun. Illumina NovaSeq platformunda 150 bp okuma uzunluğu kullanarak eşleştirilmiş uçlu dizileme gerçekleştirin. Veri doğruluğunu sağlamak için 100× dizileme derinliğini koruyun; en az 6 GB ham veri üretin ve minimum kalite puanı Q20 >90%.
      NOT: Tüm reaktifleri ve DNA örneklerini aseptik tekniklerle ele alın, böylece kontaminasyonu önleyin. Veri analizine geçmeden önce dizileme parametrelerinin gerekli derinlik ve kalite metriklerini karşıladığından emin olun.
  2. Veri analizi
    1. Ham dizileme verilerini Fastp yazılımı (v0.23.2) ile aşağıdaki kriterleregöre filtreleyin: 12:
      1. Adaptör dizilerini kaldırın.
      2. Düşük kalite eşiğini Q20'ye ayarlayın ve düşük kaliteli temellerin toplam okuma süresinin %30'undan fazlasını oluşturduğu okumaları çıkarın.
      3. 50 bp'den kısa okumaları çıkarın.
    2. Kalite kontrollü okumaları Bowtie2 yazılımı (v2.4.5) kullanarak E. tenella referans genomuna (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) hizalayın13. Bir sonraki nesil dizileme verilerinin rastgeleliği, kapsama derinliği ve tekdüzeliği temelinde değerlendirilir.
    3. Dizileme okumalarının transgenik vektör dizisiyle hizalandığından emin olun. T-DNA bölgesini eşlemeyen okumaları kaldırın; böylece bir ucu T-DNA'ya, diğer uç ise E. tenella referans genomuna eşlenir.
    4. Kimerik okumaların dizilerine dayanarak, ToxoDB (sürüm 64) kullanılarak hizalama yaparak potansiyel T-DNA yerleştirme noktalarının spesifik konumunu belirleyin. Mosdepth yazılımı (v0.3.3) kullanarak vektör ile Eimeria genomu arasındaki homolog bölgeler (yani 5′ ve 3′ düzenleyici bölgeler) dizileme derinliğini analiz edin.
    5. Transgenik plazmidin E. tenella genomu içindeki potansiyel entegrasyon noktalarını belirleyin ve bunları adım 2.1'de tanımlanan reaksiyon sistemi kullanarak PCR ile doğrulayın.
      NOT: Veri doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini korumak için analiz boyunca yazılım sürümlerinin ve parametre ayarlarının tutarlı şekilde kullanılmasını sağlayın.

4. Transgenik Eimeria proteinlerinin batı bulaşması

  1. En az 5 × 106 sporozoit içeren bir PBS süspansiyonunu 1.5 mL'lik santrifüj tüpünde topla ve 2500 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Pelleti 100 μL RIPA lizin tamponunda yeniden askıya alın ve 1 saat buzda kuluçka yapın. 20 μL 6× protein yükleme tamponu ekleyin ve karışımı 100 °C'de 10 dakika ısıtın.
  2. SDS-PAGE jellerini 1,5 mm cam plaka kullanarak hazırlayın. Akrilamid konsantrasyonunu hedef proteinin moleküler ağırlığına göre ayarlayın. Polimerizasyon sırasında, ayrıcı jeli damıtılmış su ile örtün, böylece üst üste yığma jeli eklenmezden önce eşit bir yüzey sağlanır.
  3. Lizat 10.000 x g ile 5 dakika boyunca santrifüj edin ve her örnek hattına 40 μL süpernatant yükleyin. 10 μL protein belirteci ayrı bir şerite yüklenin ve kalan koridorları kontrol olarak 40 μL 1× yükleme tamponu ile doldurun.
  4. Elektroforez işlemi 1× boyunca 70 V'da 20 dakika boyunca koştur, ardından 120 V ile 60–90 dakika boyunca boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar uygulanır.
  5. Jeli beklenen protein boyutuna göre çıkarın. PVDF membranını metanolde 1 dakika önceden aktive edin ve transfer sandviçi şu sırayla monte edin: sünger, filtre kağıdı, jel (katot tarafı), PVDF membranı, filtre kağıdı, sünger. Hava kabarcıklarını çıkarın ve proteinleri 70 V'da transfer tamponunda 3 saat boyunca aktarın.
  6. Zarı PBST ile üç kez yıkayın (her biri 5 dakika) ve %5 yağsız sütle 1 saat boyunca oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de blokleyin. Zarı PBST ile iki kez yıkayarak kalan blokaj çözeltisi çıkarılır.
  7. Membranı, antikor tamponunda seyreltilmiş birincil antikorlarla kuluçka yapın: fare poliklonal anti-Flag (1:2000) ve fare monoklonal anti-GAPDH (1:2000). Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de hafif sallayarak gece boyunca kuluçka yapın. Antikor çözeltisini topla ve zarı PBST ile beş kez (her biri 5 dakika) yıkay.
  8. Zarı, HRP ile bağlanmış keçi anti-fare IgG (1:2000) ile oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edin. Membranı PBST ile beş kez yıkayın (her biri 5 dakika).
  9. A ve B çözeltisi eşit hacimde karıştırarak bir ECL substratı hazırlayın. Substratı zara eşit şekilde uygulayın ve kemilyüminsans görüntüleme sistemi kullanarak protein sinyallerini tespit edin.
    NOT: Protein örnekleriyle ilgili tüm adımları buz üzerinde yap, aksi belirtilmedikçe. Metanol ve ECL substratlarını eldiven ve koruyucu gözlük takarak buharlı bir kapsülçü içinde kullanın.

5. Transgenik Eimeria'nın Hücre İçi Dolaylı İmmünoflüoresans Testi (IFA)

  1. Sporozoitlerin kromatografi kolonu kullanılarak arındırılması
    1. Kromatografi kolonunu peristaltik pompaya bağlayın ve akış hızını 50–60 Hz'e ayarlayın. Kolonu damıtılmış su ve glisin çözeltisiyle yıkayın.
    2. DE-52 selüloz süspansiyonu ekleyin ve selüloz yatağı yaklaşık 1 cm yüksekliğe ulaşana kadar sürekli glisin çözeltisi eklenin.
    3. Percoll yöntemiyle saflaştırılan sporozoitleri kolona yükleyin. Glisin çözeltisi kullanılarak 30–40 Hz akış hızını koruyun ve akışı 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    4. Mikroskobik gözlem için damlaları cam bir slayta yerleştirerek eluatı izleyin. Sporozoit tespit edilmediğinde pompayı durdurun. Toplanan fraksiyonu 2.500 x g seviyesinde 5 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atın ve pelleti PBS'de tekrar süsküyle solayın.
      NOT: Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için tüm adımları steril koşullarda yapın. Glisin ve Percoll atıklarını kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf etmelidir.
  2. HFF hücrelerinin sporozoit enfeksiyonu
    1. Tohum 1, HFF hücre monokatmanları içeren 24 kuyu plakalarına10-6 sporozoitleri ×. Penisillin-streptomisin son konsantrasyonu 1× (100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) ekleyin, nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 4–6 saat kuluçka yapın, böylece invaziya izin verin. Medyumu çıkarın, 1 mL PBS ile bir kez yıkayın ve süpernatantı atın.
    2. Cam kapak kapaklarını steril forseps kullanarak dikkatlice kuyulardan çıkarın ve yeni 24 kuyruklu bir plakaya aktarın. Örnekleri 1 mL %4 paraformaldehit ile 30 dakika sabitleyin, bir kez 1 mL PBS ile yıkayın ve süpernatantı atın.
    3. Hücreleri 30 dakika boyunca %0,25 Triton X-100 ile 1 mL ile geçirimlileştirin. 1 mL PBS ile bir kez yıkayın ve süpernatantı atın.
    4. Örnekleri 30 dakika boyunca 1 mL %3 BSA ile bloklayın. 1 mL PBS ile bir kez yıkayın ve süpernatantı atın.
    5. Fare monoklonal anti-Bayrak antikorunu (%3 BSA) ile seyrelt. Sulandırılmış antikordan damlaları sızdırmazlık filmine yerleştirin ve kaplama kapaklarını (hücre tarafı aşağı) damlaların üzerine ters çevirin. Kapak kapaklarını nemlendirilmiş bir odada 37 °C'de 1 saat kuluçka edin. 1 mL PBS ile üç kez yıkayın (her biri 5 dakika).
    6. FITC ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG (1:200) ve Hoechst 33258 (1:100) oranını %3 BSA ile seyreltin. Boyama karışımından damlaları sızdırmazlık filmine koyun ve kapak kapaklarını damlaların üzerine ters çevirin. 37 °C'de nemlendirilmiş bir odada 1 saat kuluçka, ardından 1 mL PBS ile (her biri 5 dakika) beş kez yıkayın.
    7. Kaplama kaymalarını cam bir sürgüye 5 μL antiifade montaj ortamı yerleştirerek monte edin. Coverslip'i (hücre yüzü aşağı) düşürmeye ters çevirin, hava kabarcıklarından kaçının ve kenarları mühürleyin. Monte edilmiş slaytları nemli bir odada 4 °C'de saklayarak görüntüleme yapılana kadar saklanır.
      NOT: Paraformaldehit ve Triton X-100'ü kimyasal bir buhar kapüşonunda eldiven ve göz koruyucu takarak kullanın. Bu prosedürde kullanılan reaktif formülasyonları Tablo 2'de listelenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik PCR analizi, hedef parçanın transgenik parazitlerde varlığını doğrularken, vahşi tip kontrolde karşılık gelen bantlar tespit edilmedi (Şekil 1A). Tam genom yeniden dizilenmesi, linearize plazmidin parazit genomuna istikrarlı şekilde entegre olduğunu gösterdi ve tahmin edilen entegrasyon bölgesi birleşim bölgesi boyunca PCR amplifikasyonuyla doğrulandı (Şekil 1B).

Protein ekspresyonu, Western b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, transgenik E. tenella'da genomik entegrasyonun, protein ekspresyonunun ve hücre içi lokalizasyonunun doğrulanması için kapsamlı bir iş akışı oluşturur. Tek bir teste dayanmak yerine, yaklaşım genomik ve protein düzeyindeki kanıtları birleştirerek transgen yerleştirmesinin hem yapısal olarak doğrulanmasını hem de işlevsel olarak ifade edilmesini sağlar.

Bu protokoldeki birkaç kritik adım, transgenik hatların başarılı doğrulanmasını güçlü ş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Ana Araştırma ve Geliştirme Programı (2023YFD1802400) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Antifade Mounting MediumMCEHYK1042Fotobozulmayı önlemek için floresan montaj maddesi
BSA (3%)BeyotimeST023IFA için blokaj tamponu ve antikor seyreltme tamponu; 30 dakika boyunca oda sıcaklığında blokaj
Kloroform:izoamil alkol (24:1)SigmaC0549Genomik DNA ekstraksiyonu sırasında kalıntı fenolün uzaklaştırılması için reaktif
Coccidia-Serbest TavuklarBoehringer-IngelheimSPFTransgenik türlerin in vivo geçişi ve amplifikasyonu için kullanılır; Etik Kurul tarafından onaylanmıştır (onay numarası: CAU20160628-2)
CTAB (Setiltrimetilamonyum bromür)Merck KGaAH5882Genomik DNA ekstraksiyon tamponunun bileşeni; formülasyon: 3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA, ddH2O ile son hacme ayarlanmıştır
DE-52 SelülozSolarbioC8350Sporozoit saflaştırma için iyon değişim kromatografi ortamı; sırasıyla NaOH, HCl ve damıtılmış su ile işlem gördükten sonra glisin çözeltisi ile dengelenmiştir
ECL Substratı (Çözelti A + Çözelti B)thermofisher32106Kimyasal ışık üreten algılama reaktifi; kullanmadan önce Çözelti A ve B'nin eşit hacimlerini karıştırın
FITC-Konjuge Keçi Anti-Mouse IgGSigmaAP124FIFA için floresan ikincil antikor, seyreltme oranı 1:200
Cam boncuklarSigmaZ250473-1PAK
Glisin ÇözeltisiSigma67419Kromatografi kolonları için dengeleme ve elüsyon tamponu; formülasyon: 0.75 g glisin + 7.9 g NaCl 500 mL damıtılmış suda çözülmüş, pH 7.4-7.6'ya ayarlanmış, otoklavlanmış
Hoechst 33258Sigma94403Nükleer boyama reaktifi, seyreltme oranı 1:100; IFA lokalizasyonu için kullanılır
HRP-Konjuge Keçi Anti-Mouse IgGSigma12-349Western blotting için ikincil antikor, seyreltme oranı 1:2000
Illumina NovaSeq Dizileme PlatformuPersonalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)Sonraki nesil dizileme platformu; çift uçlu dizileme (150 bp okuma uzunluğu), dizileme derinliği 100×, ≥6 GB ham veri (Q20>90%) üretir
Düşük Hızlı SantrifüjBEIJING ERA BEILI CENTRIFUGEDT5-2
Mouse Monoklonal Anti-Flag AntikoruSigmaF1804Birincil antikor, seyreltme oranı 1:200; Flag etiketli füzyon proteininin IFA ile tespiti için kullanılır
Mouse Monoklonal Anti-GAPDH AntikoruSigmaG8795Birincil antikor, seyreltme oranı 1:2000; Western blotting için yükleme kontrolü olarak kullanılır
Yağsız Süt (5%)BeyotimeP0216Western blotting için blokaj tamponu; oda sıcaklığında 1 saat veya 4°C'de bir gece boyunca blokaj
Paraformaldehit (4%)Merck KGaA30525Hücre fiksasyon solüsyonu; 30 dakika boyunca oda sıcaklığında fiksasyon
PBSSolarbioP1010
Penisilin-Streptomisin (100×)Yeasen60162ES76Hücre kültürü için antibiyotik; mikrobiyal kontaminasyonu inhibe eder
Percoll (DG gradyan stoğu)GE Healthcare17-0891-09
Fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1)Merck KGaA77617Genomik DNA ekstraksiyonu sırasında protein uzaklaştırma için reaktif
Protein Yükleme Tamponu (6×)BeyotimeP0015FProtein elektroforezi yükleme tamponu; formülasyon: 100 mM Tris (pH 6.8), %4 SDS, 2 mM EDTA, %2 gliserol, 6 M üre; kullanmadan önce 50 μL 2 M DTT ve 50 μL %5 bromofenol mavisi ile karıştırın
Proteinaz KMerck KGaA39450-01-6Genomik DNA ekstraksiyonu sırasında protein sindirimi için 10 mL ddH2O içinde 200 mg çözülmüş
PVDF Membranıthermofisher88518Protein transfer membranı; kullanmadan önce 1 dakika boyunca metanol ile aktive edilmiştir
RIPA Lizis TamponuYeasen20101Sporozoit protein ekstraksiyonu için lizis tamponu
RNase AMerck KGaA9001-99-4DNA numunelerinden RNA uzaklaştırılması için kullanılır; 2.5 mL 0.01 mol/L NaAc'de 25 mg çözülmüş, 10-15 dakika boyunca 100°C'de ısıtılmış, 1 mol/L Tris-HCl ile pH 7.4'e ayarlanmış
SDS-PAGE Jel Reaktifleri (Akrilamid, Bis-akrilamid, Tris, SDS, APS, TEMED)Bio101SDS-PAGE jel hazırlığı için reaktifler; akrilamid konsantrasyonu hedef proteinin moleküler ağırlığına göre ayarlanmış
Sodyum taurodeoksikolat hidratSigmaT0875
çözeltisi)
Taq Master Mix (2×)VazymeP112-01/02/03Taq polimeraz, dNTP'ler vb

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saeed, M., et al. Feeding the future: A new potential nutritional impact of Lactiplantibacillus plantarum and its promising interventions in future for poultry industry. Poult Sci. 104, 105130 (2025).
  2. Blake, D. P., et al. Re-calculating the cost of coccidiosis in chickens. Vet Res. 51 (1), 115 (2020).
  3. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Vet Parasitol. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  4. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with yellow fluorescent protein as reporter and the endogenous development of the transgenic parasite. PLoS One. 9 (12), e114188 (2014).
  5. Hanig, S., et al. Chimeric fluorescent reporter as a tool for generation of transgenic Eimeria (Apicomplexa, Coccidia) strains with stage-specific reporter gene expression. Parasitol Int. 61 (3), 391-398 (2012).
  6. Tang, X. M., et al. Transgenic Eimeria tenella as a vaccine vehicle: Expressing TgSAG1 elicits protective immunity against Toxoplasma gondii infections in chickens and mice. Sci Rep. 6, 29379 (2016).
  7. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Mol Biochem Parasitol. 162 (1), 77-86 (2008).
  8. Fatoba, A. J., Adeleke, M. A. Transgenic Eimeria parasite: A potential control strategy for chicken coccidiosis. Acta Trop. 205, 105417 (2020).
  9. Sun, Y. Y., et al. Immunogenicity and protection against infectious bursal disease via a transgenic Eimeria acervulina expressing IBDV VP2-2C3d fusion protein. Vaccine. 64, 127715 (2025).
  10. Duan, C. H., et al. Nucleofection and in vivo propagation of chicken Eimeria parasites. J Vis Exp. (156), e156 (2020).
  11. Liu, Y. H., et al. Construction and identification of transgenic Eimeria tenella expressing IBDV VP2 protein. J Anim Sci Vet Med. 57 (2), 1008-1016 (2026).
  12. Chen, S. F., et al. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  13. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  14. Pedersen, B. S., Quinlan, A. R. Mosdepth: Quick coverage calculation for genomes and exomes. Bioinformatics. 34 (5), 867-868 (2018).
  15. Sun, Y. Y., et al. Dual-copy VP2 expressed with CTA1-DD in transgenic Eimeria acervulina confers partial protection against infectious bursal disease virus. Poult Sci. 105 (2), 106238 (2026).
  16. Guo, Q. B., et al. Oral delivery of Eimeria acervulina transfected sequentially with two copies of the VP2 gene induces immunity against infectious bursal disease virus in chickens. Front Vet Sci. 11, 1367912 (2024).
  17. Zhang, S. X., et al. Establishment of recombinant Eimeria acervulina expressing multi-copies M2e derived from avian influenza virus H9N2. Vaccines (Basel). 9 (7), 791 (2021).
  18. Li, Y. R., et al. Genetic manipulation for the non-model protozoan Eimeria: Advancements, challenges, and future perspective. iScience. 28 (3), 112060 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Transgenic EimeriaGenomic IntegrationProtein ExpressionEimeria TenellaGenomic DNA ExtractionPCR AmplificationWhole Genome ResequencingWestern BlottingImmunofluorescence AssayRecombinant Protein Detection

İlgili makaleler